GRP78-yli-ilmentyminen laukaisee PINK1-IP3R-välitteisen neuroprotektiivisen mitofagian osa 2

2.5. Western Blot

Nukutimme rotat syvään Dolethalilla (n=4) 7 dpi:ssä saadaksemme L4–L5-selkäydinsegmenttejä (pituus 5-mm) Western blot -analyysiä varten. Pakastamme näytteet nestetypessä.

Viime vuosina yhä useammat tutkimustulokset ovat osoittaneet, että proteiiniblottauksen ja muistin välillä on läheinen yhteys. Proteiiniblottaus on analyyttinen tekniikka proteiinien ilmentymisen havaitsemiseksi, jota on käytetty laajasti neurotieteen tutkimuksessa.

Hermosolujen välinen yhteys liittyy läheisesti muistin varastointiin. Proteiiniblottauksella voidaan havaita neuronien välinen yhteystila ja pre- ja postsynaptisten proteiinien ilmentyminen, mikä paljastaa edelleen proteiinien tärkeän roolin muistin muodostumisessa ja varastoinnissa.

Tutkimukset ovat osoittaneet, että presynaptisten hermosolujen proteiinien ilmentyminen liittyy läheisesti muistin muodostumiseen ja varastoimiseen. Esimerkiksi oppimis- ja muistiprosessin aikana neuronit muuttavat presynaptisten proteiinien ilmentymistä, ja tämä muutos liittyy uusien muistojen muodostumiseen ja varastoimiseen. Lisäksi joissakin tutkimuksissa on myös havaittu, että muutokset joidenkin proteiinien ilmentymisessä liittyvät hermostoa rappeutuviin sairauksiin, kuten Alzheimerin tautiin.

Siksi proteiiniblottaus voi tarjota syvällisen ymmärryksen hermosolujen välisestä yhteystilasta ja muutoksista sukulaisten proteiinien ilmentymisessä, paljastaen hermosolujen molekyylimekanismin. Tällä on suuri merkitys muistin muodostumismekanismin ja hermoston rappeutumissairauksien tutkimisen kannalta.

Lyhyesti sanottuna proteiiniblottauksen ja muistin välinen suhde osoittaa proteiinien roolin hermosolujen ja muistin tallennuksen välisessä yhteydessä. Tämä antaa uusia ideoita ja ohjeita muistinmuodostuksen ja hermoston rappeutumissairauksien mekanismien tutkimiseen. Edistäkäämme aktiivisesti neurotieteen tutkimusta ja edistäkäämme terveyttä ja pitkäikäisyyttä! Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa merkittävästi muistia, koska sillä on antioksidanttisia, anti-inflammatorisia ja ikääntymistä estäviä vaikutuksia, jotka voivat auttaa vähentämään oksidatiivisia ja tulehdusreaktioita aivoissa ja siten suojelemaan hermoston terveyttä. järjestelmä. Lisäksi Cistanche voi myös edistää hermosolujen kasvua ja korjausta, mikä parantaa hermoverkkojen liitettävyyttä ja toimintaa. Nämä vaikutukset voivat auttaa parantamaan muistia, oppimiskykyä ja ajattelunopeutta ja voivat myös estää kognitiivisten toimintahäiriöiden ja hermoston rappeutumissairauksien esiintymistä.

Napsauta tietää tapoja parantaa aivojen toimintaa

Näytteet säilytettiin tai jatkokäsiteltiin homogenoimalla lyysipuskurissa (20 mM HEPES, pH 7,7, 251 mM sakkaroosia, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA ja proteaasin (Sigma-Aldrich) ja fosfataasin estäjien (Roche, Basel, Swit) sekoitus ) Potter-homogenisaattorilla jäillä.

Lysaattien sentrifugoinnin jälkeen 800 x g:llä 20 minuuttia 4 °C:ssa, keräsimme supernatantin ytimen jälkeisenä fraktiona ja määritimme proteiinit BCAassaylla (Pierce Chemical Co.).

