Ekinakosidi kumoaa sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja parantaa sydämen toimintaa

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Yajuan Ni1|Jie Deng1|Xin Liu1|Qing Li1|Juanli Zhang1|Hongyuan Bai1|Jingwen Zhang 2

Abstrakti

Sydänlihaksen uusiutuminen on HF:n tärkeä patologinen perusta, mitokondrioiden oksidatiivinen stressi edistää sydänlihaksen hypertrofiaa, fibroosia ja apoptoosia. ECH on perinteisen kiinalaisen lääketieteen Cistanches Herba tärkein aktiivinen komponentti, monet tutkimukset osoittavat, että sillä on vahva antioksidanttikapasiteetti hermosoluissa ja kasvaimissa, se estää mitokondrioiden oksidatiivista stressiä, suojaa mitokondrioiden toimintaa, mutta sen spesifinen mekanismi on epäselvä. SIRT1/FOXO3a/MnSOD on tärkeä antioksidanttiakseli, tutkimuksessa havaitaan, että ECH sitoutuu kovalenttisesti SIRT1:een ligandina ja säätelee SIRT1:n ilmentymistä aivosoluissa. Oletamme, että ECH voi kääntää sydänlihaksen uudelleenmuotoilun ja parantaa HF:n sydämen toimintaa säätelemällä SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakselia ja estämällä mitokondrioiden oksidatiivista stressiä sydänlihassoluissa. Tässä ensin indusoimme oksidatiivisen stressin solumallin ISO:lla AC-16-soluilla ja esikäsittelemme ECH:lla, mitokondrioiden ROS:n tasoa, mtDNA:n oksidatiivista vauriota, MMP:tä, karbonyloitua proteiinia, lipidien peroksidaatiota, solunsisäistä ROS:ää ja apoptoosi havaitaan, vahvistavat ECH:n vaikutuksen mitokondrioiden oksidatiiviseen stressiin ja toimintaan in vitro. Sitten luomme ISO:lla indusoidun HF-rottamallin ja esikäsittelemme ECH:lla. Sydämen toiminnan indeksit, sydänlihaksen uusiutuminen, mitokondrioiden oksidatiivinen stressi ja toiminta, SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakselin ilmentyminen mitataan, tulokset osoittavat, että ECH parantaa sydämen toimintaa, estää sydänlihaksen liikakasvua, fibroosi ja apoptoosi lisää SIRT1/FOXO3a/-ekspressiota. MnSOD-signalointiakseli, vähentää mitokondrioiden oksidatiivisia vaurioita, suojaa mitokondrioiden toimintaa. Päättelemme, että ECH kääntää sydänlihaksen uudelleenmuotoilun ja parantaa sydämen toimintaa säätelemällä SIRT1/FOXO3a/MnSOD-akselia ja estämällä mitokondrioiden oksidatiivista stressiä HF-rotilla.

KEYWORDSekinakosidi, sydämen vajaatoiminta, mitokondrioiden oksidatiivinen stressi, sydänlihaksen uusiutuminen

tuoreet yrtit cistanchetomitokondrioiden oksidatiivinen stressi

1|JOHDANTO

Sydämen vajaatoiminta (HF) on useimpien korkean esiintyvyyden ja huonon ennusteen omaavien sydän- ja verisuonitautien lopputulos, ja väestön ikääntymisen pahenevan trendin vuoksi sairaalahoito ja krooniseen sydämen vajaatoimintaan (CHF) johtuva kuolleisuus lisääntyivät jyrkästi kaikkialla maailmassa.1 Viimeisten 20 vuoden aikana HF:n lääkehoidot ovat edistyneet suuresti, mutta vaikutus on hyvin rajallinen, joten uusia lääkkeitä tarvitaan kipeästi. Sydänlihaksen uusiutuminen on HF:n tärkeä patologinen perusta, ja sille on ominaista sydänlihaksen liikakasvu, apoptoosi, interstitiaalinen fibroosi, sydänlihassolut ovat hajautuneita ja johtavat ejektiofraktion (LVEF) vähenemiseen, vasemman kammion loppudiastolisten ja systolisten mittojen kasvuun. (LVIDd ja LVID) ja vasemman kammion fraktionaalisen lyhenemisen (LVFS) väheneminen.2 Mutta taustalla olevia mekanismeja ei vieläkään täysin ymmärretty. Viime vuosina lukuisat tutkimukset ovat vahvistaneet, että oksidatiivinen stressi on tärkeä sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen edistäjä.3-7

Oksidatiivinen stressi on tila, jossa reaktiivisia happilajeja (ROS) tai vapaita radikaaleja syntyy liikaa ja ne johtavat solukomponenttien oksidatiiviseen vaurioitumiseen, mikä puolestaan ​​​​aiheuttaa solujen toimintahäiriöitä.8 Mitokondriot ovat tärkein solunsisäisen ROS:n lähde. vuoto hengityselectronien kuljetusketjusta, ja mitokondriot ovat herkin paikka ROS-vaikutuksille.9 HF-tutkimukset havaitsivat lisääntynyttä ROS-tuotantoa hengitysketjun kompleksista I.8 Lisääntynyt ROS-tuotanto hyökkää ensin mitokondrioiden komponentteihin ja johtaa liialliseen oksidatiiviseen stressiin. , ilmenee proteiinien karbonyloitumisena, lipidien peroksidoitumisena ja DNA-vauriona,10ja mitokondrioiden toimintahäiriönä, mikä johtaa näin ollen liialliseen ROS:n muodostumiseen8, muodostaa noidankehän. Jatkuva oksidatiivinen stressi on osoitettu voivan aiheuttaa sydänlihaksen liikakasvua ja sydänlihaksen fibroosia,11-13 ja aiheuttaa sydänlihassolujen apoptoosia aktivoimalla mitokondrioista riippuvaista apoptoosia mitokondrioiden kalvoproteiinien karbonyloitumisen ja mitokondrioiden kalvopotentiaalin menetyksen seurauksena.14 Joten. , katsotaan, että mitokondrioiden oksidatiivisen stressin estäminen voi olla uusi strategia sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja jopa HF:n estämiseksi.15-17

