Neuronaalisen typpioksidisyntaasin ja reniinin ilmentyminen nuorten koirien dysplastisissa munuaisissa

ABSTRAKTI:

Reniini ja hermosolujen typpioksidisyntaasi munuaisissa säätelevät reniini-angiotensiini- ja tubuloglomerulaarisia palautejärjestelmiä. Tässä tutkimuksessa tutkittiin reniinin ja hermosolujen typpioksidisyntaasin ilmentymistädysplastiset munuaisetkolmesta nuoresta koirasta. Reniini-immunoreaktiivisuus, jota esiintyy juxtaglomerulaarisissa ja tubulaarisissa soluissadysplastiset munuaiset, ei eronnut nuorten koirien normaaleista munuaisista. Makula densa -solut normaaleissa munuaisissa osoittivat hermosolujen typpioksidisyntaasi-immunoreaktiivisuutta, mutta dysplastisten munuaisten solut eivät osoittaneet ilmeisiä signaaleja. Tämä havainto voi korreloida sairauden patologisten mekanismien kanssamunuaisten vajaatoimintanuorilla koirilla.

AVAINSANAT: krooninen munuaissairaus, dysplastinen munuainen, immunohistokemia, hermosolujen typpioksidisyntaasi, reniini

Lisätietoja saat ottamalla yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com

cistanche munuaisten toiminnan parantamiseksi

Munuaisten vajaatoimintaesiintyy toisinaan nuorilla koirilla. Tällaisissa tapauksissa histologinen tutkimus osoittaa useindysplastinen munuainenvaurioita. Kuitenkin patofysiologiset mekanismit, joita esiintyydysplastiset munuaisetkoirista jää epäselväksi. Osoitimme äskettäin syklo-oksigenaasin (COX)-2 heikkenemisenkrooniset munuaissairaudetnuorilla koirilladysplastiset munuaisetkäyttämällä immunohistokemiallista analyysiä [19].

COX-2 on indusoituva tulehdusentsyymi, joka on välttämätön munuaisten normaalille kehitykselle sikiön ja vastasyntyneen vaiheissa [12, 15]. Syntymän jälkeen COX-2 ilmentyy konstitutiivisesti munuaisissa ja keskittyy paksujen nousevien raajojen macula densan (MD) rajoitetulle alueelle [1, 4, 22]. MD on erikoistunut alue glomeruluksen vaskulaarisen navan vieressä. Se säätelee reniinin eritystä ja tubuloglomerulaarista palautejärjestelmää (TGF). MD-soluissa ilmentyvä COX-2 säätelee näitä mekanismeja [6, 8]. COX-2:n lisäksi hermosolujen typpioksidisyntaasin (nNOS), joka ilmentyy myös MD-soluissa, tiedetään olevan TGF-järjestelmän pääsäätelijä [3, 18]. Näiden kahden molekyylin, jotka ilmentyvät yhdessä MD:ssä, tiedetään olevan vuorovaikutuksessa toistensa kanssa [2, 5, 9]. Tässä tutkimuksessa tutkimme reniinin ja nNOS:n ilmentymistädysplastiset munuaisetimmunohistokemialla sen määrittämiseksi, onko COX-2 heikentynytdysplastiset munuaisetaiheuttaa reniini-angiotensiinijärjestelmän ja TGF-järjestelmän häiriöitä nuorilla koirilla.