Western blot -testausta varten ladattiin 30 µg L4–L5-segmenttien nukleaarisia jälkeisiä fraktioita kustakin eläimestä 12 % SDS-polyakryyliamidigeeleille suorittaaksemme proteiinien elektroforeettisen erotuksen, mitä seurasi siirto PVDF-kalvolle BioRadcuvette-järjestelmässä 25 mM:ssa. Tris, pH 8,4, 192 mM glysiini, 20 % (v/v) metanolia.

Estimme kalvot 5 % BSA:lla PBS:ssä plus 0,1 % Tween-20 1 tunnin ajan huoneenlämmössä ja inkuboimme sitten 4 ◦C:ssa yön yli primaarisella vasta-aineella: hiiren anti- -aktiini ( 1:10000, SigmaAldrich, hiiren anti-GRP78 (1:500, Sigma-Aldrich), hiiren anti-CV (1:1000, Invitrogen), kanin anti-HSP60 (1:500, vasta-aineet verkossa), hiiren anti-CV NDUFA9 (1:1000, Invitrogen), hiiren anti-OPA1 (1:1000, BD Biosciences), kanin anti-Parkin (1:500, Abcam, Cambridge, UK), hiiren anti-PINK1 (1:500, Abcam), kanin anti-NRF2 (1:500, Abcam), anti-MNF2 (1:500, Abcam), kanin anti-GRP75 (1:500, Abcam).

Useiden pesujen jälkeen kalvoja inkuboitiin 2 tuntia sopivan sekundaarisen vasta-aineen kanssa, joka oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasilla (1:5{5}}00, Vector). Kalvo visualisoitiin käyttämällä kemiluminesenssiseosta 1:1 (0,5 M luminoli, 79,2 mM p-kumaarihappo, 1 M Tris-HCl, pH 8,5) ja (8,8 M vetyperoksidi, 1 M Tris-HCl; pH 8,5) ja kuvat otettiin Gene Genome -laitteella ja analysoitiin Gene Snap and Gene Tools -ohjelmistolla (Syngene).

2.6. In vitro -malli

NSC34-soluja viljeltiin modifioidussa Eaglen mediumissa, jossa on korkea glukoosipitoisuus (DMEM, Biochrom, Cambridge, UK), jota oli täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich), 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 0,5 X penisilliini/streptomysiiniliuosta. (Sigma-Aldrich) ja pidettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ◦C:ssa 5 % CO2:ssa, olennaisesti kuten aiemmin on kuvattu [26].

Neljän päivän soluviljelyn jälkeen väliainetta vaihtamatta NSC34-soluilla oli erilaistunut kaltainen fenotyyppi, jolle oli tunnusomaista pitkien neuriittien läsnäolo. Päivänä 4 soluihin lisättiin lääkkeitä. Tun (Sigma-Aldrich, Missouri, USA) ja EFV (Bristol-Myers Squibb, New York, USA) -liuokset valmistettiin pitoisuutena 10X ja liuotettiin DMEM:iin.

24 tunnin kuluttua arvioitiin solujen elinkykyisyys inkuboimalla soluja 4 mg/ml MTT-liuoksen kanssa 3 tuntia. Muodostuneet siniset formatsaanikiteet liuotettiin DMSO:hon ja absorbanssi 570 nm:ssä mitattiin mikrolevylukijalla (Elx800, Bio-tek, Winooski, VT, USA).

2.7. Nukleofektio

Transfektoimme miljoona solua 2 ug plasmidilla GFP:n, GRP78:n, HAPARKin, hiiren sh-eGFP:n, hiiren sh-PINK1:n (ID 68943, Tebu-bio), hiiren sh-Hspa5:n (ID 14828, Tebu-bio) ja /tai hiiren sh-IP3R (ID 16440, Tebu-bio) käyttäen Amaxa Nucleofector II TM (Lonza, Basel, Sveitsi) ja Nucleofactor V -sarjaa (Lonza) valmistajan suositusten mukaisesti.