Ekinakosidi (ECH), luonnollinen fenyylietanoidiglykosidi, on Cistanches Herban, joka on perinteinen kiinalainen lääketiede, tärkein aktiivinen komponentti. Viime vuosina ECH:ta on tutkittu laajasti hermostossa ja kasvaimissa, ja sillä on raportoitu olevan erilaisia ​​farmakologisia vaikutuksia, kuten antioksidanttisia, anti-inflammatorisia, apoptoosia ja kasvaimia estäviä ominaisuuksia.18,19In hermosolut, ECH parantaa merkittävästi antioksidanttikapasiteettia, vähentää ROS-tuotantoa, parantaa mitokondrioiden kalvopotentiaalia (MMP) ja lisää solujen elinkykyä,20 suojaa mitokondrioiden toimintaa ja estää mitokondrioiden oksidatiivista stressiä, se suojaa oksidatiivisilta vaurioilta ja parantaa muistia, ehkäisee lopulta neurodegeneraatio.21,22 ECH lisää myös SOD:n aktiivisuutta ja sillä on suojaava rooli aivokudoksessa ja verkkokalvokudoksessa,19,23 mutta sen antioksidanttivaikutuksen spesifinen mekanismi on epäselvä.

SIRT1 liittyy läheisesti oksidatiiviseen stressiin, ja SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakseli on tärkein antioksidanttiakseli ja se on vastuussa mitokondrioiden oksidatiivisen stressin tukahduttamisesta, MnSOD leviää laajasti mitokondrioissa ja on ensisijaisesti vastuussa mitokondrioiden ROS:n puhdistamisesta. estävät oksidatiivista stressiä, yhdisteet, jotka aktivoivat tämän antioksidanttiakselin, voivat estää oksidatiivista stressiä.24,25 Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH saa farmakologiset vaikutukset säätelemällä useita signalointireittejä, kuten p-AKT, mTOR/STAT3, TGF-beeta 1/Smads , ja SIRT1-signalointireitti.{10}} Uusi tutkimus havaitsee, että ECH sitoutuu kovalenttisesti SIRT1:een ligandina ja säätelee SIRT1:n ilmentymistä aivosoluissa.26Se viittaa siihen, että ECH voi estää mitokondrioiden oksidatiivista stressiä sydänlihassoluissa ja kääntää sydänlihaksen. uudistaminen. ECH:n vaikutuksia koskeva tutkimus on kuitenkin keskittynyt hermostoon tai kasvaimeen, ECH:n vaikutukset ja mekanismit mitokondrioiden oksidatiiviseen stressiin sydänlihassoluissa ja sydänlihaksen uusiutumiseen ovat edelleen tuntemattomia. Täällä indusoimme ensin oksidatiivisen stressin solumallin ISO:lla ja vahvistamme ECH:n vaikutuksen mitokondrioiden oksidatiiviseen stressiin ja toimintaan in vitro. Sitten luomme ISO:n indusoiman HF-rottamallin ja osoitamme, että ECH kääntää sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja parantaa sydämen toimintaa säätelemällä SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakselia ja estämällä mitokondrioiden oksidatiivista stressiä HF-rotissa. Tulosten on tarkoitus tarjota kokeellista näyttöä uusien sydämen vajaatoimintaa ehkäisevien lääkkeiden kehittämisestä.

2|MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1|Soluviljely ja hoito

AC16-solut hankitaan Bena Culture Collectionista. Soluja ylläpidetään korkean glukoosipitoisuuden Dulbeccon modifioidussa Eagle's-elatusaineessa (DMEM; Hyclone, GE Healthcare, USA), joka sisältää 10 prosenttia naudan sikiön seerumia (10 prosenttia FBS; Gibco) T-75-pulloissa (Corning Glassworks, Corning, NY, USA). Olosuhteet pidetään 37 asteessa kostutetussa ilmakehässä, joka sisältää 5 prosenttia CO2:ta. Kun solut saavuttavat 70 prosentin -80 prosentin konfluenssin, ISO (Sigma, USA) -ryhmän soluja inkuboidaan 10 uM ISO:ta (Sigma, USA) sisältävän väliaineen kanssa 24 tunnin ajan, ECH-ryhmän soluja esikäsitellään 50 uM ECH:lla (MCE). , USA) 30 minuuttia ennen ISO-valotusta. Kontrollisoluja (Ctrl) ei käsitellä mitään.

vesisäiliö myytävänäottaa talteen

2.2|Mitokondrioiden ROS-tason havaitseminen luminolikemiluminesenssilla

Mitokondriot eristetään ja puhdistetaan AC-16-soluista käyttämällä Mitochondria Isolation Kit -sarjaa (Sigma, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Proteiinipitoisuudet määritetään BCA-proteiinimäärityspakkauksella (Biotech). Mitokondrioiden ROS-taso havaitaan luminaalilla (3-aminoftaalihydratsidi 5-amino-2, 3-dihydro-1, 4-ftalatsiinidioni) Elisa-sarjan avulla (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), se reagoi ROS:n kanssa ja aiheuttaa fotonien emission, joka on kaistaspektri, jonka huippu on noin 460 nm, ja suhteellinen valoyksikkö (RLU) havaitaan kemiluminesenssimittauslaitteella ja muunnetaan RLU/ug:ksi. mitokondrioiden proteiini.

