Wuchanglahnan (Megalobrama Amblycephala) pernassa ja pää-munuaisissa esiintyvän immuunipuolustuksen ammoniakkityppialtistuksen arviointi
Nov 13, 2023
Abstrakti:Ammoniakki on yksi tärkeimmistä vesiekosysteemien ympäristötekijöistä. Kuitenkin on olemassa rajoitetusti tutkimuksia kroonisen tai pitkäaikaisen ammoniakkistressin vaikutuksista ja sen mahdollisesta molekyylimekanismista kaloissa. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia immuunivastetta ja molekyylimekanismeja kalojen pernassa ja pää-munuaisissa kroonisen ammoniakkialtistuksen jälkeen.Megalobrama amblycephala(9.98 ± {{0}},48 g) altistettiin erilaisille kokonaisammoniumtypen pitoisuuksille (0–30 mg/l) 30 päivän ajan. Ammoniakkialtistus nosti merkittävästi kortisolitasoja ja laski lysotsyymi- ja komplementtipitoisuuksia 3/4 seerumissa, mikä osoittaa ammoniakkistressin estäviä vaikutuksia synnynnäisiin immuunivasteisiin. Ammoniakkialtistus aiheutti myös pitoisuudesta riippuvaisia ammoniakkipitoisuuksien nousuja kudoksissa, patologisia vaurioita sekä pernan ja pää-munuaisen indeksejä. Lisäksi immunoglobuliini M (IgM), interleukiini 1 sisältö (IL-1 ) ja tuumorinekroositekijä (TNF- ) samoin kuin maksun kaltaisten reseptorien (TLR)/myeloididifferentiaatiotekijä 88 (MyD88) -riippumattomien signalointimolekyylien mRNA-tasot pernassa ja pää-munuaisessa säädeltyivät merkittävästi ammoniakkialtistuksen jälkeen. Tuloksemme viittaavat siihen, että krooninen ammoniakkialtistus aiheutti synnynnäisten ja adaptiivisten immuunivasteiden tukahduttamisen TLR/MyD{5}}riippumattoman signaalin säätelyn myötä. Kroonisen ammoniakkistressin haitalliset vaikutukset olivat vakavampia pernassa kuin päämunuaisessa.
Avainsanat: ammoniakki; stressi; maksun kaltaiset reseptorit; perna; pää-munuainen; immuniteetti
NAPSAUTA TÄSTÄ SAATTAksesi yrttiliuosta munuaisiin
1. Esittely
Ammonia is one of the most important environmental factors in aquatic ecosystems that affect the growth and health of aquatic animals [1]. Ammonia nitrogen generally comes in one of two ionized forms—NH4 + and the un-ionized form, NH3, in the aquatic environment. NH3 is extremely toxic to fish by reason of its ability to diffuse across cell membranes easily [2–4]. Over the past decades, high levels of ammonia frequently occur in aquatic environments due to disorderly discharges of sewage effluent, agricultural run-off, and high-density aquaculture [5–7]. Although the recommended level of ammonia nitrogen in drinking water is up to 3 mg/L (NH4/L) [8], the real ammonia level can reach much higher (>20 mg/L) toisinaan tehottoman tai olemattoman jätevedenpuhdistuksen tai muiden syiden vuoksi [9,10].
Ammoniakin immunosuppressiivisten vaikutusten kaloissa on osoitettu myötävaikuttavan taudinpurkauksiin [11,12]. Joissakin Takifugu-rubripes-, Scophthalmus maximus- ja Pelteobagrus fulvidraco -tutkimuksissa akuutti ammoniakkialtistus voi nostaa B-soluja aktivoivan tekijän, lämpösokkiproteiinin 70/90, tnf-:n ja interleukiinin geenin ilmentymistasoja- 1/1 /6/ 8/12 [13–15]. Wang et ai. raportoi myös, että seerumin lysotsyymiaktiivisuus väheni merkittävästi Acanthopagrus schlegeliissa 24 tunnin ammoniakkialtistuksen jälkeen [16]. Samoin komplementin C3- ja IgM-mRNA-tasot havaittiin Pelteobagrus vachelliin ja Rhynchocypris lagowskin pernoissa akuutin ammoniakkialtistuksen aikana [17,18]. Vaikka akuutin ammoniakkialtistuksen vaikutuksiin kalojen immuniteettiin on kiinnitetty paljon huomiota, kroonisen tai pitkäaikaisen ammoniakkistressin vaikutuksista ja sen mahdollisesta molekyylimekanismista on vain vähän tutkimuksia. Lisäksi jotkut tutkijat ovat raportoineet ammoniakkitypen haitallisista vaikutuksista TLR:ien mRNA-ilmentymiseen transkriptioanalyysin avulla [16,19–22]. Näin ollen oletamme, että jatkuva ammoniakkialtistus voi myös vaikuttaa kalojen immuniteettiin, jossa TLR-signalointireitillä voi olla tärkeä rooli.
