Kuinka Artemeter parantaa munuaisvaurioita{0}}Osa I

lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Artetether parantaa munuaisvaurioita palauttamalla redox-epätasapainon ja parantamalla mitokondrioiden toimintaa adriamysiininefropatiassa hiirillä

Peng xun Han, et ai

Themunuainenon paljon energiaa vaativa elin, jossa on runsaasti erityisesti mitokondrioitamunuaistenputkimaiset solut. Uudet todisteet viittaavat siihen, että mitokondrioiden toimintahäiriöt, redox-epätasapaino ja munuaisvauriot liittyvät toisiinsa. Artetetherilla on biologisia vaikutuksia kohdentamalla mitokondrioihin, ja sillä on mahdollista terapeuttista arvoamunuainensairaus. Taustalla olevia molekyylimekanismeja ei kuitenkaan ole täysin selvitetty. Tämä tutkimus suoritettiin artemetrin vaikutusten määrittämiseksi adriamysiinin aiheuttamaan nefropatiaan, ja myös mahdollisia mekanismeja tutkittiin. In vivo perustettiin adriamysiininefropatian hiirimalli, ja hiiriä käsiteltiin artemetrilla tai ilman sitä 2 viikon ajan. In vitro NRK-52E-soluja stimuloitiin TGF- 1:lla ja käsiteltiin artemetrilla tai ilman sitä 24 tunnin ajan. Sittenmunuaistenvauriot ja solumuutokset arvioitiin. Tulokset osoittivat, että artemetri vähensi proteiinin erittymistä virtsaan, toi podosyyttimuutoksia, vaimenti patologisia muutoksia ja lievittimunuaistenputkimainen vamma. Artetether alensi myös TGF- 1 mRNA:n ilmentymistasoja, esti tubulusten lisääntymistä, palautti tubulussolujen fenotyypit ja tukahdutti lisääntymiseen liittyviä signalointireittejä. Lisäksi artemetri kunnostettumunuaistenredox-epätasapaino, lisääntynyt mtDNA-kopiomäärä ja parantunut mitokondrioiden toiminta. Yhteenvetona, esitimme alustavat todisteet siitä, että artemetri parantaa munuaisvaurioita palauttamalla redox-epätasapainon ja parantamalla mitokondrioiden toimintaa adriamysiininefropatiassa hiirillä. Artemeter voi olla lupaava aine munuaissairauksien hoidossa.

Krooninenmunuainensairaus(CKD) on tulossa maailmanlaajuiseksi terveystaakkaksi, ja sille on ominaista virtsan poikkeavuudet, morfologiset rakenteen muutokset ja heikentynytmunuaistentoiminto1. On kiireellisesti tutkittava kroonisen taudin patogeneesiä ja kehitettävä tehokkaita lääkkeitä, jotka hidastavat sen etenemistä.

Koska elin, jolla on korkea energiankulutus,munuainenon runsaasti mitokondrioita, erityisestimunuaistenputkimaiset solut. Mitokondrioita pidetään solun voimanlähteenä ja ne osallistuvat moniin soluprosesseihin. Uudet todisteet viittaavat siihen, että mitokondrioiden toimintahäiriöillä on keskeinen roolimunuainen sisääntuomaristo2. Yhteisöpohjaisessa populaatiossa havaittiin negatiivinen yhteys perifeerisen veren mitokondriaalisen DNA:n (mtDNA) kopiomäärän ja mikroalbuminurian esiintyvyyden välillä3. Virtsan erittymisen metabolomiikkatutkimus jamunuaistengeeniekspressioanalyysi paljasti, että sitruunahapposyklin aktiivisuus on heikentynyt CKD-potilailla4. Mitokondriot ovat pääasiallinen rasvahappojen hapettumispaikka. Ihmis- ja hiirimalleissa, joilla oli tubulointerstitiaalinen fibroosi, havaittiin viallinen rasvahappohapetus. Rasvahappoaineenvaihdunnan palauttaminen geneettisillä tai farmakologisilla menetelmillä esti merkittävästi munuaisfbroosin etenemistä5.