2.3|8-OHdG:tä käytetään mitokondrioiden DNA:n oksidatiivisen vaurion arvioimiseen

Mitokondrioiden DNA:n oksidatiiviset vauriot arvioidaan havaitsemalla 8-hydroksi-2-deoksiguanosiinin (8-OHG) pitoisuus. Puhdistetut mitokondriot soluissa eristetään käyttämällä mitokondrioiden eristyspakkausta, kuten edellä (Sigma). Proteiinipitoisuudet määritetään BCA-proteiinimäärityspakkauksella (Biotech). Sitten ne erotetaan 8-OHdG-tason määrittämiseksi käyttämällä Elisa-sarjaa (GERMED SCIENTIFIC INC, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Värinmuutoksen absorbanssi mitataan spektrofotometrillä aallonpituudella 450 nm. 8-OHdG:n pitoisuus näytteissä määritetään sitten vertaamalla näytteiden OD:ta standardikäyrään ja muunnetaan ng/ml:ksi.

2.4|JC:n MMP-mittaus-1

Mitokondriot eristetään ja puhdistetaan AC-16:sta ja proteiinipitoisuus määritetään edellä mainitulla tavalla. Sitten mitokondriot suspendoidaan uudelleen pitoisuutena 1 mg/ml, MMP mitataan käyttämällä JC-1-määrityssarjaa valmistajan ohjeiden mukaisesti. Fluoresenssin intensiteetti mitataan viritysaallonpituudella: 490 nm, rako 5 nm, emissioaallonpituus: 590 nm, rako 5 nm spektrofotometrilaitteella30, tulokset esitetään muodossa FLU/ugP.

2,5|Apoptoottisten solujen havaitseminen virtaussytometrialla AC-16-soluissa

Virtaussytometriaa käytetään solujen apoptoosin arvioimiseen. Apoptoottisten ja nekroottisten solujen havaitsemiseen käytetään Annexin V-FITC/PI apoptoosin havaitsemispakkausta (CWBIO, Kiina) toimittajan ohjeiden mukaisesti. Varhaisen vaiheen apoptoosi, myöhäisen vaiheen apoptoosi tai nekroosi, solujätteet ja elävät solut tunnistetaan anneksiini V ( plus )/PI (−), anneksiini V ( plus )/PI ( plus ), anneksiini V (−)/PI ( plus ) ja anneksiini V (−)/PI (−). Fluoresenssin intensiteetit analysoidaan käyttämällä virtaussytometriä (BD FACSVerse™ Flow Cytometer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Jokainen koe toistetaan 3 kertaa.

2,6|Arvioitu intrasellulaarinen ROS virtaussytometrillä

Käsittelyn jälkeen solut trypsinoidaan, pestään kahdesti PBS:llä. Sitten solut suspendoidaan uudelleen PBS:ään, värjätään DCFH-DA:lla (Beyotime, Kiina) lopullisessa pitoisuudessa 1 µM ja inkuboidaan 1 tunti 37 asteessa inkubaattorissa CO2:n kanssa ja testataan sitten virtaussytometrissä 488 nm:n virityksessä. . Fluoresenssin intensiteetti edustaa solunsisäisen ROS:n tasoa.

2,7|Testaa karbonyyliproteiinipitoisuutta AC-16-solujen mitokondrioissa

Käsittelyn jälkeen puhdistetut mitokondriot eristetään ja sonikoidaan jäillä ja niitä käsitellään 1-prosenttisella streptomysiinisulfaatilla mitokondrioiden nukleiinihappojen saostamiseksi, proteiinipitoisuus määritetään. Karbonyyliproteiinipitoisuus testataan Elisa-sarjalla (GERMED SCIENTIFIC INC, USA), joka perustuu karbonyyliryhmän derivatisointiin dinitrofenyylihydratsiinilla (DNPH), sarjan ohjeiden mukaan OD mitataan mikrolevylukijalla ja muunnetaan nmol/ mg proteiinia verrattuna standardikäyrään.

2,8|Lipidiperoksidaatiotason määritys AC-16-solujen mitokondrioissa

Käsittelyn jälkeen solut kerätään ja hajotetaan, mitokondriot eristetään ja puhdistetaan ja krakkaus suoritetaan ultraäänellä, proteiinipitoisuus määritetään BCA-proteiinimäärityssarjalla (Biotech), lipidiperoksidaatio määritetään malondialdehydin (MDA) tason perusteella TBARS-määrityksen avulla. , käyttämällä sarjaa (Nan jing Jian cheng, Kiina) ja MDA-taso mitataan valmistajan protokollan mukaisesti. OD havaitaan aallonpituudella 586 nm mikrolevylukijalla ja muunnetaan μmol/g proteiiniksi vertaamalla standardikäyrään.

2,9|Eläimet ja hoito

Nuoret urospuoliset Sprague-Dawley-rotat, jotka painavat 120-140 g, hankitaan Xi'an Jiao tong University Laboratorial Animal Centeristä (Shaanxi, Kiina). Tutkimus noudattaa US National Institutes of Healthin julkaisemaa The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals -ohjetta (NIH:n julkaisunro.85-23, tarkistettu vuonna 1996), ja koeprotokollat ​​ovat paikallisten viranomaisten hyväksymiä ( Biolääketieteen eettisen komitean lääketieteen laitoksen Xi ' Jiao Tong University). HF:n rotan malli määritetään, kuten olemme aiemmin kuvanneet.31 Lyhyesti sanottuna isoproterenolia (10 mg/kg) annetaan kerran päivässä intraperitoneaalisella injektiolla 2 viikon ajan (määritelty HF-ryhmäksi), ECH:ta annetaan 20 ug/g kerran päivässä intraperitoneaalisella injektiolla 30 minuuttia ennen ISO-hoitoa (määritelty ECH-ryhmäksi), ja anto kestää 2 viikkoa. Kontrollieläimille annetaan 0,9 % NaCl:a (määritelty Ctrl-ryhmäksi). Ekokardiografiamittaukset suoritetaan sydämen toiminnan arvioimiseksi.

