Ekinakosidi hidastaa ihmisen fibroblastisten solujen vanhenemista MRC{0}}

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Cistanchen aktiivinen ainesosa: Miten echinacosidi estää ikääntymistä?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

Tässä tutkimuksessa tutkittiin ekinakosidin, yhden perinteisen kiinalaisen yrttilääkkeen Cistanches salsan varsista eristetyistä fenyylietanoideista, vaikutuksia ihmisalkion keuhkojen fibroblastisiin MRC{0}}-soluihin. Solujen lisääntymisen aktiivisuus arvioitiin Alamar Bluella, mikä osoitti, että ekinakosidihoito voi hidastaa vanhenemista. Virtaussytometrian tulokset osoittavat, että ekinakosidi voi laukaista G1-vaiheen solut siirtymään S-faasiin ja G2-faasiin ja voisi parantaa ROS:n hajoamista. Komeettatestin tulokset osoittavat, että ekinakosidi voisi suojata soluja DNA-vaurioilta, mikä osittain selittää sen vaikutusmekanismia. Kaikki yllä olevat tulokset viittaavat siihen, että ekinakosidilla on mahdollista vanhenemista estävää aktiivisuutta.

Cistanche deserticolalla on monia vaikutuksia, napsauta tästä saadaksesi lisätietoja

1. Esittely

Normaalit in vitro viljellyt solut lisääntyvät rajoitetun määrän populaatioiden kaksinkertaistumiseen ("Hayflflick-raja") ja siirtyvät replikatiivisen vanhenemisen vaiheeseen. Vanhenevat solut läpikäyvät solukasvupysähdyksen G1-vaiheessa ja muutoksen morfologiassa ja aineenvaihdunnassa, mukaan lukien solujen laajentuminen, lisääntynyt lysosomien biogeneesi ja korkeamman galaktosidaasiaktiivisuuden ilmentyminen pH:ssa 6 (vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasi, SA- - -Gal) ) (Hayflflick ja Moorhead 1961; Dimri 1995). Vanhenevien solujen kertyminen ennustaa ikääntymiseen liittyvää vähenemistäkudosta/uruttoimintoja. Pyrkimykset löytää aktiivisia ikääntymistä estäviä aineita ei ole koskaan lakannut, jotta ikääntymisen hidastamiseen tai kääntämiseen päästään.Ekinakosidion yksi fenyylietanoideista, jotka on eristetty varrestaCistanches salsa, perinteinen kiinalainen kasviperäinen lääke, jolla on potentiaalisia biologisia vaikutuksia sekä antiseerumina ettäväsymystä vastaanaine (Deng et ai. 2004; Xiong et ai. 1996). Sen on myös raportoitu käyttäytyvän in vitro voimakkaanavapaaradikaaliraadonsyöjä(Facino et ai. 1995) ja näyttelyitähermoja suojaavatoimintaain vitro ja in vivo (Koo et al. 2005; Geng ym. 2007). Ekinakosidi voi olla ehdokas ikääntymistä estäväksi aineeksi, ja ikääntymistä estävä vaikutus voi olla yksi sen biologisista ominaisuuksista. Käsittelimme siis ikääntyvää ihmisalkion keuhkojen fibroblastista solulinjaa MRC-5 ekinakosidilla, odottaen, että se voisi hidastaa tai kääntää vanhenemisen.