Formaliinikiinnitetyt parafiinilohkotdysplastiset munuaisetnuorten koirien (n{{{{10}}}}), nuorten koirien normaalit munuaiset (n=3) ja aikuisten koirien normaalit munuaiset (n=4) olivat samat kuin edellisessä tutkimuksessamme, jossa kliininen historia ja kudosvalmistelu on kuvattu aiemmin [19]. Tutkimuksen hyväksyi Japanin Kagoshiman yliopiston eläinkokeiden komitea (VM15020). Valmistettiin leikkeitä, joiden paksuus oli 3-µm, ja immunohistokemiallinen analyysi reniinille ja nNOS:lle suoritettiin seuraavien protokollien mukaisesti: (1) deparaffinization; (2) antigeenin talteenotto mikroaaltokuumentamalla 10 mM sitraattipuskurissa (pH 6,0) nNOS:lle; (3) inkubointi 3 prosentin H202:n kanssa 30 minuuttia; (4) salpaus 3 prosentilla naudan seerumialbumiinia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) reniinille tai 0,25 prosentilla kaseiinilla (Sigma-Aldrich) nNOS:lle, laimennettuna fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, 30 minuutin ajan; (5) inkubointi yön yli 4 asteessa kanin antirekombinanttireniinin polyklonaalisen antiseerumin 1:3,000 laimennuksella (toimittaja tohtori Murakami, Tsukuban yliopisto, Japani) tai 1:3,{{31} }} kanin anti-nNOS-polyklonaalisen antiseerumin (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA) laimennus estoliuokseen; (6) inkubointi 30 minuuttia huoneenlämmössä peroksidaasipolymeeriin konjugoidun yleisvasta-aineen kanssa (anti-hiiri-immunoglobuliini (Ig) G ja anti-kanin IgG; yksinkertainen värjäys MAX-PO [MULTI]; Nichirei Biosciences, Tokio, Japani) ; ja (7) immunosignaalin havaitseminen käyttämällä 3,3'-diaminobentsidiinijärjestelmää (3,3'-diaminobentsidiinipuskuritabletti; Merck, Darmstadt, Saksa). Negatiivisia kontrollileikkeitä varten käytettiin normaalia kanin IgG:tä (Lab Vision, Fremont, CA, USA) primaarisen vasta-aineen tilalla.

Reniinin immunoreaktiivisuuden satunnaistettu morfometrinen analyysi suoritettiin aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti [20]. Lyhyesti sanottuna reniiniindeksi määriteltiin reniinipositiivisten arteriolien kokonaismäärän suhteeksi glomerulusten kokonaismäärään ja ilmaistiin 100 glomerulusta kohti. Ryhmien väliset erot analysoitiin käyttämällä Bonferronin moninkertaista vertailumenetelmää SPSS-version 24 kanssa (IBM SPSS Statistics, Armonk, NY, USA).

Picut ja Lewis tekivät histopatologisen diagnoosin koiran munuaisdysplasian mikroskooppisten kriteerien mukaisesti [14]. Kaikkien kolmen tapauksen histologiset osat esittivät asynkronisen erilaistumisen, mikä osoittaa sikiön/epäkypsien glomerulusten leesioiden esiintymisen. Vaikeusasteltaan vaihtelevia toissijaisia ​​muutoksia, kuten tubulusvaurioita, interstitiaalista fibroosia ja skleroottisia glomeruluksia, havaittiin kypsissä munuaiskudoksissa.

Vuonnadysplastiset munuaiset, reniini-immunoreaktiivisuussignaaleja havaittiin juxtaglomerulaarisissa soluissa (JGC) (kuvio 1A), ja tubulaariset solut sijaitsivat distaalisissa nefroneissa (kuvio 1B). Joissakin glomeruluissa muutamat solut osoittivat reniinipositiivisia signaaleja lähellä verisuoninapoja (kuvio 1A). Nuorissa kontrollimunuaisissa reniinisignaaleja havaittiin myös sekä JGC:issä että distaalisissa tubuluksissa, mukaan lukien MD-solut. Aikuisten kontrollimunuaisissa reniinipositiiviset signaalit rajoittuivat JGC:hen. Tilastollisesti reniinipositiivisten alueiden määrä dysplastisissa munuaisissa ei osoittanut merkittäviä eroja nuorten ja aikuisten munuaisten alueiden määrästä.