2.10|Ekokardiografiset mittaukset

Eläimet nukutetaan intraperitoneaalisella injektiolla 300 mg/kg kloraalihydraattia. Ultraäänijärjestelmää SONOS-2500, jossa on 7,5 MHz:n ultraäänianturi (HP, USA), käytetään kaikukardiografisiin tutkimuksiin. Vasemman kammion ejektiofraktio (LVEF), vasemman kammion fraktiolyhennys (LVFS), vasemman kammion loppudiastoliset mitat (LVIDd), vasemman kammion loppusystoliset mitat (LVID), syke (HR), kammioiden väliseinän paksuus diastolessa (IVSTd) ), vasemman kammion takaseinämän paksuus diastolessa (LVPWTd) mitataan kuten olemme aiemmin kuvanneet.32

KUVA 1 50μmol ECH estää tehokkaasti AC-16-solujen mitokondrioiden oksidatiivista stressiä, jonka aiheuttaa 10 μmol/L ISO ja suojaa mitokondrioiden toimintaa ja vähentää apoptoosia.

2.11|Sydämen painon ja kehon painon suhde (HW/BW) mitataan

Rotta punnitaan ennen nukutusta, tuore sydän eristetään ja veri huuhdellaan pois 0,1 mol/l PBS:llä, leikataan pois suonet ja muu ylimääräinen kudos ja sydän punnitaan, sitten HW/BW(mg/100g) laskettu.

2.12|Histologinen värjäys

Rottien sydämet leikataan ja kiinnitetään 4-prosenttisessa paraformaldehydissä, upotetaan parafiiniin ja leikataan 5 μm:n paksuisiksi viipaleiksi. Hematoksyliini-eosiinivärjäystä (HE) käytetään patologisten muutosten tarkkailuun ja Massonin trikromia rotan sydänkudoksen kollageenikuitujen arvioimiseen. Sydämen kollageenitilavuusfraktio (CVF) ja sydänlihassolujen poikkileikkausala mitataan Image-Pro Plus 6:lla.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA).

2,13|TUNEL-värjäys

Sydänlihaskudosta vasemmasta kammiosta kerätään ja TUNEL-määritys suoritetaan kuten olemme aiemmin kuvanneet32

2,14|Transmissioelektronimikroskooppi

Tuore sydänkudos kiinnitetään 2,5-prosenttisessa glutaraldehydissä 4 asteessa, kudos leikataan sitten 1 mm3:n tilavuuteen ja kiinnitetään uudelleen 2,5-prosenttisessa glutaraldehydissä 4 asteessa 2 tunnin ajan, sitten pestään 0,1 mol/l PBS:llä, kiinnitetty 1-prosenttisessa osmihapossa, dehydratoitu asetonilla, upotettu epoksihartsilla, tehdään noin 800 nm ohuita ultraohuita viipaleita, jotka värjätään uranyyliasetaatilla ja lyijysitraatilla ja sitten tarkkaillaan transmissioelektronimikroskoopilla (H{). {13}}, Hitachi Limited, Japani). ECH:n suojaavan vaikutuksen kvantifioimiseksi mitokondrioiden morfologiassa mitokondrioiden keskimääräinen ympärysmitta, keskimääräinen mitokondrion poikkileikkauspinta-ala, degeneraatioprosentti ja vakuolisaatioprosentti mitokondrioissa analysoidaan tilastollisesti Image-Pro Plus 6.0:lla (Media Cybernetics, USA).

2,15|Kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA valmistetaan vasemman kammion kudoksesta Trizol-reagenssilla (Invitrogen, Carlsbad, USA). cDNA syntetisoidaan käyttämällä TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit -sarjaa (Takara, Japani). Reaaliaikaisessa PCR:ssä käyttämäni kollageenin spesifiset alukesekvenssit ovat seuraavat: eteenpäin: 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTC-3′, käänteinen: 5′-GTGGAGTCGGCAATTGCA-3′. GAPDH eteenpäin 5'-GGC AAG GTC ATC CCA GAG CT-3', käänteinen 5'-CGC CTG CTT CAC CAC CTT CT-3'. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritetaan SYBRPremix Ex:llä Taq (Perfect Real Time) (Takara, Japani). mRNA:n suhteellinen taso lasketaan normalisoimalla GAPDH:ksi 2-ΔΔCT-menetelmän mukaisesti.

2,16|Western blot -analyysi SIRT1-, FOXO3a-, MnSOD-proteiinin ilmentymisestä

Vasemman kammion kudoksen kokonaisproteiini uutetaan jäillä käyttämällä kylmää RIPA-puskuria (BioRad, USA) Protease Inhibitor Cocktailin (Sigma-Aldrich) kanssa. Pitoisuus määritetään BCA-menetelmällä. Western blot -menetelmät on kuvattu aiemmin.33 Lyhyesti sanottuna proteiininäyte fraktioidaan 15-prosenttisilla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleillä, siirretään PVDF-kalvoille (BioRad, USA), estetään 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla ja inkuboidaan hiiren MYH-vasta-aineen kanssa. (laimennettu 1:200, Santa Cruz, USA). Sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoidun vuohen hiiren vasta-aineen kanssa (laimennettu 1:2, 000, Santa Cruz, USA). Proteiinin suhteellinen taso lasketaan normalisoimalla keskimääräinen sädearvo -aktiiniksi. Proteiinijuovat havaitaan kemiluminesenssijärjestelmällä (ChemiDoc XRS, BioRad).