Staattista sytometristä analyysiä varten ympäsimme solut {{0}}kuoppalevyyn, joka oli päällystetty 10 % kollageenilla. Viljelyn jälkeen kiinnitimme solut 4-prosenttisella PFA:lla, huuhdeltiin kahdesti PBS:llä ja säilytimme tai lisäsimme sen jälkeen estopuskuria, joka sisälsi PBS:ää 0,3 % (v/v)Triton X-100 ja 10 % naudan sikiön seerumia. 3 päivän soluviljelyn jälkeen lisättiin DMEM:iin liuotettuja lääkkeitä.

Näihin kokeisiin käytimme 1 µM Tun (Sigma-Aldrich), 10 µMCCCP (Sigma-Aldrich), 5 µM CsA (Sigma-Aldrich) tai 10 µM BAPTA-AM (Sigma) -Aldrich). 5 tunnin kuluttua käsittelystä joko kiinnitimme solut immunosytokemiaa varten 4 % PFA:lla tai homogenisoimme ne modifioidussa RIPA-puskurissa (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA , 1 % NP-40, 0,5 % natriumdeoksikolaattia, 0,1 % SDS, proteaasi- ja fosfataasicocktaileja) immunoblottaukseen. Immunohistokemia suoritettiin huuhtelemalla näytteet kahdesti PBS:llä ja inkuboimalla estopuskurilla, joka sisälsi PBSplus 0,3 % (v/v) Triton X-100 ja 10 % naudan sikiön seerumia.

Inkuboitiin seuraavien primääristen vasta-aineiden kanssa: kanin anti-IP3R (1:200, Abcam), hiiren anti-HA (1:2000, Abcam), hiiren anti-GRP78 (1:200, Sigma-Aldrich) ja kanin anti-HSP60 (1:500, Vasta-aineet-online). Elinkelpoisuuden arvioimiseksi MTT:llä yllä kuvatulla tavalla jätimme hoidon 24 tunniksi.

2.8. Mitokondrioiden superoksidituotannon ja ∆ψM:n mittaus

Soluja inkuboitiin 2,5 uM MitoSOX:n kanssa superoksidianalyysiä varten tai 2,5 uMTMRM:n kanssa ∆ψM-analyysiä varten, sekä Molecular Probesista että Invitrogenista hoidon viimeisen 30 minuutin aikana. Fluoresenssi havaittiin IX81 Olympus -mikroskoopilla ja kvantifioitiin käyttämällä staattista sytometriaohjelmistoa.

2.9. Hapenkulutuksen sähkökemiallinen mittaus

Soluja (1 x 106 per 1 ml HBSS:ssä) sekoitettiin kaasutiiviissä kammiossa 37 ◦C:ssa. Mittaukset tehtiin Clark-tyyppisellä O2-elektrodilla (Rank Brothers, Cambridge, UK) ja kirjattiin Dup.18-tiedoilla. hankintalaite (WPI) välittömästi 5-ajoneuvo- tai Tun-käsittelyn jälkeen.

2.10. Mitokondriaalinen ja sytosolinen fraktiointi

Solut homogenisoitiin lyysipuskurissa (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EGTA, 250 mM sakkaroosi ja proteaasien (Sigma-Aldrich) ja fosfataasin estäjien (Roche) sekoitus Potter-homogenisaattorilla jäällä.

Lysaattien sentrifugoinnin jälkeen 2000 x g 5 minuutin ajan, supernatanttia sentrifugoitiin 10 000 x g:llä 12 minuuttia. Supernatanttia pidettiin liukoisena fraktiona (S2) ja se sisältää sytosolisia proteiineja ja mikrosomeja.

Pelletti (P2) oli rikastettu mitokondriofraktio, joka suspendoitiin uudelleen modifioituun RIPA-puskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 1 % NP{{8). }}, 0,5 % natriumdeoksikolaattia, 0,1 % SDS:ää, proteaasi- ja fosfataasicocktaileja) ja proteiinipitoisuus määritettiin BCA-määrityksellä. Näytteet käsiteltiin sitten Western blot -testiä varten.