2. Tutkimukset ja tulokset

Ensinnäkin lisäsimme ekinakosidia elatusaineeseen tarkistaaksemme sen vaikutuksen solujen kasvuun ja solusykleihin. Havaittiin, että solujen elinkelpoisuus 48 tunnin ekinakosidille altistuessa kasvoi selvästi verrattuna kontrolliin, kun pitoisuus kasvoi (kuvio 1A), mikä osoittaa, että ekinakosidi auttoi vanhenevia soluja lisääntymään. SA-Gal-värjäyksen tulos osoitti, että SA-Gal-taso laski selvästi ekinakosidikäsittelyn jälkeen (tietoja ei esitetty), mikä viittaa siihen, että osa vanhenevista soluista oli käänteinen vanhentumisesta. Sen varmistamiseksi, että ekinakosidi todellakin pakotti vanhenevat solut lisääntymään, otettiin käyttöön sytometria, jolla tarkistettiin vanhenevien MRC-5-solujen solusyklin faasimuutos ekinakosidikäsittelyn jälkeen. Tutkimuksessamme havaitsimme, että ekinakosidin pitoisuuden kasvaessa solujen suhdetta G1-jaksolla pieneni asteittain. Päinvastoin, enemmän soluja ajettiin siirtymään S- ja G2-faasiin (kuvio 1B). Vanhenemiseen liittyvien heterokromatiinipesäkkeiden (SAHF) kerääntyminen on toinen ikääntyvien solujen spesifinen biomarkkeri (Shay ja Wright 2001). Vanhenevat solut näyttivät pisteytettyjä DNA-pesäkkeitä, jotka visualisoitiin Hoechst-värjäyksellä (kuvio 1C). Sitä vastoin ekinakosidilla käsitellyissä MRC-5-soluissa näytti olevan vähemmän SAHF:ää.

Reaktiivisten happilajien (ROS) taso nousee solujen lähestyessä Hayflflick-rajaa (Hutter et al. 2002). Jatkuva solujen käsittely, joissa ROS-tasot ovat subletaalit, ei ainoastaan ​​lisää oksidatiivisten vaurioiden, kuten lipofussiinin, tasoa (Sitte et al. 2001), vaan myös aiheuttaa pysyvää kasvupysähdystä, johon liittyy p53-kasvua estävän aineen aktivoituminen. polku (Toussaint et al. 2000). Siksi solutasolla ROS:lla on keskeinen rooli vanhenemisen indusoinnissa. FL-fluoresoivaa väriainetta DCFH-DA käytettiin mittaamaan ROS-pitoisuudet muiden sytometrian avulla. Osoitettiin, että verrokkiin verrattuna ROS-pitoisuus laski selvästi soluissa, joita oli inkuboitu ekinakosidin kanssa (kuvio 2A). Nämä tulokset osoittavat senekinakosidisaattaa toimia antioksidanttina, mikä vähentää ROS:n tuotantoa tai nopeuttaa ROS:n poistoa.

Kertyneet reaktiiviset happilajit (ROS) aiheuttavat huomattavaa heikkenemistä soluissa olevien makromolekyylien, mukaan lukien proteiinien, DNA:n ja telomeerien, toiminnassa (Kovtun et al. 2007). Oksidatiiviset DNA-vauriot laukaisevat p53-riippuvaisen G1-kasvupysähdyksen p21Waf-1/SDI-1/Cip1:n ilmentymisen (Chen et al. 1998) ja solujen vanhenemisen jälkeen normaaleissa ihmisen fibroblasteissa. Käytimme komeetta määrittämään DNA-vaurion ja sen korjauksen. DNA-fragmenttien koko ja katkosten lukumäärä määräävät komeetan vaeltamisen ja kuvion. Hännän DNA-pitoisuus (hännän pituuden ja hännän DNA-sisällön tulo) kasvaa vaurion myötä. Tuloksemme osoittavat, että esikäsittely ekinakosidilla voi osittain edistää DNA-vaurioiden korjaamista, ainakin suojata soluja H2O2:n aiheuttamilta DNA-vaurioilta (kuva 2B). Näiden tosiasioiden perusteella päättelemme, että ekinakosidilla on vanhenemista estävää aktiivisuutta ainakin MRC-5-soluissa. Tutkimuksemme tulokset osoittavat, että ekinakosidi voi vähentää ROS:n kertymistä, suojata soluja DNA-vaurioilta, edistää MRC-5-soluja G1-vaiheesta S- ja G2-vaiheisiin ja siten parantaa solujen lisääntymistä. Yleisesti ottaen ekinakosidin vaikutukset MRC{16}}-soluihin voidaan jakaa kahteen osaan: solujen lisääntymisen edistämiseen ja ROS-kertymän vähentämiseen. Vaikka solujen vanhenemisen tarkkaa mekanismia ei vielä tunneta ja solusyklin säätelyverkosto on edelleen kiistanalainen, olemme osoittaneet, että ekinakosidi voi suojata soluja oksidatiivisilta vaurioilta. Siksi spekuloimme sitäekinakosidisaattaa olla hyvä ehdokas ikääntymisen säätelyyn, vaikka tarkka taustamekanismi on edelleen avoin kysymys ja lisätutkimukset ovat käynnissä.