2,17|Mitokondrioiden oksidatiivisen stressin mittaus rotan sydänlihaksessa

Rotan sydänlihaksen puhdistetut mitokondriot eristetään Mitochondria Isolation Kitillä (Sigma, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti, mitokondrioiden ROS, MMP, mtDNA:n oksidatiivinen vaurio, karbonyloitunut proteiinipitoisuus ja lipidien peroksidaatiotaso mitokondrioissa havaitaan kaikki samoilla menetelmillä kuin yllä kuvatut solukokeet. Huomionarvoista, että sydänlihaskudoksen ROS havaitaan DCFH-DA-fluoresoivilla koettimilla, fluoresenssin intensiteetti havaitaan entsyymileimausmittauslaitteella, tulokset esitetään RLU/ug mitokondrioproteiinina.

2,18|Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Yksisuuntaista ANOVAa käytetään useiden ryhmien välisten erojen vertaamiseen, minkä jälkeen tehdään Tukeyn post hoc -testi merkitsevyyden määrittämiseksi. Kaikki tilastot määritetään SPSS15.0 -ohjelmistolla (SPSS Inc, IL, USA). Todennäköisyysarvoa P < 0,05="" pidetään="">

3|TULOKSET

3.1|50 μM ECH estää tehokkaasti mitokondrioiden oksidatiivisia vaurioita ja apoptoosia AC-16-soluissa

Käsittelemättömät solut asetetaan Ctrl-ryhmäksi. Ensinnäkin, kuten kuvio 1A osoittaa, ECH estää ISO:n indusoimaa mitokondrioiden ROS:ää. ISO-käsitellyt solut osoittavat merkittävää lisäystä mitokondrioiden ROS-arvossa verrattuna Ctrl:iin, ja tätä kasvua vaimentaa merkittävästi esikäsittely 50 μM ECH:lla. Toiseksi ECH voi estää ISO:n indusoimaa mtDNA:n oksidatiivista vauriota. 8-OHdG:n uskotaan olevan yksi yleisimmistä oksidatiivisesta stressistä johtuvista DNA-vaurioista, ja se on oksidatiivisen DNA:n vaurion ja korjauksen biomarkkeri. Kuten kuvasta 1B näkyy, 8-OHdG:n pitoisuus AC-16-solujen puhdistetuissa mitokondrioissa havaitaan, tulokset osoittavat, että 8-OHdG:n taso ISO-käsiteltyjen solujen mitokondrioissa nousi dramaattisesti, mutta muutos käännettiin 50 μM ECH:lla. Kolmanneksi ECH suojaa tehokkaasti MMP:tä, jota ISO heikentää. Fluoresenssin intensiteetti on merkittävästi alentunut ISO-käsitellyissä soluissa verrattuna Ctrl-soluihin, kun taas esikäsittely 50 μM ECH:lla heikentää huomattavasti MMP:n vähenemistä, kuten kuva 1C osoittaa. Neljänneksi ECH suojaa mitokondrioproteiinin oksidatiiviselta vauriolta AC-16-soluissa. Kuten kuvasta 1D näkyy, ISO-käsittelysolujen mitokondrioiden karbonyyliproteiinipitoisuus kasvaa merkittävästi ja ECH vaimentaa vaikutusta. Viidenneksi, ECH estää myös mitokondrioiden lipidiperoksidaatiota ISO:n indusoimassa AC-16-soluissa. Kuten kuva 1E osoittaa, lipidiperoksidien taso ISO-solujen mitokondrioissa on selvästi korkeampi kuin Ctrl-soluissa, kun taas 50 µM ECH-esikäsittely vähentää merkittävästi tätä nousua. Viime kädessä ECH estää solunsisäisen ROS:n kertymistä. Kuten kuvio 1F osoittaa, solunsisäisen ROS:n taso ISO-soluissa on huomattavasti kohonnut ja laskenut selvästi ECH-esikäsitellyissä soluissa. Kuva 1G osoittaa, että AC-16-solujen apoptoosinopeus on lisääntynyt merkittävästi 24 tunnin inkuboinnin jälkeen 10 µM ISO:lla verrattuna Ctrl-soluihin, kun taas esikäsittelysolut 50 µM ECH:lla vähentävät merkittävästi ISO-indusoitua apoptoosia.

KUVIO 2 ISO:n aiheuttama HF-rottien sydämen hypertrofia helpottuu ja sydämen toiminta paranee merkittävästi ECH-hoidolla.

3.2|ECH kääntää sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja parantaa ISO-indusoitujen HF-rottien sydämen toimintaa