Perna ja päämunuaiset ovat teleost-kalojen tärkeimmät immuunielimet, jotka vastaavat vieraiden hiukkasten pyydystämisestä ja puhdistamisesta sekä vakaan sisäisen ympäristön ylläpitämisestä [23,24]. Ne ovat myös tärkeimmät paikat, joissa immuunivasta-aineet tuotetaan [25–27]. Lisäksi kalojen synnynnäinen immuunijärjestelmä koostuu kiinteistä ja liikkuvista soluista sekä laajasta valikoimasta puolustusmolekyylejä (kuten lysotsyymi, komplementti ja sytokiinit) [28,29]. Wuchang-lahna (Megalobrama amblycephala) on Kiinan Jangtse-altaalta kotoisin oleva kyprinikala, joka sijoittui maailman 11. sijalle tämän kalan vuotuisessa kokonaistuotannossa vuonna 2014 [30]. Pääasiallisena vesiviljelylajina M. amblycephala on suhteellisen herkkä laji ammoniakkitypelle ja kärsii usein ammoniakkitypen aiheuttamasta stressistä [31–33]. Yllä olevan valossa Wuchang-lahnassa suoritettiin kroonisen altistuksen koe, jossa selvitettiin immuunivasteiden piirteitä kroonisen ammoniakkialtistuksen jälkeen ja näiden vaikutusten taustalla olevaa mekanismia havaitsemalla muutokset seerumin immuuniparametreissa, histologiassa ja TLR-reittiin liittyvissä molekyyleissä. pernassa ja pää-munuaisessa. Tuloksemme ovat myös omiaan seuraamaan M. amblycephalan terveydentilaa ja hyvinvointia intensiivisissä vesiviljelyjärjestelmissä.
2. Tulokset
2.1. Ammoniakkipitoisuus pernassa ja pää-munuaisessa
Kuvassa 1 on esitetty ammoniakkipitoisuus M. amblycephalan pernassa ja päämunuaisessa 30 päivän altistuksen jälkeen erilaisille ammoniakkitasoille. Merkittävä ammoniakkitason nousu havaittiin kalojen pernassa, joka altistui 30 mg/l kokonaisammoniumtypelle verrattuna kontrolliryhmään (p < 0,05). Päämunuaisen ammoniakkitasoissa ei ollut tilastollista eroa kaikkien ammoniakkikäsittelyryhmien ja kontrolliryhmän välillä (p > 0,05).
Kuva 1. Kroonisen ammoniakkialtistuksen vaikutukset ammoniakin kertymiseen M. amblycephalan pernaan ja pään munuaiseen. Jokainen sarake edustaa kuuden kaksoiskappaleen keskiarvoa ± SE. Arvot p < 0.05 on esitetty merkinnällä "*" sarakkeen yläpuolella, mikä osoittaa merkittäviä eroja vertailuun, vastaavasti.
2.2. Seerumin kortisoli-, lysotsyymi-, C3- ja C4-tasot
Kuten kuvasta 2 näkyy, seerumin kortisolitasot nousivat merkittävästi kaikissa ammoniakkihoitoryhmissä verrattuna kontrolliryhmään (p < 0.05). Sitä vastoin seerumin lysotsyymiaktiivisuus väheni merkittävästi kaloissa, jotka altistettiin suuremmille ammoniakkipitoisuuksille (20 ja 30 mg/l ammoniakkitypen kokonaismäärää) (p < 0,05). Komplementin C3- ja C4-tasot seerumissa alenivat merkittävästi ryhmissä, joita käsiteltiin kokonaisammoniakityppellä 10-30 mg/l (p < 0,01).
Kuva 2. Kroonisen ammoniakkialtistuksen vaikutukset seerumin kortisoli-, lysotsyymi-, C3- ja C4(AD)-tasoihin M. amblycephalassa. Jokainen sarake edustaa kuuden kaksoiskappaleen keskiarvoa + SE. Arvot p < 0.05 ja 0.0l on esitetty "" ja "" sarakkeen yläpuolella osoittaen merkittäviä eroja vertailuun, vastaavasti.