Oksidatiivinen stressi määritellään epätasapainoksi reaktiivisten happilajien (ROS) muodostumisessa, joka ylittää solujen/kudosten kyvyn puhdistaa tai puhdistaa ne. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että säätelyhäiriötmunuainenredox-tila edistää fibrogeenisia reittejä ja johtaa lopultamunuaistenepäonnistuminen 6. Mitokondriot ovat tärkeä solujen ROS-lähde ja säätelevät redox-tasapainoa yhteistyössä muiden organellien kanssa7. Redox-epätasapaino, mitokondrioiden toimintahäiriöt jamunuainenvahinkoaovat yhteydessä toisiinsa. Näiden tekijöiden taustalla olevat molekyylimekanismit ovat kuitenkin edelleen vaikeaselkoisia.

Artemeter on artemisiniinin johdannainen, jonka biologinen hyötyosuus on parantunut ja jota käytetään laajalti malariahoidossa8,9. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että artemisiniinijohdannaisilla on viruksia, sieniä, syöpää ja diabetesta estäviä vaikutuksia10–15. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että artemetrin biologiset vaikutukset liittyvät mitokondrioiden säätelyyn16–18. Tarkkoja mekanismeja ei kuitenkaan täysin ymmärretä.

Tässä tutkimuksessa tutkimme artemetrin roolia adriamysiininefropatiassa (AN) ja tutkimme taustalla olevia mekanismeja.

Cistancheon hyvämunuainenvahinkoa

Click to Cistanche-uutejauhe munuaisvaurioita varten

Tulokset

Artetether vähensi proteiinin erittymistä virtsaan ja toi podosyyttimuutoksia.

Proteinuria on merkkimunuaistenvahinkoaja riippumaton riskitekijä CKD:n etenemiselle. Kuten kuviossa la esitetään, verrokkiryhmään verrattuna proteiinin erittyminen virtsaan lisääntyi merkittävästi AN-ryhmässä ja väheni merkittävästi artemetrikäsittelyllä. Podosyyteillä on tärkeä rooli proteinurian muodostumisessa. Siksi laskimme WT-1-positiivisten solujen lukumäärän (osoitti podosyyttien lukumäärän) ja mitattiin jalkaprosessin leveys (FPW) glomeruluksessa. Tulokset paljastivat, että podosyyttien määrä väheni ja FPW lisääntyi merkittävästi AN-ryhmän hiirillä (kuvio 1b-e). Artemeter-hoito ilmeisesti toi nämä podosyyttimuutokset (kuva 1b-e).

Kuva 1. Artemeter vähensi proteiinin erittymistä virtsaan ja palasi podosyyttimuutokset. (a) Virtsaproteiinien erittymisen kvantifiointi ja tilastollinen analyysi eri ryhmissä. n=6 ryhmää kohden. (b) WT-1-positiivisten solujen laskenta glomerulusta kohti kussakin ryhmässä. n=6 ryhmää kohden. (c) FPW:n mittaus eri ryhmissä. n=3 ryhmää kohden. (d) Edustavia kuvia WT-1-immunovärjäyksestä kussakin ryhmässä. Mittakaava, 20 μm. (e) Edustavia TEM-kuvia, joissa näkyy jalkaprosessien morfologisia muutoksia. Mittakaava, 500 nm. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Cistancheon hyvämunuainenvahinkoa

Artemether vaimenti patologisia muutoksia ja munuaistiehyiden vaurioita.

Tämän tutkimuksen lopussa fokaalinen segmentaalinen glomeruloskleroosi (kuvio 2a, j), tubulusvaurio (kuvio 2b, k) ja tubulointerstitiaalinen fibroosi (kuvio 2c, l) olivat merkittäviä AN-ryhmän hiirissä. Artemeter-hoito paransi merkittävästi näitä patologisia vaurioita (kuvat 2a–c, j–l). Tubulusten patologisten muutosten mukaisesti virtsan Kim-1- ja NGAL-tasot, jotka ovat kaksi tubulusvaurion biomarkkeria, nousivat merkittävästi AN-ryhmässä, ja artemetri alensi niitä merkittävästi (kuvio 2d, e). Lisäksi fibroosiin liittyvän mRNA:n (fibronektiini: FN, -sileän lihaksen aktiini: -SMA, kollageenin: COL I ja COL III) tasot nousivat myös merkittävästi AN-ryhmän hiirillä, ja artemetrikäsittely vähensi niitä (kuvat 2f–i). ). Näiden molekulaaristen ja patologisten muutosten mukaisesti artemetri vähensi merkittävästi seerumin kreatiniinin ja BUN:n lisääntymistä AN-ryhmässä (kuvio 9a, b).