Kuten kuviossa 2A esitetään, HF-rottien sydämet ovat ilmeistä hypertrofiaa ja ne muuttuvat ECH-käsittelyllä. Kuten kuviot 2B-D ja L osoittavat, ECH vähentää HW/BW:tä. Ekokardiografiatulokset osoittavat, että LVEF ja LVFS ovat merkittävästi pienentyneet HF-ryhmässä, LVIDd, LVID ja IVSTd ovat merkittävästi lisääntyneet HF-ryhmässä. ECH kuitenkin vähentää merkittävästi LVIDd:tä, LVID:iä, IVSTd:tä ja parantaa LVEF:ää ja LVFS:ää, kolmen ryhmän välillä ei ole merkittävää eroa HR:ssä, LVPWTd on lisääntynyt HF:ssä, mutta ei eroa ECH:n ja Ctrl:n tai ECH:n ja HF:n välillä. Kuvassa 2E-K näkyy. HE-värjäyksen tulokset osoittavat, että sydänlihaksen liikakasvu, järjestynyt häiriö tai rappeumanekroosi, tulehdussolujen infiltraatio ja interstitiaalinen hyperemia ja turvotus HF-rotilla, ja ECH lievittää merkittävästi näitä vaurioita, sydänlihaksen liikakasvu ja järjestynyt häiriö lievittyvät, degeneraationekroosi ja tulehduksellinen infiltraatti vähenevät, kuten kuvassa 3A esitetään. Sydänlihassolun poikkileikkausala mitataan, se kasvaa merkittävästi ISO:n jälkeen ja pienenee ECH-käsitellyssä ryhmässä, kuten kuva 3E osoittaa. Kollageenin kertymisen arvioinnit Masson-värjäyksellä paljastavat, että vasemman kammion kollageenipitoisuus HF-rotissa on lisääntynyt selvästi ja ilmeisesti vähentynyt ECH-hoidon jälkeen, mikä selvästi vähentää CVF:ää. Reaaliaikainen PCR-analyysi paljastaa, että prokollageenin tyypin Ⅰ transkriptit ovat ylöspäin säädeltyjä ISO-rotissa ja alasäädeltyjä ECH-rotissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​keskenään, kuten kuviot 3B ja FG osoittavat, tiedot osoittavat, että ECH vähentää tehokkaasti kollageenin kertymistä . TUNEL-positiivisten solujen määrä kardiomyosyyteissä on lisääntynyt merkittävästi HF-rotissa Ctrl-rottiin verrattuna, ECH vähentää merkittävästi sydänlihassolujen apoptoosia, ja kuvio 3C-D esittää edustavan kuvan TUNEL-positiivisista soluista matalan ja suuren tehon kentissä, ja kuva 3H esittää sydänlihassolujen apoptoosinopeuden. Nämä tulokset osoittavat, että ECH kumoaa tehokkaasti sydänlihaksen hypertrofian, sydänlihaksen interstitiaalisen fibroosin ja apoptoosin ja parantaa sydämen toimintaa HF-rotilla ISO:n indusoimana.

Kuvio 3 Histologisen värjäyksen tulokset osoittavat, että ECH kumoaa HF-rottien vasemman kammion uudelleenmuotoilun, jonka aiheutti ISO.

3.3|ECH suojaa sydänlihaksen ultrarakennetta HF-rotilla

Transmissioelektronimikroskooppien tulokset osoittavat, että ECH voi vaimentaa sydänlihaksen ultrarakenteen vaurioita, kuten kuviot 4A-B osoittavat. Myofibrillit ovat pystyasennossa, sarkomeerirakenne on selvä, myofilamentit ovat siististi sijoittuneet ja Z-viiva on selkeä. Mitokondriot ovat siististi järjestettyjä ja rakenne on selkeä Ctrl-rotilla. Myofibrillit ovat kuitenkin epäorganisoituneita, repeytyviä ja liuenneita, sarkomeerirakenne on sumea, Z-linja puuttuu, sydänlihaksen supistumisvyöhyke on näkyvissä, mitokondrioiden määrä ja tilavuus ovat lisääntyneet, mitokondriot ovat erimuotoisia ja -kokoisia, järjestäytyneet epäjärjestykseen, rakenne on epäselvä, turpoaa ja crista-fragmentoi, romahtaa tai paakkuuntuu ja liukenee tyhjiöön HF-rotissa. ECH ilmeisesti vaimentaa näitä muutoksia, suurin osa sydänlihassäikeistä on järjestetty siististi ja sydänlihassäikeet ovat selkeitä, Z-viiva on olemassa, vaikka filamenttien jonkin verran liukenemista on ilmeistä, sarkomeerirakenne on selkeä, mitokondrioiden tiheys on pienentynyt, muodot ja koot keventyvät, järjestäytyvät siistimmin, mitokondrioiden turpoaminen ja crista-fragmentoituminen, romahtaminen tai paakkuuntuminen ja vakuolisoituminen vähenevät ilmeisesti ECH:n vaikutuksesta HF:ään verrattuna. Mitokondrioiden turpoaminen ja crista-fragmentaatio, romahtaminen tai paakkuuntuminen ja osittainen vakuolisoituminen tunnistetaan mitokondrioiden rappeutumiseksi. Tulokset osoittavat, että ECH suojaa tehokkaasti sydänlihaksen ultrarakennetta ja suojaa erityisesti mitokondrioiden morfologiaa HF-rotilla, kuten kuviot 4C-F osoittavat.

KUVIO 4 ECH suojaa sydänlihassolujen ultrarakennetta ja HF-rottien mitokondriomorfologiaa, joka on indusoitu ISO:lla.

3.4|ECH lisää SIRT1:n, FOXO3a:n ja MnSOD:n proteiiniekspressiota

Western Blot -analyysi osoittaa, että SIRT1:n, FOXO3a:n ja MnSOD:n proteiinin ilmentymistaso on merkittävästi alentunut HF-rotissa, mutta ECH ilmeisesti säätelee vähentynyttä proteiiniekspressiota. Immunoblottaus- ja tilastoanalyysitulosten edustavat proteiinivyöhykkeet on esitetty kuvassa 5. Osa tiedoista osoittaa, että ECH lisää SIRT1:n, FOXO3a:n ja MnSOD:n proteiiniekspressiota.

