Osa 1 Cistanche Deserticola -fenyylietanosidin vaikutukset -amyloidiproteiinin ilmentymiseen APP/PS1-siirtogeenisten hiirten hippokampuksessa

Osa 1 Cistanchen tehokkaat ainesosat: kokonaisfenetyylialkoholiglykosidien ja verbaskosidien terapeuttinen vaikutus Alzheimerin tautiin

Lisätietoja: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1,YANG Jian-hua2,HU Jun-ping3*

1 Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston viides sidossairaala, Urumqi 830000, Kiina;

2 Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston ensimmäinen sidoksissa oleva sairaala, Urumqi 830054, Kiina;

3 School of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, Kiina

Abstrakti:

Tutkiakseen Cistanche deserticola fenyylietanoidin vaikutusta -amyloidiproteiinin ilmentymiseen Alzheimerin tautia sairastavien hiirten hippokampuksessa 60 6-kuukauden ikäiset APP/PS1-kaksoissiirtogeeniset AD-hiiret jaettiin satunnaisesti malliryhmiin, donepetsiiliryhmään ( 0． 65 mg/kg), suuret, keskisuuret ja pienet annoksetglykosidien kokonaismääräCistanche deserticola (250,125 62． 5 mg/kg) ja akteosidi (125 mg/kg) sai lääkkeitä ja tislattua vettä 3 kuukauden ajan. 9 kuukauden iässä Morris-vesilabyrinttia ja passiivisia välttämistestejä käytettiin määrittämään oppimis- ja muistihäiriöt, hiirten hippokampuksen leesiot havaittiin HE-värjäyksellä ja A 1-42 ja A {{ ilmentymät. 7}} proteiinit hiirten hippokampuksessa testattiin immunohistokemiallisella menetelmällä ja Western blot -menetelmällä.Cistanche deserticola fenyylietanolivoi merkittävästi parantaa oppimis- ja muistikykyä ja hippokampuksen hermosolujen vaurioita APP/PS1-kaksoissiirtogeenisissä hiirissä. Malliryhmään verrattuna A 1-42, A 1-40 positiivisten solujen määrä aivoturso CA1:ssäCistanche deserticolaryhmä ja kontrolliryhmä väheni merkittävästi, ja Western blot -tulokset osoittivat, että A 1-42, A 1-40 proteiinin ilmentyminen Cistanche deserticolan hippokampuksessa kussakin annosryhmässä ja interventioryhmässä oli huomattavasti alhaisempi kuin malliryhmässä. Cistanche deserticola -glykosidi voi suojata hermosoluja ja vastustaa AD:ta säätelemällä hiirten hippokampuksen aivoissa A 1-42, A 1-40 -proteiinin ilmentymistä. Tässä tutkimuksessa fenyylietanoli tunnistettiin tärkeimmäksi tehokkaaksi aineeksiCistanche deserticolakäyttää anti-AD-aktiivisuuttaan, joka tarjoaa teoreettista tukea sen jatkokehittämiselle uutena lääkkeenä AD:ta vastaan.

Avainsanat:Cistanche deserticola; fenyylietanoli;Alzheimerin tauti; APP/PS1 kaksoissiirtogeeniset hiiret; -amyloidiproteiini

Napsauta Cistanche tubulosa -jauheeseen Alzheimerin taudin hoitoon

Alzheimerin taution keskushermoston rappeuttava sairaus, jolle on tunnusomaista etenevä muistin menetys ja kognitiivinen toimintahäiriö. Tällä hetkellä hyvin tunnistettu -amyloidiproteiini (A ) -kaskadihypoteesi uskoo, että normaalit metaboliittien A 1-42 ja A 1-40 monomeerit fysiologisissa olosuhteissa eivät ole neurotoksisia, mutta kun ne kohtaavat APP:n eksogeenisiä välittäjäaineita, ne aiheuttaa poikkeavuuksia. Kerääntymisen jälkeen kertynyt A 1-42 muodostaa liukoisia A-oligomeerejä (ADDL), jotka estävät monomeereja tuottamasta suojaavaa aktiivisuutta ja aiheuttavat hermosolujen rappeutumista, synapsien menetystä ja aksonivaurioita ja lopulta aiheuttavat hermosolujen apoptoosin aivoissa aiheuttaen dementiaa. , joten sen keskeisten kohteiden A 1-42 ja A 1-40 proteiinien ilmentymisen tutkiminen aivoissa on erittäin tärkeää tutkimukselle, joka koskee aivosairauksien ehkäisyä ja hoitoa.Cistanche-fenyylietanoidiglykosiditmainoksessa. Samaan aikaan AD-eläinmallien aivojen tunnusomaisten leesioiden hippokampuksen histopatologisen tutkimuksen tutkiminen voi todella heijastaa lääkkeiden parantumista aivojen leesioihin makroskooppisesta näkökulmasta.