Kuva 2. Artemether vaimenti patologisia muutoksia jamunuaistenputkimainen vamma. (a) glomeruloskleroosin, (b) tubulusvaurion ja (c) interstitiaalisen fibroosin arviointi kussakin ryhmässä. Virtsan (d)NGAL- ja (e) Kim{0}}-erityksen kvantifiointi eri ryhmissä. Määrittäminenmunuaisten(f) FN:n, (g) -SMA:n, (h) COL I:n ja (i) COL III:n mRNA:n ilmentymistasot eri ryhmissä qPCR:llä ja normalisoinnilla housekeeping-geeniä -aktiinia vastaan. (j, k) Edustavia kuvia PAS-värjäytymisestä glomeruluille (asteikkopalkki, 20 μm) ja tubuluksille (mittakaavapalkki, 50 μm). (l) Edustavia kuvia Massonin trikromivärjäyksestämunuaistentubulointerstitium. Mittakaava, 50 μm. n=6 ryhmää kohden. *P<0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artemeter esti tubulussolujen lisääntymistä.

Solujen kasvun tilan määrittämiseksimunuainen, suoritimme immunohistokemian soluproliferaatiomarkkereille proliferoivan solun ydinantigeenin (PCNA) ja Ki{0}} suhteen. Tulokset paljastivat, että PCNA- ja Ki-67-positiiviset tubulussolut lisääntyivät merkittävästi AN-ryhmän hiirissä ja vähensivät merkittävästi artemetria (kuvat 3b–e). TGF- 1 on tärkeä solujen lisääntymisen säätelijä. Verrattuna kontrolliryhmän hiiriin TGF- 1-mRNA:n lisääntynyt säätely oli huomattavaamunuaistenkudosta havaittiin AN-ryhmän hiirissä, ja se vähentyi merkittävästi artemetrikäsittelyllä (kuvio 3a).

Kuva 3. Artemether alensi TGF- 1-mRNA:n ilmentymistasoja ja esti tubulusproliferaatiota. (a) Munuaisten TGF- 1 mRNA:n ilmentymistasojen määrittäminen kussakin ryhmässä. (b, c) PCNA- ja Ki-67-positiivisten tubulussolujen laskenta per mm2 eri ryhmissä. (d, e) Edustavia kuvia PCNA- ja Ki-67-immunovärjäyksestä kussakin ryhmässä. Mittakaava, 20 μm. n=6 ryhmää kohden. **P<0.01 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.01 and=""><0.001 versus="">

Artetether palautti tubulussolujen fenotyypin ja tukahdutti proliferaatioon liittyviä signalointireittejä.

Edustavana epiteelin fenotyyppimarkkerina E-kadheriini (fosfo S838 plus S840) väheni merkittävästi AN-ryhmässä ja sitä säätelee artemetri (kuvio 4a, b, f, j). Proliferaatioon liittyvät signaalit Erk1/2, p38 ja S6RP aktivoituivat AN-ryhmän hiirissä ja ne estivät artemetrilla (kuvio 4a, c-e,g-i,k). Suoritimme in vitro -tutkimuksen selvittääksemme, välittikö artemetrin vaikutukset tubulussoluihin TGF- 1. NRK-52E-soluja inkuboitiin 10 ng/ml TGF- 1:n kanssa yhdessä artemetrin kanssa tai ilman sitä 24 tuntia. Verrattuna käsittelemättömään ryhmään TGF- 1 lisäsi merkittävästi solujen elinkelpoisuutta (kuvio 5a) ja indusoi Erk1/2- ja S6RP-aktivaation (kuvio 5b,e,h,c,f,i). Artemetrin samanaikainen inkubaatio annoksesta riippuen vähensi solujen elinkelpoisuutta (kuvio 5a) ja esti Erk1/2:n ja S6RP:n aktivaatiota pitoisuudella 200 µM (kuvio 5b, e, h, c, f, i). TGF- 1-stimulaatio aktivoi hieman p38-signaalia, mutta ei merkittävässä määrin. Artemeter-interventiolla ei myöskään ollut vaikutusta p38-signalointiin (kuvio 5d,g,j).