3,5|ECH estää mitokondrioiden oksidatiivista stressiä vasemman kammion sydänkudoksessa

Tässä osassa mitataan mitokondrioiden ROS, MMP, mitokondrion DNA:n oksidatiiviset vauriot, karbonyyliproteiinipitoisuus ja lipidien peroksidaatiotaso mitokondrioissa rottien vasemman kammion sydänkudoksessa, ja tulokset ovat sopusoinnussa solukokeiden kanssa, eli ECH vähentää mitokondrioiden ROS:ää, suojaa MMP:tä, lievittää mtDNA:n vaurioastetta, vähentää karbonyyliproteiinipitoisuutta ja lipidiperoksidaatiota mitokondrioissa, kuten kuvasta 6 näkyy.

Kuvio 5 ECH lisää SIRT1:n, FOXO3a:n ja MnSOD:n proteiinin ilmentymistasoa, joka on alasäädelty HF-rotissa.

4|KESKUSTELU

Tämä tutkimus osoittaa, että ECH:lla on tehokas rooli sydänlihaksen uusiutumisen estämisessä ja sydämen toiminnan parantamisessa säätelemällä SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakselia ja estämällä mitokondrioiden oksidatiivista stressiä.

Mitokondriot ovat tärkein ROS:n muodostuspaikka oksidatiivisen fosforylaation sivutuotteena, koska ne ovat lähellä ROS:ää, mitokondrioiden proteiinien, lipidien ja mtDNA:n uskotaan olevan ensisijaisia ​​oksidatiivisten vaurioiden kohteita mitokondrioiden liiallisen ROS-emission jälkeen, 34, 35. tämä vaurio stimuloi ROS:n lisätuotantoa, noidankehä jatkuu, ROS ja oksidatiivinen stressi voivat johtaa sydänlihaksen hypertrofiaan, apoptoosiin, interstitiaaliseen fibroosiin ja HF:ään aktivoimalla useita signalointireittejä.35 Joten näyttää siltä, ​​että lääkkeet, jotka kohdistuivat mitokondrioiden oksidatiivisen toiminnan estämiseen stressi on tehokkaita sydänlihaksen uusiutumisen ehkäisyssä. ECH on luonnollinen fenyylietanoidiglykosidi, joka on osa perinteistä kiinalaista Cistanche tubulosa -yrttiä. sillä on laajalti tutkittu, ja sillä on viime vuosina osoitettu olevan erilaisia ​​farmakologisia vaikutuksia, kuten kasvaimia, apoptoosia, ikääntymistä estävä, hermostoa suojaava vaikutus ja niin edelleen. Tutkimukset ovat osoittaneet, että ECH:n farmakologiset vaikutukset riippuvat pääasiassa sen antioksidanttisesta ja anti-inflammatorisesta aktiivisuudesta,18,21 ja ECH vähentää mitokondrioiden ROS:ää ja suojaa mitokondrioiden toimintaa oksidatiiviselta vauriolta hermosoluissa.20,22 Tässä osoitimme ensin, että ECH vähentää kardiomyosyyttien mitokondrioiden ROS-arvoa, mikä parantaa MMP:tä, vähentää mtDNA:n, proteiinin ja lipidien oksidatiivista vauriota, estää tehokkaasti mitokondrioiden oksidatiivisia vaurioita ja vähentää apoptoosia in vitro ja in vivo, joten se kääntää sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja parantaa sydämen toimintaa. Se tarkoittaa, että ECH on potentiaalinen uusi lääke sydänlihaksen uudelleenmuotoilun ja HF:n ehkäisyyn.

Normaaleissa olosuhteissa mitokondrioiden ROS poistetaan pääasiassa MnSOD:lla, joka jakautuu mitokondrioihin ja suojaa mitokondrioiden oksidatiivisilta vaurioilta. Ang II vähentää merkittävästi kardiomyosyyttien MnSOD:n ilmentymistä ja indusoi sydänlihaksen liikakasvua, mutta resveratroli voi lisätä MnSOD:n ilmentymistä ja estää Ang II:n aiheuttamaa sydänlihaksen hypertrofiaa.36 HF:ssa MnSOD:n aktiivisuus on laskenut merkittävästi ja mitokondrioiden ROS:n muodostuminen lisääntyy. .37,38 Sydänspesifisissä MnSOD-geenin poistohiirissä mitokondrioiden ROS:a ei voitu poistaa ja ROS on lisääntynyt kardiomyosyyteissä, mikä johti mitokondrioiden toimintahäiriöihin ja progressiiviseen sydämen laajentumiseen, mikä lopulta johtaa sydämen vajaatoimintaan.39 Tässä tutkimuksessa vahvistamme että MnSOD:n ilmentyminen vähenee merkittävästi, mitä ECH-käsittely vaimentaa ja siten mitokondrioiden ROS vähenee ja mitokondrioiden oksidatiivinen stressi estyy. Se tarkoittaa, että ECH suojaa kardiomyosyyttejä oksidatiivisilta vaurioilta säätelemällä MnSOD:n ilmentymistä, tutkimme edelleen näiden vaikutusten taustalla olevia molekyylimekanismeja.