Perinteinen kiinalainen lääketiede maassani uskoo siihenCistanche, perinteinen kiinalainen lääketiede, joka ravitsee munuaisia ​​ja ravitsee olemusta, sillä on ikääntymistä estäviä, ikääntymistä estäviä ja muistia parantavia vaikutuksia. Suuri määrä alustavia tutkimuksia on vahvistanut, että yhteensäCistanchen ja Acteosiden fenyylietanoidiglykosiditfenetyylialkoholiglykosidien edustava monomeeri, osoittavat ilmeisiä antagonistisia vaikutuksia AD:hen perinteisillä menetelmillä konstruoiduissa AD:n in vivo- tai in vitro -malleissa, ja niillä on tietty neurodegeneraation ehkäisy ja hoito. Sukupuolitautien mahdollisuus. Cistanche Acteosiden APP/PS1-kaksoissiirtogeenisen mallin soveltamista ei kuitenkaan ole käytetty tutkimukseen AD:n ehkäisystä ja hoidosta -amyloidin näkökulmasta.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus perustuu klassiseen AD-patogeneesin hypoteesiin – kaskadireaktiohypoteesiin ideaalisen ja luotettavan AD-eläinmallin APP/PS1-kaksoissiirtogeenisten hiirten avulla in vivo -tutkimusalustana käyttäen Morris-vesilabyrinttia ja HE:tä. värjäysmenetelmä, Western blot, immunohistokemia ja muut edistyneet tekniset menetelmät eläinten käyttäytymisen, histopatologian ja molekyylibiologian näkökulmista Uusien kohteiden löytämiseksi AD:n ennaltaehkäisyyn ja hoitoon se tarjoaa referenssin mm. Cistanchen fenyylietanoidiglykosidien spesifinen vaikutusmekanismi AD:n ehkäisyssä ja hoidossa.

1. Reagenssit ja instrumentit

1.1 Reagenssi

Cistanche tubulosa fenyylietanoidiglykosidit(tutkijaryhmän itse valmistama, fenyylietanoidiglykosidien pitoisuus on 87,6 prosenttia);Acteoside; titaanidioksidi; HE värjäyssarja; neutraali kumi; SDS-PAGE geelin valmistussarja; BCA-proteiinin kvantifiointipakkaus; A 1-40; A 1-42; -aktiini; Alkalisella fosfaasilla leimattu kanin anti-vuohen IgG (H plus L); 4 × proteiinin latauspuskuri Sisältää -merkaptoetanolia; 10 × TBST; PVDF-kalvo; SDS; Tris; glysiini; rasvaton maitojauhe; BCIP /NBT Kit; sekundaarinen vasta-aine; Väli 20.

1.2 Eläimet

60 6-kuukauden ikäiset APP/PS1-kaksoissiirtogeeniset AD-mallihiiret

Ja 10 pentuenegatiivista hiirtä, uros ja naaras, paino 20 ± 10 g, eläimet syövät ja juovat vapaasti kokeen aikana.

1.3 Laitteet

MT-100 Morris-vesilabyrintti; geelikuvantaja; RM2016 sairaus

Mikrotomi; SIM-F124 jääpalakone; geelielektroforeesi ja siirtokalvolaitteet; täyden aallonpituuden mikrolevyn lukija; CO2 vakiolämpötilan inkubaattori; 4 asteen ja -20 asteen jääkaappi; 67120 ultrapuhdas vesilaite

; TP-114 sähköinen saldo; korkean nopeuden jäähdytetty alhaisen lämpötilan sentrifugi; DVKW-D-2 digitaalinen näyttö sähkölämmitys vakiolämpötilassa vesihaude; ultraäänisolujen hajottaja; WD-9405Väriä poistava ravistin; säädettävä vakiojännite ja vakiovirtavirtalähde; DM4000 fluoresoiva käänteinen mikroskooppi.