Reniinituotannon stimuloinnin tiedetään vaikuttavan COX-2-signalointiin, ja aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että plasman reniiniaktiivisuus ja -pitoisuus laskivat COX-2-estäjän annon tai COX-inhibiittorin poistamisen jälkeen. -2 geeni [10, 11]. Kutendysplastiset munuaisetTässä tutkimuksessa tarkastelut eivät osoittaneet munuaisten COX-2 [19] ilmentymistä, reniinin immunosignaalien vähenemistä JGC:issä epäiltiin alun perin mahdollisena fysiologisena poikkeavuutena dysplastisissa munuaisissa. Tämä immunohistokemiallinen analyysi ei kuitenkaan voinut vahvistaa tätä hypoteesia, eikä reniinin ilmeistä vähenemistä ehdotettu JGC:issä. Vaikka tubulaarisen reniinin fysiologista roolia ei ole selvitetty aiemmin, natriumin munuaiskäsittely saattaa olla tubulaarisen reniinin mahdollinen rooli, koska reniinin ilmentymisen voimistuminen indusoitui distaalisessa nefronissa sen jälkeen, kun rotilla oli ruokittu vähäsuolaista ruokavaliota. [16], ja tässä tutkimuksessa tutkittujen koirien dysplastiset munuaiset ovat saattaneet säilyttää tämän tubulaarisen toiminnan.

COX-2 on myös tärkeä TGF-järjestelmän säätelyssä, mikä on tärkeää glomerulusten suodatusnopeuden ylläpitämiseksi. Tutkimus rotilla, jossa käytettiin mikropunktiomenetelmää, osoitti TGF-vasteen suppression COX-2-estäjähoidon jälkeen [2]. TGF-vaste sisäändysplastiset munuaisetsaattaa heiketä munuaisten COX{0}}-ekspression puutteen vuoksi. Asiaankuuluvia löydöksiä ei kuitenkaan ole aiemmin raportoitu. Munuaisissa nNOS ekspressoituu MD-soluissa ja auttaa säätelemään TGF-järjestelmää [18].

Tässä nNOS-analyysissä ei havaittu näkyviä signaaleja kaikkien tapausten MD-alueilla (kuvio 2). Tätä nNOS:n vähenemistä pidettiin etiopatogeenisena tapahtumanadysplastiset munuaiseteikä sen jälkeen hankittumunuaisten vajaatoimintatapauksista. Itse asiassa edellinen tutkimuksemme, jossa käytettiin OLETF (Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty) -rottia tyypin 2 diabeteksen mallina, osoitti, että nNOS oli yli-ilmentynyt MD:ssä ja sen tubulussoluissa diabeettisen nefropatian myöhemmässä vaiheessa [21]. TGF-järjestelmän säätelyssä nNOS:n toiminta on samanlainen ja vuorovaikutuksessa COX-2:n kanssa. Jotkut tutkimukset ovat ehdottaneet, että nNOS sijaitsee ylävirtaan signalointireitistä ja stimuloi COX-2:n ilmentymistä [5, 9]. Toisaalta muut tutkimukset ovat osoittaneet päinvastaista, että COX-2 sijaitsee ylävirtaan silloisesta NOS:sta [2, 13]. Signalointireittien eroista huolimatta nNOS-immunosignaalien puute MD-soluissa voi laukaista munuaisten COX-2-ilmentymisen vaimenemisendysplastiset munuaiset.

Muutamat tubulukset osoittivat positiivisia signaaleja nNOS:lle kahdessa tapauksessa. Muussa tapauksessa monet laajentuneet ja litistyneet tubulukset, luultavasti distaalisessa nefronissa, osoittivat selkeitä positiivisia signaaleja (kuva 3). Tässä tapauksessa näkyvät nNOS-positiiviset tubulukset,

munuaiskudosten kehitys oli kaikkein epäkypsintä. Nuorten ja aikuisten normaaleissa munuaisissa nNOS-positiivisia signaaleja havaittiin paksuissa nousevissa raajoissa, erityisesti MD-soluissa (kuvio 4). nNOS:n jakautuminen muuttuu munuaisten kehityksen aikana. Sikojen kehittyvissä munuaisissa nNOS leviää laajasti, ja sitä havaitaan osissa paksun nousevaa raajaa, joka johtaa makula densaan [17]. Rotilla nNOS:n esiintyminen kehittyvässä distaalisessa tubuluksessa havaitaan jo S-muotoisessa kehossa nefrogeneesin varhaisimmista vaiheista lähtien [7]. Vaikka nNOS:n jakautumista koirien kehittyvissä munuaisissa ei ole tutkittu aiemmin, on mahdollista, että näkyvät nNOS-signaalit tubuluksissa voivat olla osoitus koirien erittäin epäkypsistä tubuluksista.dysplastinen munuainenvaurioituneiden kypsien tubulusten sijaan.