2.3. Immuniteettielinten indeksit
Sekä perna- että pää-munuaisindeksit nousivat ammoniakkitypen kokonaispitoisuuksien noustessa altistuksen jälkeen (kuva 3). Vertailuryhmään verrattuna pernaindeksi oli merkitsevästi kohonnut kaloilla, joita käsiteltiin korkeammalla kokonaisammoniumtypellä (20 ja 30 mg/L) (p < 0,05). Pää-munuaisindeksissä ei havaittu merkitsevää eroa kaikkien ammoniakkikäsittelyryhmien ja kontrolliryhmän välillä (p > 0,05).
Kuva 3. Kroonisen ammoniakkialtistuksen vaikutukset pernaan (A) ja pää-munuaisindeksiin (B) Mamblycephalassa. Arvot ilmaistaan miniminä maksimiarvoon (n=18). Arvot p < 0.05 ja 0,01 on esitetty "" ja "u" sarakkeen yläpuolella, mikä osoittaa merkittäviä eroja vertailuun, vastaavasti.
2.4. Patologinen arviointi
Kontrolliryhmän Wuchang-lahnan perna näytti normaalilta, ja siinä oli runsaasti punasoluja ja leukosyyttejä (kuvio 4A). 30 päivän ammoniakille altistuksen jälkeen havaittiin lievää punasolujen määrän nousua sekä melano-makrofagikeskusten esiintymistä kalojen pernassa, joka oli alttiina 5 mg/l kokonaisammoniakityppelle (kuvio 4B, taulukko 1). Samanlaisia, mutta vakavampia muutoksia havaittiin kaloissa, joita oli käsitelty kokonaisammoniakityppellä 10-30 mg/l, kuten melanooma-makrofagikeskusten lukumäärän ja koon kasvua sekä huomattavasti lisääntynyttä punasolujen määrää (kuvio 4C, D). Lisäksi sytoplasman vakuolisoitumista havaittiin myös kalojen pernasta, joka oli altistettu 30 mg/l kokonaisammoniakityppelle (kuvio 4E, taulukko 1).
Mitä tulee pää-munuaiseen, kuva 5A esittää normaalin pää-munuaiskudoksen rakenteen kontrollikaloissa altistuksen jälkeen. Selkeää patologista merkkiä ei havaittu kalojen pää-munuaisissa, jotka altistettiin pienemmälle ammoniakkitypelle (5 mg/l) (kuvio 5B, taulukko 1). Melanooma-makrofagikeskusten lukumäärässä havaittiin lievää nousua kaloissa, jotka altistettiin 10 ja 20 mg/l ammoniakkitypelle (kuvio 5C, D, taulukko 1). Melanooma-makrofagikeskusten koko ja lukumäärä lisääntyivät 30 mg/l:n kokonaisammoniakityppiryhmässä (kuvio 5E, taulukko 1).
2.5. Kudos-immuuniparametrianalyysi
Luontaisten immuuniparametrien (TNF-, IL-1) ja hankittujen immuuniparametrien (IgM) tasot pernassa ja pään munuaisessa laskivat ammoniakkialtistustason nousun myötä (kuva 6, täydentävä taulukko S1). Pernassa TNF- ja IgM:n sisältö ja mRNA-tasot laskivat merkittävästi kaikissa ammoniakkihoitoryhmissä verrokkeihin verrattuna (p < 0.{{10}}5). Sillä välin pernan IL-1-pitoisuus ja mRNA:n ilmentymistasot alenivat merkittävästi kaloissa, jotka altistettiin yli 20 mg/l kokonaisammoniumtypelle (p < 0,05). Sitä vastoin vain IL-1:n pitoisuus ja mRNA-taso sekä tnf-n ilmentymistaso päämunuaisessa vähenivät huomattavasti ammoniakkikäsittelyryhmissä verrattuna kontrolleihin (p < 0,05). Ammoniakkikäsiteltyjen ryhmien ja kontrolliryhmän välillä ei ollut merkittäviä eroja IgM-proteiinin ja geenin ilmentymisen tasoissa sekä TNF-konsentraatiossa pään munuaisissa (p > 0,05).
Kuva 6. TLR-signalointireitin geenien suhteelliset mRNA-tasot sekä TNF-, IL- 1- ja IgM-pitoisuudet M. amblycephalan pernassa ja pää-munuaisessa. Arvot ilmaistuna kuuden kaksoiskappaleen keskiarvoina ± SE. igm: immunoglobuliini M, il-1: interleukiini 1, tnf-: tuumorinekroositekijä, jnk1: c-Jun N terminaalinen kinaasi1, erk1: solunulkoinen säädelty proteiinikinaasi 1, p38: mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi p38, b1nf-κ /2: ydintekijä-κ-geenin sitoutuminen 1/2, pi3 k: fosfatidyyli-inositoli-3-kinaasi, akt: proteiinikinaasi B, myd88: myelooinen erilaistumistekijä 88, traf6: tuumorinekroositekijäreseptoriin liittyvä tekijä 6, tlr1 /2/3/4/5: maksun kaltainen reseptori 1/2/3/4/5. Arvot p < 0.05 ja 0,01 on esitetty merkinnöillä "*" ja "**" sarakkeen yläpuolella, mikä osoittaa merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna.