2.11. Transmissioelektronimikroskoopia

Upotimme selkäytimen L{{0}}L5-segmenttejä (1-mm viipaleita) fiksaatioliuokseen, jossa oli 2 % (w/v) PFA:ta ja 2,5 % (v/v) glutaraldehydiä (EM-luokka) 0,1 M PBS:ssä, pH 7,4, ja asetettiin keinuttavalle alustalle 2 tunniksi, kiinnitettiin sitten 1 % (w/v) PFA:han ja jälkikiinnitettiin 1 % (w/v) osmiumtetroksidilla (TAAB Lab ), joka sisälsi 0,08 % (w/v) kaliumheksasyanoferraattia (Sigma-Aldrich) PBS:ssä 2 tunnin ajan.

Suoritimme neljä pesua deionisoidulla vedellä ja peräkkäisen dehydratoinnin asetonissa. Kaikki toimenpiteet suoritettiin 4 ◦C:ssa, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Upoimme näytteet EPON-hartsiin ja polymeroimme 60 ◦C:ssa 48 tuntia.

Näytteet käsiteltiin puoliohuiden leikkeiden (1 um) saamiseksi Leicaultracut UCT -mikrotomilla, värjättiin 1-prosenttisella (w/v) toluidiinisinisen vesiliuoksella ja tutkittiin valomikroskoopilla MN:illä rikastettujen vatsan sarvialueiden tunnistamiseksi.

Ultraohuet osat (70 nm) leikattiin timanttiveitsellä, asetettiin päällystetyille ristikoille ja vastakkain tavanomaisella uranyyliasetaatti- ja Reynoldsin lyijysitraattiliuoksilla.

Lopuksi tarkkailimme osia transmissioelektronimikroskoopilla (Jeol 1400), joka oli varustettu GatanUltrascan ES1000CCD -kameralla. Valitsimme kolme viipaletta kutakin ehtoa kohti, analysoimme kolme MN:ää leikkausta kohti ja mittasimme ytimien alueita verrattuna MN:n kokonaispinta-alaan ImageJ-työkaluilla.

2.12. Bioinformatiikka ja tilastot

Käytimme varianssianalyysejä (ANOVA) vertaillaksemme arvoja eri koeryhmien välillä tiedoille, jotka täyttivät normaalisuusoletuksen. Ryhmien väliset erot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa, jota seurasi Tukeyn post hoc usean etäisyyden testi tai Studentin t-testi. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin GraphPad Prism5 -ohjelmistolla (n=3–5; p < 0,05 merkitsevyyden osalta).

3. Tulokset

3.1. Teksti

3.1.1. GRP78:n yli-ilmentymisen proteominen analyysi paljasti mitokondriot pääkohteena

Tunnistaaksemme molekyylimekanismit, jotka johtavat GRP78:n yli-ilmentymisen välittämään hermosolujen suojaukseen, suoritimme vertailevan leimattoman proteomisen analyysin tunnistaaksemme sekä kvantitatiiviset että laadulliset erot RA-vammautuneiden eläinten välillä, jotka olivat infektoituneet adenoviruksilla GRP78:n (Ad-GRP78) yli-ilmentymiseen, joka aiemmin todettiin hermostoa suojaavan. MN-soluista tai beeta-galaktosidaasi (Ad-ß-Gal) kontrollina [20].

Seitsemän päivää vamman jälkeistä aikaa (dpi) valittiin analyysille aikaisempien laboratoriossamme tehtyjen tutkimusten mukaan [20,25]. Aikaisemmassa vertailussa distaalisen aksotomian ja iskiashermon ompeleen jälkeisen regeneraation mallin ja degeneratiivisen RA-mallimme välillä havaitsimme, että signalointitapahtumat olivat samanlaisia ​​7 dpi:iin asti, jolloin RA:n jälkeen ilmeni erilaisia ​​pro-degeneratiivisia tapahtumia [20,25].

L4-L5-selkäydinsegmenttien ytimien jälkeisten fraktioiden LC-MS/MS-leimaton analyysi johti 1420 proteiinin tunnistamiseen, joissa oli vähintään kaksi peptidiä proteiinia kohden, kuten aiemmin on raportoitu muissa näytteissä ja tutkimuksissa [25] .