2. Menetelmä

2.1 Eläinten ryhmittely ja hallinta

SPSS18:n mukaan. 0 Tilastoohjelmiston luomat satunnaisluvut, 1156 Natural Products Research, and Development Vol. 31AD-mallihiiret jaettiin satunnaisesti malliryhmään ja donepetsiiliryhmään (päivittäinen infuusio)

Mahalaukun annos on 0. 65 mg/kg), Cistanche-fenetyylialkoholin kokonaisglykosidien (PhG:t) suuren, keskisuuren ja pienen annoksen ryhmät (vuorokausiannokset 250, 125 ja 62,5 mg/kg), Cistanche-verbaskosidin interventioryhmä (125 mg/kg) kg ), 10 per ryhmä. Kuuden kuukauden iässä hiirille annettiin mahalaukunsisäistä letkuhoitoa ryhmien mukaan, ja hiirille annettiin mahalaukunsisäisesti kerran päivässä 3 peräkkäisen kuukauden ajan. Normaali ryhmä koostui ei-siirtogeenisistä hiiristä samassa pentueessa. Malliryhmälle ja normaaliryhmälle annettiin yhtä suuri määrä tislattua vettä letkulla.

2.2 Morris-vesilabyrinttikoe

Klassista Morris-vesilabyrinttia käytettiin testaamaan hiirten avaruudellisia oppimis- ja muistikykyjä. Ensimmäisenä ja toisena päivänä harjoittele hiiret tuntemaan tasanteen sijainti ja harjoittele tasan löytämistä. 3.-5. päivänä suoritetaan muodollinen testi, jossa seurataan hiirten tilannetta kussakin ryhmässä, jotka etsivät alustaa harjoituksen jälkeen. Kuudentena päivänä alusta poistetaan ja hiiriä tarkkaillaan.

Uimarata. Kokeen aikana kamera tallentaa samanaikaisesti hiiren alustan etsimiseen käyttämän ajan (eli pakolatenssin) ja uimaradan etäisyyden. Jos hiiri ei löydä alustaa määritetyllä aikavälillä (yleensä asetettu 60 s tai 120 s, tämä kokeilu käyttää 60 s), hiiren pakolatenssi kirjataan asetettuna arvona ja henkilökunta pysyy päällä alustaa muutaman sekunnin ajan (10 sekuntia käytetään tässä kokeessa) auttaakseen sitä syventämään alustan muistia. Merkitse kokeen jälkeen muistiin hiirten uintiaika veteen tulosta alustan löytämiseen. Kokeilun viimeisenä päivänä alusta poistettiin, ja asetettuna aikana tallennettava sisältö sisälsi pääasiassa hiiren alustan ylittämiskertoja, kohdekvadrantin viipymisajan jne. sekä hakustrategian. jokaisesta koe-eläimestä analysoitiin.

2.3 Aivokudoksen uuttaminen ja parafiiniin upottaminen

Annon jälkeen hiiret punnittiin ja hiiret nukutettiin 10-prosenttisella kloraalihydraatilla. Aseta nukutettu hiiri leikkauspöydälle raajojen kiinnittämiseksi. 4 prosentin paraformaldehydiperfuusion ja -kiinnityksen jälkeen eläimet lopetettiin, pikkuaivot ja muu ylimääräinen aivokudos poistettiin ja koko pikkuaivo ja aivot poistettiin aivopuoliskon päästä.

Keskikruunun etupuoli. Kiinnitä 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 24 tunnin ajan, pese ultrapuhtaalla vedellä 10 minuuttia ja laita sitten 30-prosenttiseen etanoliin (1 h) → 40-prosenttiseen etanoliin (1 h) → 50-prosenttiseen etanoliin (1 h) → 75-prosenttiseen etanoliin (1h). h) ) → 90 % etanolia (1 h) → 95 % etanolia (1 h) → vedetön etanoli I (1 h) → vedetön etanoli II (1 h) → ksyleeni I (15 min) → ksyleeni II (15 min). Kun kudokset oli upotettu parafiiniin 2 tunniksi, ne upotettiin jatkuviin koronaalisiin leikkeisiin hiiren aivojen hippokampuksen CA1-alueella. Säilytä huoneenlämmössä 60 asteen uunissa 48 tunnin kuivauksen jälkeen.