3. Kokeellinen

3.1. Soluviljely ja hoito

Ihmisalkion keuhkojen fibroblastista solulinjaa MRC{{0}} (Institute of Biochemistry and Cell Biology, SIBS, CAS) pidettiin muokatussa välttämättömässä elatusaineessa (Gibco/BRL) ja sitä täydennettiin 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla. MRC-5 -solut läpikäyvät replikatiivisen vanhenemisen useiden solujen siirrosten jälkeen, mikä arvioidaan aineenvaihdunnan hidastumisella ja jakautumisen lakkaamalla 7 päivän sisällä. Kaikki viljelmät ympättiin solutiheydellä 104/cm2, ellei toisin mainita, ja niiden annettiin lisääntyä häiriintymättä 7 päivää. Erilaisia ​​ekinakosidipitoisuuksia lisättiin 48 tuntia ennen tutkimusta liuottimen kanssa kontrollina, ellei toisin mainita. DMSO:n pitoisuus viljelmissä oli alle 0,3 % (v/v). H202-käsittelyä varten soluja indusoitiin 250 M H202:lla 12 tunnin ajan.

3.2. Eloonjäämisprosenttimääritys

Soluja viljeltiin ja käsiteltiin ekinakosidilla 96-kuoppaisilla levyillä. Ennen havaitsemista 10 % Alamar BlueTM lisättiin alustaan ​​ja inkuboitiin 4 tuntia. Absorbanssi mitattiin spektrofotometrillä.

3.3. Virtaussytometrinen analyysi

Virtaussytometria otettiin käyttöön DNA-sisällön ja solunsisäisten ROS-tasojen mittaamiseksi käyttämällä propidiumjodidia ja vastaavasti DCFH-DA:ta. Solut maljattiin tiheydellä 105 solua/10 ml soluliuosta halkaisijaltaan 100 mm:n maljoihin ja niitä täydennettiin ekinakosidilla 48 tunnin ajan solujen kylvämisen jälkeen. 48 tunnin käsittelyn jälkeen solut kerättiin ja pestiin PBS:ssä sentrifugoinnin jälkeen, sitten uudelleensuspendoitiin PBS-liuokseen, jossa oli 0,1 % RNaasi ja 50 g/ml propidiumjodidia tai viljelyväliaine, joka sisälsi 10 M DCFH-DA:ta 30 minuutin ajan. DNA- tai ROS-pitoisuudet määritettiin sitten FL-fluoresenssiaktivoidulla solulajittelulla Beckman Coulter Flow Cytometry System -järjestelmässä. Tiedot analysoitiin MultiCycle-ohjelmistolla.

3.4. Hoechst-värjäys

Soluja viljeltiin ja käsiteltiin ekinakosidilla 48 tuntia 96-kuoppaisella levyllä. Väliaine poistettiin, solut pestiin PBS:llä, kiinnitettiin sitten 4-prosenttisella formaldehydillä PBS:ssä 20 minuutin ajan, mitä seurasi pesu kerran PBS:llä ja värjättiin Hoechst-värillä 10 minuutin ajan. Kuvia otettiin talteen.

3.5. Yksisoluinen geelielektroforeesi (komeettamääritys)

Komeettamääritys suoritettiin raportoidulla tavalla (Olive ja Banath 2006). Yksittäiset komeettakuvat analysoitiin CometScore-ohjelmistolla. Kiitokset: Tätä työtä tukivat taloudellisesti Kiinan kansallinen perustutkimusohjelma (973 Project) (nro 2007CB507406), Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (nro 30572341) ja Tsinghua-Yue-Yuenin lääketieteen rahasto (THYY20070008). ).