Yhteensä 566 ja 732 proteiinia tai peptidiä muuttui merkittävästi Ad-GRP78:n tai Ad-ß-Gal:n yli-ilmentymisen vuoksi RA-vammautuneissa eläimissä verrattuna RA-vammautuneisiin eläimiin, jotka eivät olleet viruksen tartuttamia (p < 0 .05) (taulukot S1 ja S2).

Vertasimme kumpaakin luetteloa ja havaitsimme, että 220 muuttui yksilöllisesti Ad-GRP78-yli-ilmentymisen vuoksi (taulukko S3). Näiden proteiinien toiminnallinen merkintä DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) -työkalulla antoi meille mahdollisuuden tunnistaa aineiston merkittävimmät biologiset toiminnot (FDR < 0,05) [34,35].

GRP78:n yli-ilmentyminen johti eroihin mitokondrioprosesseihin, toimintaan ja komponentteihin osallistuvien proteiinien tasoissa (taulukko S4A–C, kuva S1A–C). Geeniontologian (GO) termit ja näiden tietojen KEGG-reittien rikastusanalyysi paljastivat, että Ad-GRP78:lla infektoiduissa eläimissä monien mitokondriofunktioita omaavien proteiinien tasot laskivat merkittävästi, mukaan lukien mitokondrioiden ulko- ja sisäpinnan proteiinit, hengityselinten proteiinit, ja matriisiproteiinit.

Vahvistimme proteomisen listan proteiinitasojen erot, kuten GRP75, joka oli ylössäädelty (p < 0.05), ja V:n alayksikkö (CV ), alasäädelty (p=0.03) GRP78-ryhmissä odotetusti (kuvio 1A).

Koko luettelossa eniten alassäänneltyjä olivat 2-oksoglutaraatti/malaatin kantajaproteiini OGC (SCL25A11), MT-ND3 (kasvainsuppressori, joka osallistuu themalaatti-aspartaatti-sukkulaan ja regeneroi NADH-poolin mitokondriomatriisissa mahdollistaakseen kompleksin I-toiminto), kompleksin I NADH-dehydrogenaasialayksikkö 3, gammaaminovoihappoaminotransferaasi ABAT ja kompleksin III ubikinoli-sytokromi C -reduktaasialayksikkö. Sitä vastoin hyvin harvoja proteiineja säädeltiin ylöspäin (kuvio 1B).

Yksi ylössäädelty proteiini oli odotetusti GRP78, ja muut säädellyt proteiinit olivat aminohappokuljettaja EAAT2, joka sijaitsee ensisijaisesti plasmakalvossa ja joskus mitokondrioissa eksitatorisissa synapseissa, ja hydroksiasyyli-CoA-dehydrogenaasi HADHA, joka katalysoi mitokondrion beetan kolmea viimeistä vaihetta. -pitkäketjuisten rasvahappojen hapettuminen.

Laajensimme analyysiä tutkiaksemme, muunnettiinko muita mitokondrioiden ormitokondrioiden toimintaan liittyvien proteiinien proteiineja pois proteomisesta luettelosta toiminnallisen mitokondrioiden vaikutuksen vahvistamiseksi (kuva 1C).

Havaitsimme, että mitokondrioiden konservoitunut dynamiiniin liittyvä optinen GTPaasi-atrofia 1 (OPA1), joka on osallisena fuusiossa [36], oli alentunut (p < 0.1); LONP1, ATP-riippuvainen proteaasi, joka välittää väärin laskostuneiden polypeptidien selektiivistä hajoamista, esitti taipumusta lisääntyä, mutta eroja ei havaittu ubikinonin NDUFA9, transkriptiotekijä NRF2, joka säätelee geenejä, jotka sisältävät antioksidanttivasteelementtejä, tai muun dynamiinin tasoissa. infuusioon liittyvään GTPaasiin, kuten mitofusiini 2:een (MFN2) [36].

Kattava yhteenveto mitokondrioissa löydetyistä muutoksista on esitetty kaaviossa kuviossa 1D. Mitokondrioiden dynamiikka on tärkeä stressivasteiden kannalta, koska vaurioituneet mitokondriot sulautuvat materiaalin vaihtoon, ja mitokondrioiden fissio mahdollistaa vaurioituneiden mitokondrioiden erottelun ja sitä seuraavan mitofagian [37].