Kuva 4. Artemetrin vaikutukset tubulussolujen fenotyyppiin ja proliferaatioon liittyviin signalointireitteihin. (a–i) Western blot -nauhat ja pE-kadheriinin (S838 plus S840), E-kadheriinin, p-Erk1/2:n (Tr202/Tyr204), Erk1/2:n, p-p38 MAPK:n (Tr180/Tyr182) kvantitatiivinen analyysi, p38 MAPK, p-S6RP (Ser235/236) ja S6RPmunuainenjokaisessa ryhmässä. (j, k) Edustavia immunohistokemiallisia värjäyskuvia pE-kadheriinista (S838 plus S840) ja p-S6RP:stä (Ser235/236)munuainen. Kuvat osoittivat, että nämä proteiinit ilmentyvät pääasiassa munuaistiehyissä. Mittakaava, 20 μm. n=6 ryhmää kohden. *P<0.05 and=""><0.01 versus="" control;=""><0.05,><0.01 and=""><0.001versus>

Kuva 5. Artemetrin vaikutukset solujen elinkelpoisuuteen ja proliferaatioon liittyviin signalointireitteihin in vitro. (a) Solujen elinkelpoisuus analysoitiin MTT-määrityksellä TGF- 1:lla ja erilaisilla artemetrikonsentraatioilla 24 tunnin käsittelyn jälkeen. n=6 ryhmää kohden. *P < 0.05="" vs.="" tgf-="" 1:0="" plus="" art:="" 0="" ryhmä;=""><0.001 vs.="" tgf-β1:(10+dmso)="" +="" art:="" 0="" group.="" (b–d)="" representative="" western="" blot="" bands="" of="" p-erk1/2="" (tr202/tyr204),="" erk1/2,="" p-s6rp="" (ser235/236),="" s6rp,="" p-p38="" mapk="" (tr180/tyr182),="" and="" p38="" mapk="" after="" treatment="" with="" the="" indicated="" amount="" of="" artemether="" and="" tgf-β1.="" (e–j)="" bar="" graphs="" present="" the="" fold="" change="" of="" these="" proteins="" after="" normalization="" to="" β-actin.="" n="3" per="" group.=""><0.05 versus="" tgf-β1:0+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="">

Cistancheon hyvämunuainenvahinkoa

Artemetrin vaikutukset munuaisten redox-tasapainoon.

Verrattuna kontrolliryhmään redoksiin liittyvät entsyymit, mukaan lukien katalaasi, superoksididismutaasi 2 (SOD2) ja glutationiperoksidaasi 1 (GPX1), vähenivät kaikki merkittävästi AN-ryhmässä ja lisääntyivät merkittävästi artemetrikäsittelyllä (kuvat 6a–d). . Immunohistokemiallinen värjäys paljasti, että nämä entsyymit ilmentyivät pääasiassa munuaistiehyissä ja harvoin glomeruluksissa. Niiden jakautuminen tubuluksiin osoitti myös erityistä kuviota. Katalaasi ilmentyi pääasiassa kortiko-medullaarisessa liitoksessa, SOD2 ilmentyi pääasiassa ydinytimessä ja GPX1 ilmeni pääasiassa aivokuoressa (kuva 6f–h). Redox-epätasapainon mukaisestimunuainen, virtsanH202:n erittyminen lisääntyi merkittävästi AN-ryhmässä, ja artemetri vähensi sitä (kuvio 6e). Artemeter lisäsi mitokondrioiden massaa ja paransi mitokondrioiden toimintaa. AN-ryhmän hiirillä havaittiin jännitteestä riippuvan anionikanavan (VDAC), mitokondrion ulkokalvon translokaasi 20 (TOM20), sytokromi c-oksidaasi IV (COX IV) ja mitokondrioiden transkriptiotekijä A (Tfam) menetys, ja nämä vaikutukset olivat lisääntynyt artemetrikäsittelyllä (kuvat 7a–e). Koska Tfam-proteiinilla on tärkeä rooli mtDNA-kopiolukujen ylläpitämisessä, mittasimme mtDNA-kopiomäärät kussakin ryhmässä. Tfam:n vähentymisen mukaisesti myös mtDNA:n kopiomäärä väheni AN-ryhmässä ja sitä lisäsi artemetri (kuva 7g-l). Lisäksi AN-ryhmässä havaittiin pienempi munuaisten mitokondrioiden H2O2:n vapautumisnopeus, jota nosti artemetrikäsittely (kuvio 7f).