2.4 HE-värjäys

Paista kussakin ryhmässä valittuja viipaleita 60-asteisessa uunissa 40 minuuttia ja laita ne sitten ksyleeni I:een (5 min) → ksyleeni II:een (10 min) → absoluuttiseen etanoliin (5 s) → 95-prosenttiseen etanoliin I (5 s) → 95 % etanolia II (5 s) → 80 % etanolia (5 s) → tislattua vettä

Toiseksi, käytä HE-värjäyssarjaa värjätäksesi ja kiinnittääksesi objektilasit neutraalilla purukumilla.

2.5 Immunohistokemiallinen värjäys

Valmistetuille leikkeille suoritettiin immunohistokemiallinen värjäys standardivaiheiden mukaisesti: vahanpoisto, antigeenin haku, endogeenisen katalaasin esto, seerumin salpaus, primäärinen vasta-aineinkubaatio, sekundaarinen vasta-aineinkubaatio, DAB-värin kehitys, dehydratointi ja kiinnitys. Valitse 6 sopivaa viipaletta jokaiselle ryhmälle, tarkkaile hermosolujen hienoutta elektronimikroskoopilla

Solujen morfologia, väritys ja laske hippokampuksen positiivisten solujen lukumäärä käyttämällä Image J -ohjelmistoa.

2.6 Proteiinin ilmentymisen Western blot -analyysi

Ime kudossupernatantti aivokudoksen hippokampuksesta uutetun proteiinipitoisuuden määrittämiseksi BCA-proteiinin kvantifiointimenetelmän mukaisesti. Sekoita se 4× proteiinilatauspuskurilla suhteessa 4:1, lämmitä 95 asteessa 10 min, jäähdytä luonnollisesti ja säilytä jääkaapissa -20 asteessa. Valmista SDS-PAGE-geeli, lisää elektroforeesiliuos ja lisää sitten normaaliryhmä, lääkeinterventioryhmä ja muut histonit peräkkäin ja lisää proteiinimarkkeri geelin reikiin molemmilla puolilla. Lopeta elektroforeesi jäähauteessa erotusgeelin pohjalle. Kun siirtokalvoneste on tasapainotettu, leikkaa PVDF-kalvo ja suodatinpaperi irti liiman koon mukaan. Noudata siirtopuristimessa vaiheita musta kuitumatto → 3 kerrosta suodatinpaperia → geeli → PVDF-kalvo → 3 kerrosta suodatinpaperia → musta kuitumatto kootaksesi. Kun kuplat on poistettu, siirrä kalvo vakiopaineella 80 V. Kun kalvon siirto on valmis, rasvaton maito suljetaan 2 tunnin ajan. Laimennettu vasta-aine lisätään vastaavalle kalvolle ja inkuboidaan yön yli. Kun sekundaarista vasta-ainetta on inkuboitu 2 tuntia, lisää BCIP/NBT-värinkehitysliuosta, kunnes väri kehittyy. BIO-RAD-geelikamera ottaa kuvia. Käytä Image J -ohjelmistoa kohdeproteiinivyöhykkeen kvantitatiiviseen analysointiin ja käytä IOD:tä proteiinivyöhykkeen suhteellisen vahvuuden osoittamiseen. Tulos ilmaistaan ​​kohdeproteiinin ja kontrolliproteiini-aktiinin integroidun optisen tiheysarvon suhteena. Tulos ilmaistaan ​​muodossa (kohdeproteiini-ID/sisäinen viite-ID) × 100 prosenttia.

2.7 Tietojen tilastollinen analyysi

Käytä SPSS18. 0 Suorita tilastollinen analyysi tiedoista. Tiedot esitetään (x± s ). Ryhmien välisessä vertailussa käytetään One-Way ANOVA -testiä ja -analyysiä, ja useissa tietojen välisissä vertailuissa käytetään LSD-t-testiä (pienin merkittävä ero, LSD). ), P<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Kokeellinen tulos

3.1 Morris-vesilabyrinttihavaintotulokset

Harjoitteluajan pidentyessä kunkin hiiriryhmän aika, joka kuluu alustalle saavuttamiseen (pakoviive) lyhenee merkittävästi. Ensimmäinen ja toinen päivä ovat harjoitusaikaa. Kolmantena päivänä malliryhmän pakolatenssi oli merkittävästi pidempi kuin normaalin kontrolliryhmän (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchefenetyylialkoholi Kussakin annosryhmässä jaActeosidesryhmässä, kun annos nousi, hiirten pakolatenssi lyheni merkittävästi merkittävillä eroilla (P<0.05) (see="" table="">