Ottaen huomioon, että suurin osa vähentyneistä proteiineista lokalisoituu mitokondrioihin ja mitokondrioiden fuusioaktiivisuuden suhteen ei havaittu mitään selviä muutoksia analysoimalla MFN2:ta ja L/S OPA1 -muotojen suhdetta (kuva 1C), tutkimme mitofagiaan liittyviä markkereita.

Klassisesti mitokondrioiden autofagiasta riippuvainen hajoaminen tapahtuu depolarisaation jälkeen, ja sen laukaisee yleensä lisääntynyt fosfataasin ja tensiinihomologin (PTEN) indusoiman oletetun kinaasi 1:n (PINK1) koko pituinen kertyminen mitokondrioiden ulkokalvolle.

Myöhemmin renkaan välissä oleva E3-ubikitiini-proteiiniligaasi Parkin värvätään merkitsemään depolarisoituneiden mitokondrioiden mitokondrioiden ulkokalvoproteiinia ubikvitylaatiolla [38–41]. Kuvan 2A yläosassa ei näy muutoksia Parkin-tasoissa, mutta RA-vamman tuottama täyspitkä PINK1 pienenee merkittävästi ipsilateraalisessa L4-L5-selkäydinsegmentissä verrattuna kontrolliin 7 dpi:llä. Sitä vastoin GRP78:n yli-ilmentyminen vähensi Parkin-arvoa, mutta kaksinkertaisti PINK1-tasot RA:n jälkeen verrattuna ei-sukuisen proteiinin -Gal kontrolliekspressioon (kuvio 2A, alaosa).

Täyspitkän PINK1:n noususäätely on sopusoinnussa mitofagian induktion kanssa [42], ja Parkinin väheneminen saattaa liittyä pitkälle edenneeseen organellien hajoamiseen, kuten muut mitokondrioiden proteiinit havaitsevat.

Tutkimme edelleen mitokondrioiden ja mikrotubuluksiin liittyvien proteiinien 1A/1B-kevytketju 3 (LC3) -positiivisen puncta-paikannusta, joka on makroautofagian ydinkoneiston avainkomponentti ja välttämätön mitofagian prosessille [43].

Konfokaalimikroskopiaa käyttämällä havaitsimme anti-COX IV:llä leimattujen mitokondrioiden yhteislokalisaation merkittävän lisääntymisen LC3--positiivisen punctan kanssa RA:n jälkeen vain vaurioituneissa MN-soluissa, jotka yliekspressoivat GRP78:aa 7 dpi:ssä (kuva 2B).

Vahvistimme mitofagian olemassaolon tunkeutuneissa MN:issä vain yli-ilmentyessä GRP78:aa analysoimalla näytteitä transmissioelektroniikkamikroskoopilla.

Havaitsimme runsaasti tyhjiöitä, joissa oli nielaisettuja mitokondrioita, mitofagian [37] tunnusmerkkiä, jotka muistuttavat mitofagosomeja, ja useita ERcisternae-soluja läheisessä yhteydessä mitokondrioihin Ad-GRP78-eläinten MN-soluissa, mutta emme havainneet niitä Ad- -Gal RA-vammautuneilla. rotan näytteet 5 dpi:llä (kuva 2C).

Kuva 1. GRP78:n yli-ilmentyminen RA-vaurioituneissa eläimissä kohdistuu mitokondrioproteiineihin. (A) Immunoblot- ja pylväsdiagrammit, jotka osoittavat GRP78-, GRP75- ja CV-proteiinitasojen keskimääräiset taittomuutokset (± SEM) L4-L5-selkäydinsegmenteissä GRP78:ssa vs.