Yhteenvetona voidaan todeta, että reniinin ja nNOS:n ilmentyminendysplastiset munuaisetKolmesta nuoresta koirasta tutkittiin immunohistokemiallisesti tässä tutkimuksessa. Tämä osoitti nNOS:n heikkenemisen MD-soluissa jatkuvalla reniinin ilmentymisellä. nNOS-ilmentymisen väheneminen MD-soluissa voi heikentää munuaisten TGF-järjestelmää, ja tämä voi olla yksi taustalla olevista patologisista mekanismeista.munuaisten vajaatoimintanuorilla koirilladysplastiset munuaiset.

MAHDOLLISET ETURISTIRIIDAT

Tekijöillä ei ole mitään kerrottavaa.

KIITOS

Osaa tästä työstä tuki Japan Society for the Promotion of Science -apuraha tieteelliselle tutkimukselle (apurahanumero 19K06385).

Tekijä

Akira YABUKI1,2)*, Yu FURUSAWA2), Noriaki MIYOSHI3), Kazuyuki TANIGUCHI4)ja Osamu YAMATO1)

1) Laboratory of Veterinary Clinical Pathology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, Kagoshima 890-0065, Japan

2) Kagoshima University Veterinary Teaching Hospital, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, 1-21-24 Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japan

3) Laboratory of Veterinary Histopatology, Joint Faculty of Veterinary Medicine, Kagoshima University, Kagoshima 890-0065, Japan

4) Eläinlääketieteen anatomian laboratorio, maataloustieteellinen tiedekunta, Iwaten yliopisto, Morioka 020-8550, Japani

VIITTEET

1. Adegboyega, PA ja Ololade, O. 2004. Syklo-oksigenaasin -2 immunohistokemiallinen ilmentyminen normaaleissa munuaisissa. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 12: 71-74. [Medline] [CrossRef]

2. Araujo, M. ja Welch, WJ 2009. Syklo-oksigenaasi 2:n esto suppressoi tubuloglomerulaarista palautetta: tromboksaanireseptorien ja typpioksidin roolit. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 296: F790–F794. [Medline] [CrossRef]

3. Blantz, RC, Deng, A., Lortie, M., Munger, K., Vallon, V., Gabbai, FB ja Thomson, SC 2002. Typpioksidin monimutkainen rooli glomerulusten ultrasuodatuksen säätelyssä. Kidney Int. 61: 782-785. [Medline] [CrossRef]

4. Câmpean, V., Theilig, F., Paliege, A., Breyer, M. ja Bachmann, S. 2003. Avainentsyymit munuaisten prostaglandiinien synteesiin: paikkaspesifinen ilmentyminen jyrsijän munuaisissa (rotta, hiiri). Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 285: F19–F32. [Medline] [CrossRef]

5. Cheng, HF, Zhang, MZ ja Harris, RC 2006. Typpioksidi stimuloi syklo-oksigenaasia-2 viljellyissä CTAL-soluissa ap38-riippuvaisen reitin kautta. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 290: F1391–F1397. [Medline] [CrossRef]

6. Deng, A., Wead, LM ja Blantz, RC 2004. Tubuloglomerulaarisen palautteen ajallinen mukautuminen: COX:n vaikutukset-2. Kidney Int. 66: 2348–2353.[Medline] [CrossRef]

7. Fischer, E., Schnermann, J., Briggs, JP, Kriz, W., Ronco, PM ja Bachmann, S. 1995. NO-syntaasin ja reniinin ontogeny rotan munuaisten juxtaglomerulaarisessa laitteessa. Olen. J. Physiol. 268: F1164–F1176. [Medline]

8. Hao, CM ja Breyer, MD 2008. Prostaglandiinien fysiologinen säätely munuaisissa. Annu. Rev. Physiol. 70: 357-377. [Medline] [CrossRef]

9. Ichihara, A., Imig, JD, Inscho, EW ja Navar, LG 1998. Syklo-oksigenaasi-2 osallistuu tubulaarisesta virtauksesta riippuvaiseen afferenttiin arteriolaariseen sävyyn: vuorovaikutus hermosolujen NOS:n kanssa. Olen. J. Physiol. 275: F605–F612. [Medline]