Kroonisen ammoniakin toksisuuden molekyylimekanismin selvittämiseksi immuunijärjestelmään määritettiin TLR-signalointireittiin liittyvien avaingeenien transkription muutokset sekä TNF-, IL-1 ja IgM-tasot. Pernassa toll-tyyppisten reseptorigeenien (tlr2, tlr4), MyD88-riippumattomaan reittiin liittyvän geenin traf6, NF-kB-signalointireittiin liittyvän geenin nf-κb2 ja MAPK-signalointireittiin liittyvän erk1-geenin mRNA-tasot laskivat merkittävästi -säädelty ammoniakkikäsittelyryhmissä kontrolliin verrattuna (p < 0.05), kun taas tlr1, tlr3, tlr5, pi3 k, akt, myd88 ilmentymisessä ei tapahtunut merkittäviä muutoksia. , nf-κb1, jnk1 ja p38a (p > 0.05). Samoin tlr1:n, tlr2:n, tlr5:n, aktin, traf6:n, nf-κb1:n, erk1:n ja jnk1:n transkriptiotasot olivat merkitsevästi punaisia, ei merkittäviä eroja tlr3:n, tlr4:n, myd88:n, pi3 k:n, nf-κb2:n ja p38:n ilmentymisessä pään-kidneyssä. ammoniakkikäsittelyryhmien ja kontrolliryhmän välillä (p > 0,05).
2.6. Korrelaatioanalyysi
Kuten kuvasta 7 ja täydentävästä taulukosta S2 näkyy, ammoniakkialtistuspitoisuus korreloi merkittävästi negatiivisesti TNF-, IL-1- ja IgM-pitoisuuksien sekä tnf-, il-1, igm, transkriptiotasojen, tlr2, traf6, nf-кb2 ja jnk1 pernassa. Samaan aikaan pernan TNF-, IL-1 ja IgM sisällöt ja transkriptiotasot osoittivat merkittäviä positiivisia korrelaatioita keskenään (p < 0.05). Pernan IgM-pitoisuus osoitti merkittävää positiivista korrelaatiota tlr2:n ja nf-кb2:n kanssa, ja TNF- sekä IL-1 osoittivat merkittäviä positiivisia korrelaatioita tlr2:n, traf6:n ja nf-кb2:n kanssa (p < 0). 53}}5). Päämunuaisessa ammoniakkialtistustasot korreloivat kuitenkin vain huomattavan negatiivisesti IL-1-pitoisuuden ja geenien tnf-, il-1, tlr1/2/4/5, traf6, akt nf-кb1, jnk1 ja erk1 (p < 0,05). Pää-munuaisen IL-1 korreloi positiivisesti IgM:n, igm:n, il-1:n, tlr4:n, myd88:n, traf6:n, aktin, nf-кb1:n, erk1:n ja jnk1:n kanssa, kun taas IgM ja TNF- korreloivat positiivisesti p38a ja tlr2, vastaavasti (p < 0,05).
Kuva 7. Spearman-korrelaatiokertoimet ® ammoniakkialtistuskonsentraation ja immuuniparametrien välillä, jotka liittyvät TLR-signalointireittiin M. amblycephalan pernassa ja pää-munuaisessa kroonisen ammoniakkialtistuksen jälkeen. Arvot p < 0.05 ja 0,01 on esitetty merkinnöillä "*" ja "**" sarakkeen yläpuolella, mikä osoittaa merkittäviä eroja kontrolliin verrattuna.
2.7. IBR-indeksit
IBR-arvot laskettiin 22 biomarkkerin standardoiduista tiedoista Wuchang-lahnan pernassa ja päämunuaisessa eri ammoniakkipitoisuuksissa 30-päiväaltistuksen jälkeen (taulukko 2, kuva 8). Ammoniakin altistuspitoisuuksien noustessa IBR-arvoilla oli taipumus nousta sekä pernassa että pään munuaisessa. IBR-arvot olivat korkeammat pernassa
Wecistanchen tukipalvelu - Kiinan suurin vesisäiliön viejä:
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950
Osta lisätietoja teknisistä tiedoista:
https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