-Gal yli-ilmentävät RA:n vahingoittuneet rotat 7 dpi:llä. Tasot normalisoitiin aktiiniarvoihin (n=4; * p < 0,05 vs. Ad- -Gal, Studentin t-testi). (B) Mitokondrioiden proteiinin laskostumismuutosten histogrammi, joka on saatu proteoomisella analyysillä L4-L5-selkäydinsegmenteistä RA-vaurioituneista eläimistä, jotka yliekspressoivat GRP78:aa verrattuna Ad- -Gal-ryhmään 7 dpi:llä. (C) Immunoblotti- ja pylväsdiagrammit, jotka osoittavat aktiiniin normalisoituneen NDUFA9:n, LONP1:n, NRF2:n, MFN2:n, OPA-1:n keskimääräiset laskosmuutokset (± SEM). (Ei merkittäviä eroja ryhmien välillä. Studentin t-testi). (D) Kaavamaiset mitokondriot, joiden proteiinit ovat muuttuneet GRP78:n yli-ilmentymisestä RA-vammautuneiden eläinten L4-L5-selkäydinsegmenteissä, korostettuina keltaisella (vähennetty) tai sinisellä (lisääntynyt) 7 dpi:ssä.

Kuva 2. Mitofagia moduloituu in vivo RA:n jälkeen rotissa, jotka yliekspressoivat GRP78:aa. (A) Immunoblotit ja vastaavat pylväsdiagrammit proteiinitasojen PINK1- ja PARK-kertymämuutosanalyysille (keskiarvo ± SEM), jotka on normalisoitu aktiinitasoihin, L4-L5-selkäydinsegmenteissä RA-vammautuneiden vs.

ohjaus (ylhäällä) tai Ad{{0}}Gal- ja Ad-GRP78-ryhmistä (alhaalla) 7 dpi:llä. (n=4; * p < 0,05, Opiskelijan t-testi). (B) Vasemmalla, mikrovalokuvat edustavista MN:istä ipsilateraalisessa kohdassa RAvammautuneista eläimistä, jotka saivat intratekaalisen AAVrh10-GFP- tai AAVrh10-GRP78-ryhmien injektion 7 dpi:ssä. Näytteet värjättiin COX IV:lle (punainen) ja LC3:lle (vihreä) ja vastavärjättiin fluoresoivalla Nissl:llä (sininen).

Mittakaavapalkki=10 µm ja digitaalinen zoomaus upotettuina 10X.

Huomaa, että samanaikainen lokalisointi havaitaan vain AAVrh10-GRP78-ryhmässä. Oikealla pylväsdiagrammi, joka näyttää COX IV:n ja LC3:n yhteispaikannuspisteiden prosentuaalisen analyysin. Keskimääräinen ± SEM COX IV:n ja LC3:n rinnakkaispaikannuksesta (n=4; ** p < 0.01, Opiskelijan t-testi). (C) Edustavat transmissioelektronimikroskooppikuvat, joissa mitokondriot erottuvat selkäytimen MN:istä: a, kuva MN-sytoplasmasta, jossa näkyy mitokondrioiden kontrolloimaton eläin; b, kuva MN-sytoplasmasta Ad- -gal-ryhmän RA-vaurioituneesta rottasta; c, kuva MN-sytoplasmasta Ad-GRP78-ryhmän RA-vaurioituneesta rottasta, jossa on joitain mitokondrioita, jotka on merkitty punaisilla tähdillä; d, suuremmalla suurennuksella kuva näkyy (C) osoittaen suuria mitokondrioita ja ER-kontaktia. Mittakaavapalkit on esitetty kuvissa.

Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittasivat siihen, että GRP78:n yli-ilmentyminen voi indusoida mitofagiiinista irronneita MN:itä RA:n jälkeen, ja se voisi edistää hermosolujen suojaamista.

3.1.2. GRP78:n yli-ilmentyminen palauttaa vaurioituneen mitokondriotoiminnan

Tämän jälkeen tutkimme edelleen GRP78:n yli-ilmentymisen vaikutusta mitokondrioiden ER-stressin in vitro -malliin, koska tämä loukkaus ilmaantuu aikaisin RA-vaurion in vivoa jälkeen, joista on raportoitu aiemmin [20,26], ja se on luotettava menetelmä uusien hermostoa suojaavien aineiden seulomiseen [2,44]. ].