10. Kim, SM, Chen, L., Mizel, D., Huang, YG, Briggs, JP ja Schnermann, J. 2007. Alhainen plasman reniini ja vähentyneet reniinin eritysvasteet akuuteille ärsykkeille tietoisessa COX-2--puutteellisessa hiiret. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F415 F422. [Medline] [CrossRef]

11. Matzdorf, C., Kurtz, A. ja Höcherl, K. 2007. COX-2-aktiivisuus määrittää reniinin ilmentymisen tason, mutta se on välttämätön reniinin ilmentymisen akuutin lisääntymisen kannalta rotan munuaisissa. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 292: F1782–F1790. [Medline] [CrossRef]

12. Norwood, VF, Morham, SG ja Smithies, O. 2000. Munuaisten dysplasian synnytyksen jälkeinen kehitys ja eteneminen syklo-oksigenaasi-2-nollahiirillä. Kidney Int. 58: 2291–2300. [Medline] [CrossRef]

13. Paliege, A., Mizel, D., Medina, C., Pasumarthy, A., Huang, YG, Bachmann, S., Briggs, JP, Schnermann, JB ja Yang, T. 2004. Inhibition of nNOS express in in macula densa COX{2}}johdettu prostaglandiini E2. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 287: F152–F159. [Medline] [CrossRef]

14. Picut, CA ja Lewis, RM 1987. Koiran munuaisdysplasian mikroskooppiset piirteet. Vet. Pathol. 24: 156–163. [Medline] [CrossRef]

15. Seta, F., Chung, AD, Turner, PV, Mewburn, JD, Yu, Y ja Funk, CD 2009. COX-2-hiirten munuais- ja kardiovaskulaarinen karakterisointi. Olen. J. Physiol. Regul. Kokonaisluku. Comp. Physiol. 296: R1751–R1760. [Medline] [CrossRef]

16. Shao, W., Seth, DM, Prieto, MC, Kobori, H. ja Navar, LG 2013. Reniini-angiotensiinijärjestelmän aktivointi vähäsuolaisella ruokavaliolla ei lisää intratubulaarista angiotensiini- ja angiotensiini II -pitoisuutta rotilla. Olen. J. Physiol. Renal Physiol. 304: F505 F514. [Medline] [CrossRef]

17. Solhaug, MJ, Ballèvre, LD, Guignard, JP, Granger, JP ja Adelman, RD 1996. Typpioksidi kehittyvässä munuaisessa. Pediatr. Nephrol. 10: 529–539. [Medline] [CrossRef]

18. Wilcox, CS 1998. Macula densa NOS:n rooli tubuloglomerulaarisessa palautteessa. Curr. Opin. Nephrol. Hypertensistä. 7: 443–449. [Medline] [CrossRef]

19. Yabuki, A., Miyazaki, A., Ichii, O., Kohyama, M., Sawa, M. ja Yamato, O. 2016. Syklo-oksigenaasin matala ekspressio-2 kroonisessa munuaissairaudessa nuorilla koirilla. Res. Vet. Sci. 109: 71-73. [Medline] [CrossRef]

20. Yabuki, A., Suzuki, S., Matsumoto, M., Taniguchi, K. ja Nishinakagawa, H. 2002. Yksinkertainen menetelmä Ren-1-reniinin spesifiseen havaitsemiseen. Kidney Int. 62: 2294–2299. [Medline] [CrossRef]

21. Yabuki, A., Tahara, T., Taniguchi, K., Matsumoto, M. ja Suzuki, S. 2006. Neuronaalinen typpioksidisyntaasi ja syklooksigenaasi-2 tyypin 2 diabeettisten OLETF-rottien diabeettisessa nefropatiassa. Exp. Anim. 55: 17–25 [CrossRef]. [Medline]

22. Zhang, MZ, Wang, JL, Cheng, HF, Harris, RC ja McKanna, JA 1997. Syklo-oksigenaasi-2 rotan nefronien kehityksessä. Olen. J. Physiol.

23: F994–F1002. [Medline]