Vesilabyrinttikokeen kuudentena päivänä alusta poistettiin avaruustutkimuskoetta varten, ja kunkin hiiren ryhmän ylitti alustan paikan 60 sekunnin kuluessa kirjattiin. Tuloksista voidaan nähdä, että malliryhmän laiturin ylityskertojen määrä asetetussa ajassa väheni merkittävästi normaaliryhmään verrattuna (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Cistanche-fenyylietanoidiglykosiditvoi parantaa merkittävästi APP/PS1-kaksoissiirtogeenisten AD-hiirten oppimis- ja muistikykyä, ja sillä on tietty annosriippuvuus.

3.2 Patologisen kudosvärjäyksen havaintotulokset

Tulokset osoittavat, että normaaliryhmän hippokampuksen CA1-alueen hermosolut ovat siististi ja tiiviisti, jakautuneet tasaisemmin, selkein kerroksin ja nikamasolun ydin on suurempi ja muodoltaan suunnilleen pyöreä. Malliryhmän hiirten hippokampuksen CA1-alue kuitenkin vaurioitui, mikä johti ilmeisiin muutoksiin hermosoluissa ja morfologiassa, järjestely oli löysä ja kaoottinen, ilmeistä hierarkiaa ei ollut, solujen väliset yhteydet olivat löysät ja osa ytimistä pyknoosia ja apoptoosia, mikä teki värjäytymisestä syvemmän. Hippokampuksen CA1-solut eri annoksillaCistanche-fenetanolidiinterventioryhmä, donepetsiiliryhmä ja verbaskosidiinterventioryhmä paranivat kaikki vaihtelevasti. Pyknoottiset ja syvään värjäytyneet hermosolut vähenivät merkittävästi malliryhmään verrattuna, mutta suurempia on silti nähtävissä solujenvälisessä tilassa (ks. kuva 1).

3.3 Immunohistokemiallisen kokeen tulokset

Cistanchen fenetyylialkoholiglykosideilla käsittelyn jälkeen otettiin yhdeksän kuukauden ikäinen kaksoissiirtogeeninen hiiren APP/PS1-aivokudosleike, ja hippokampuksen CA1-alueelle tehtiin A 1-40-immunohistokemiallinen värjäys. Tulokset osoittivat, että positiiviset solut olivat enimmäkseen pyöreitä näkökentässä. Suurin osa solukalvoista on ruskeankeltaisia. Normaaliin ryhmään verrattuna A 1-40 -positiivisten solujen määrä malliryhmän hippokampuksen CA1-alueella lisääntyi merkittävästi (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosaoli korkealla. Positiivisten solujen määrä keskiannoksen ryhmässä ja akteosidiglykosidiryhmässä väheni merkittävästi (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Cistanche-fenyylietanoidiglykosiditpieni annos.

A-1-40-positiivisten solujen määrä annosryhmässä väheni merkittävästi (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

Cistanchen fenyylietanoidiglykosidien puuttumisen jälkeen otettiin 9-kuukauden ikäisiltä APP/PS1-kaksoissiirtogeenisiltä hiiriltä aivokudokset ja aivotursoalueen CA1-alue värjättiin A 1-42-immunohistokemiallisella värjäyksellä. Tulokset osoittivat: Verrattuna malliryhmään,Cistanche-fenyylietanoidiglykosiditPositiivisten solujen määrä kussakin glykosidien annosryhmässä ja akteosidiglykosidiryhmässä väheni merkittävästi, ja ero oli merkittävä (P<>

3.4 Western blot -testin tulokset

Western blot -menetelmää käytettiin A-1-40- ja A-1-42-proteiinin ilmentymisen havaitsemiseen hiirten aivotursossa. Tulokset osoittivat, että A 1-40 ja A 1-42 proteiinin ilmentyminen malliryhmän hippokampuksessa oli merkittävästi voimistunut normaaliin ryhmään verrattuna, ja ero oli merkittävä (P < {{="" 6}}.="" 05).="" hippokampuksen="" a="" 1-40="" ja="" a="" 1-42="" proteiiniekspressiot="" hiirillä="">Cistanche-fenyylietanoidiglykosidijaverbascosideinterventioryhmässä oli huomattavasti vähemmän säädelty kuin malliryhmän hiirillä (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">