Kuva 6. Artemetrin vaikutukset päällemunuainenredox-tasapaino ja H2O2-eritys virtsaan. (a) Western blot -kuvat, joissa näkyy katalaasi-, SOD2- ja GPX1-munuaisproteiinitasot kussakin ryhmässä. (b – d) Pylväsdiagrammit osoittavat näiden proteiinien kerta-muutoksen -aktiiniksi normalisoinnin jälkeen. n=4 ryhmää kohden. (e) H2O2:n erittyminen virtsaan eri ryhmissä. n=6 ryhmää kohden. (f – h) Edustavia immunovärjäyskuvia munuaisten katalaasista, SOD2:sta ja GPX1:stä kussakin ryhmässä. Mittakaava, 200 μm. *P<0.05 and=""><0.001 versus="" control;=""><0.05 and=""><0.001 versus="">

Artemetherin säätelemä protonivuoto ja AMPK-signalointi.

Tutkiaksemme artemetrin suoraa vaikutusta mitokondrioihin suoritimme mitokondrioiden stressitestin Seahorse XF -analysaattorilla. Verrattuna käsittelemättömään ryhmään TGF- 1-stimulaatio ei vaikuttanut protonivuotoon tai ATP:n tuotantoon (kuvat 8a–c). Sitä vastoin artemetrikäsittely lisäsi merkittävästi protonivuotoa ja vähensi ATP:n tuotantoa (kuvat 8a-c). Kuten kuviossa 8d,e esitetään, AMPK-signaali aktivoitiin artemetrilla. Lisäksi in vivo -tutkimus osoitti, että irrottavan proteiinin (UCP2) mRNA-tasotmunuainenartemetri sääteli niitä merkittävästi (kuvio 8f).

Kuva 8. Artemetrin vaikutukset protonivuotoon ja AMPK-signalointiin. (a) Solujen mitokondrioiden hengitys mitattiin Seahorse XF24 ekstrasellulaarisella virtausanalysaattorilla sen jälkeen, kun soluja oli käsitelty ilmoitetulla määrällä artemetria ja TGF- 1 24 tunnin ajan. (b, c) Pylväsdiagrammit esittävät protonivuodon ja ATP-tuotannon laskennan eri ryhmissä valmistajan protokollan mukaan. n=5 ryhmää kohden. (d, e) Edustavat Western blot -kuvat ja p-AMPK (Tr172) -kertaisen muutoksen kvantitatiivinen analyysi TGF- 1- ja artemetrikäsittelyn jälkeen 24 tunnin ajan. n=3 ryhmää kohden. (f) UCP2:n munuais-mRNA:n ilmentymistaso kussakin ryhmähiirissä normalisoitui kotipitogeenin aktiinia vastaan. n=6 ryhmää kohden. #P<0.05 and=""><0.001 versus="" tgf-β1:10+art:="" 0="" group;=""><0.05 versus="">

Napsauta tästä päästäksesi osaan II

Lähettäjä: 'Artemether parantaamunuainenvahinkoapalauttamalla redox-epätasapainoa ja parantamalla mitokondrioiden toimintaa adriamysiininefropatiassa hiirilläPeng xun Han et al

---Scientifc Reports|(2021) 11:1266