Tässä mallissa käytetään tunikamysiiniä (Tun), joka on ER-stressin indusoija, joka aiheuttaa N-asetyyliglukosamiini-lipidivälituotteiden muodostumisen, mikä estää vasta syntetisoitujen proteiinien glykosyloitumisen ja johtaa proteiinien väärinlaskostumiseen. Käytimme sitä, koska pysähtyneen eritysreitin on myös raportoitu olevan avainasemassa RA:n jälkeisessä neurodegeneratiivisessa prosessissa [26].

Vahvistimme ensin, että NSC34-motoneuronin kaltaisten solujen nukleofektio sopivalla vektorilla johti GRP78:n tuotantoon (kuvio 3A). Näissä soluissa GRP78:n ilmentyminen paransi merkittävästi Tunia sisältävää eloonjäämisalustaa (kuvio 3B).

Vaikka Tun-hoito yleensä indusoi itse GRP78:aa, tämä endogeeninen yli-ilmentyminen on melko myöhäistä (24 tunnin kuluttua) (kuva S2). Mietimme myös, voisimmeko määrittää, onko GRP78:n yli-ilmentymisellä hermoja suojaavia vaikutuksia toisessa in vitro -mallissa, jonka aiemmin raportoimme toistavan useita MN-kuoleman ominaisuuksia nivelreumavaurion jälkeen [26].

Tämä malli perustuu nokodatsolin indusoimaan sytoskeletaaliseen vaurioon, joka häiritsee mikrotubulusten polymeroitumista. GRP78:n ilmentyminen lisäsi myös nokodatsolin läsnä ollessa viljeltyjen solujen elinkykyä (kuvio 3B).

Sitten arvioimme mitokondrioiden toiminnan mittaamalla reaktiivisten happilajien (ROS) syntymistä mitokondrioissa käyttämällä MitoSOX:a, mitokondrioiden kalvopotentiaalia (∆ψm) käyttämällä tetrametyylirodamiinimetyyliesteriä (TMRM) ja O2:n kulutusnopeutta ER-stressille altistetuissa NSC34-soluissamme. GRP78-yli-ilmentymisen kanssa tai ilman.

Positiivisena kontrollina käytimme efavirentsia (EFV), mitotoksista ainetta, joka muuttaa kaikkia kolmea parametria [45]. Havaitsimme, että MitoSOX-tasot nousivat asteittain Tun-lisäyksen jälkeen, saavuttaen tilastollisen merkitsevyyden 24 tunnilla ja että ROS:n muodostuminen lisääntyi merkittävästi EFV-käsitellyissä soluissa ensimmäisen tunnin hoidon jälkeen verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin (kuva S3A).

GRP78:n yli-ilmentyminen johti merkittävästi alhaisempiin ROSin-mitokondrioiden tasoihin verrattuna GFP:tä ilmentäviin soluihin 24 tuntia Tun- tai EFV-hoidon jälkeen (kuva 3C). ∆ψm romahti 5 ja 24 tunnin Tun-käsittelyn ja 24 tunnin EFV-hoidon jälkeen (kuva S3B). Tämän parametrin palautus saavutettiin GRP78-yliekspressiolla Tun- tai EFV-käsitellyissä soluissa (kuvio 3D).

O2:n kulutus väheni 80 minuutin analyysin aikana Tun-lisäyksen jälkeen soluissa, jotka ilmentävät GFP:tä (kaltevuus −0.063,R2=0.98), mutta O2:n kulutus oli vakaa GRP78-yli-ilmentävissä soluissa Tunin läsnäolosta huolimatta (kaltevuus −0,221, R2=0.99) (kuva 3E, vasemmalla).

5 tunnin kuluttua hengitys oli normaalia GRP78-yli-ilmentävissä soluissa ja vakavasti vaarantunut GFP:tä ekspressoivissa soluissa (kuva 3E, oikealla). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, että GRP78 heikentää ER-stressin tai mitotoksisuuden aiheuttamaa mitokondrioiden toimintahäiriötä.

For more information:1950477648nn@gmail.com