MnSOD:n ilmentymistä säätelee FOXO3a, joka on transkriptiotekijä ja sitoutuu MnSOD:n geenipromoottorialueeseen ja johtaa geenin transkription edistämiseen.40 SIRT1 on FOXO3a:n ylävirran molekyyli ja se voi aktivoida FOXO3a:n deasetyloimalla. SIRT1/FOXO3a/MnSOD-signalointiakselilla on keskeinen rooli suojautuessa oksidatiiviselta stressiltä erilaisissa solutyypeissä. Signalointiakselin aktivointi estradiolilla estää oksidatiivista stressiä ja antaa sydämen suojan24; Resveratrolin aiheuttama signalointiakselin aktivointi estää oksidatiivisen stressin aiheuttamaa solukuolemaa40; Muuten angiotensiini II estää SIRT1/FoxO3a/MnSOD-reittiä ja indusoi mitokondrioiden oksidatiivista stressiä, mtDNA-vaurioita osteoblasteissa,41tyypin 5 adenylyylisyklaasi lisää oksidatiivista stressiä estämällä MnSOD:n ilmentymistä Sirt1/FoxO3a-reitin kautta. SIRT1:n, FoxO3a:n ja MnSOD:n ekspressio vähenee merkittävästi HF-rotissa ja mitokondrioiden ROS on kohonnut ja oksidatiivinen stressi lisääntyy, mutta muutokset kumoavat ECH:n. Uusi tutkimus osoittaa, että ECH sitoo suoraan SIRT1:tä ligandina ja muodostaa kompleksin 9 kovalenttisella sidoksella ja säätelee SIRT1:n ilmentymistä hermosoluissa.26 Tämän tutkimuksen mukaisesti tämä tutkimus osoittaa, että ECH lisää myös hermosolujen ilmentymistä. SIRT1 sydänlihassoluissa, se säätelee sitten MnSOD:n geeniekspressiota FoxO3a:n kautta ja estää mitokondrioiden ROS:ia ja oksidatiivista stressiä.

Pitkäaikainen krooninen iskemia voi aiheuttaa sydänlihaksen lepotilan, näissä lepotilassa olevissa sydänlihassoluissa on tyypillisesti supistumisfilamenttien menetystä, sytosolissa on ylimääräisiä glykogeenirakeita, sarkoplasmaverkko ja poikittaistiehyet menetetään,43 myös mitokondrioiden koko ja muoto poikkeavat. , reaktiivinen sydänlihaksen liikakasvu ja interstitiaalinen fibroosi, jotka ovat seurausta myosyyttien katoamisesta.44 Havaitsimme myös yllä mainitut muutokset HF-rotilla tutkimuksessamme, kun taas ECH lievittää näitä muutoksia merkittävästi, sillä viimeisimmän tutkimuksen mukaan sydämen toiminnan palautuminen iskeemisen stressin jälkeen voi olla Sydänlihaksen lepotilan ominaisuus45 mitataan myös sydänlihaksen glykogeenitaso, tulokset osoittavat, että näiden kolmen ryhmän välillä ei ole merkittävää eroa, kuten kuvassa 7J esitetään.

Edellisessä tutkimuksessa havaittiin myös sydänlihaksen lepotila ei-iskeemisessä sydämen vajaatoiminnassa sikojen mallissa tahdisttamalla LV:n vapaata seinämää korkealla taajuudella,46 koska mikrovaskulaarisella tukkeutumisella on tärkeä rooli sydänlihaksen lepotilassa ja siitä johtuvassa supistumishäiriössä, mikä paranee huomattavasti, kun Lääke kumoaa mikrovaskulaarisen tukkeuman.47 Tällä hetkellä joissakin tutkimuksissa päätellään, että revaskularisaatiohoito on tehokas sydänlihaksen talvehtimiseen,43 käyttämällä HE- ja Masson-värjäystä havaitsemme, että sydänlihaksen kapillaari- ja valtimotiheys vähenee selvästi HF-rotilla ja helpottuu merkittävästi. ECH:lla, kuten on esitetty kuvioissa 7A-H. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että muilla luonnollisilla yhdisteillä, kuten ohran beeta-glukaanilla, on sydäntä suojaavia vaikutuksia lisäämällä MnSOD:n ekspressiota,48,49, ja MnSOD:n nousu liittyy lisääntyneeseen sydänlihaksen kapillaaritiheyteen ja VEGF-ilmentymiseen. Suoritimme RT-PCR:n VEGF:n ilmentymisen havaitsemiseksi, tiedot ovat yhdenmukaisia ​​histologisen värjäytymisen löydön kanssa, mikä tarkoittaa, että ECH voi edistää angiogeneesiä ja lisätä sydänlihaksen kapillaaritiheyttä säätelemällä VEGF:n ilmentymistä, kuten kuvassa 7I esitetään. Tässä tutkimuksessa havaitaan, että ECH voi suojata ja lisätä sydänlihaksen hiussuonia ja valtimoita säätelemällä SIRTI/FOXO3a/MnSOD-reittiä ja VEGF:n ilmentymistä, mikä tukahduttaa lepotilassa olevaa sydänlihasta ja parantaa sydämen toimintaa.

Cistanche osallistuutoparantaa sydämen toimintaa.

Saat lisätietoja napsauttamalla tätä.

On huomattava, että kardiomyosyyttien apoptoosin tiedetään hyvin olevan tärkeä patologinen muutos sydämen vajaatoiminnassa, ja tämä tutkimus todellakin vahvistaa, että suuri määrä apoptoottisia soluja HF-rotissa ja ECH:ssa vähentää merkittävästi apoptoosia säätelemällä SIRTI/FOXO3a/MnSOD-reittiä ja estämällä. mitokondrioiden oksidatiivinen stressi, kuten edellä mainittiin.

Ennen kaikkea ECH kääntää sydänlihaksen uudelleenmuotoilun ja parantaa sydämen toimintaa säätelemällä SIRT1/FoxO3a/MnSOD-signalointiakselia, mikä estää mitokondrioiden oksidatiivista stressiä ja vähentää lepotilassa olevaa sydänlihasta. Siten ehdotetaan, että ECH on mahdollinen lääke sydänlihaksen uudelleenmuodostumisen ja sydämen vajaatoiminnan ehkäisyyn tai hoitoon.