Sairauksien mallinnus munuaisen organoideilla

Abstrakti:Munuaissairaudetusein puuttuu optimaalinen hoito, mikä aiheuttaa miljoonia kuolemia joka vuosi. Siten kehitetään sopivia mallijärjestelmiä tutkittavaksiihmisen munuaissairauson äärimmäisen tärkeää. Jotkut lupaavimmista ihmisen munuaismalleista ovat organoideja tai pieniä elimiä muistuttavia kudosryhmiä, jotka on johdettu ihmisen indusoimista pluripotenteista kantasoluista (hiPSC). Ne kuitenkin muistuttavat enemmän ensimmäistä kolmannestasikiön munuainenkuin aikuisen munuainen. Siksi tarvitaan uusia strategioita kypsyyden edistämiseksi. Heillä on suuri potentiaali sairauden mallintamiseen ja lopulta apuhoitoon, jos he voivat saavuttaa kypsyydenaikuisen munuainen. Tässä katsauksessa käsittelemme munuaisten organoidien nykytilaa niiden samankaltaisuuden suhteen ihmisen munuaisen kanssa ja tähänastiseen käyttöön sairauden mallinnusjärjestelmänä. Keskustelemme sitten mahdollisista tavoista edistyämunuaisten kypsyysOrganoidit sopivat aikuisen munuaiseen tarkempaan ihmisen sairauksien mallintamiseen.

Avainsanat: organoidit;munuainen; kehittäminen; metanefros; virtsaputken; tubulus; siru; nefrologia; sairauden mallinnus

NAPSAUTA TÄSTÄ SAATAksesi CISTANCHE CKD-HOITOJEN VARTEN

1. Esittely

Viime aikoihin asti ihmisten sairauksia on mallinnettu kahdella tavalla: eläimillä tai kaksiulotteisella soluviljelmällä. Eläinmallit mahdollistavat sairauksien kulkureittien ja lääkekehityksen tutkimisen kokonaisissa organismeissa, mutta ne eivät ota huomioon ihmisen geneettistä ja anatomista rakennetta. Toisaalta ihmisen soluviljelmän avulla tutkijat voivat tutkia ihmiskohtaisia ​​sairausmekanismeja ja arvioida hoitoja suureen ja tarkaan molekyylisyvyyteen. Soluviljelmä ei kuitenkaan kokoa yhteen elimen monimutkaista kolmiulotteista rakennetta ja fysiologiaa.

Ihmisen organoidit ovat yksinkertaistettuja versioita ihmisen elimistä, joilla on realistinen kolmiulotteinen mikroanatomia ja elintason toiminnot (esim. kyynelten tuotanto maitosoluissa ja karvojen kasvu ihon organoideissa) [1,2]. Itseorganisaatioprosessien kautta niitä johdetaan in vitro kudossoluista tai pluripotenteista kantasoluista. Takahashin ja Yamanakan vuonna 2008 keksimät indusoidut pluripotentit kantasolut (iPSC:t) ovat suosituimpia soluja organoidien muodostuksessa [3]. Tämä johtuu useista vakuuttavista eduista, joita iPSC:t tarjoavat. Ensinnäkin ne tarjoavat rajoittamattoman uusiutuvan solulähteen ja voivat erottua useiksi solutyypeiksi. Vielä tärkeämpää on, että ne edustavat potilaiden taustalla olevaa geneettistä koostumusta. Siten potilaasta peräisin olevia ihmisen iPSC:itä (hiPSC:itä) voidaan käyttää sairauksien tutkimiseen organoidien kautta yksilötasolla, mikä mahdollistaa henkilökohtaisen lääketieteen edistymisen. Tähän mennessä sairauksien tutkimiseen on käytetty organoidimalleja eri ihmiselimistä, kuten sydämestä ja aivoista. Tässä katsauksessa keskitymme munuaisten organoideihin ja keskustelemme siitä, kuinka niitä voidaan käyttää mallintamaan ihmisen munuaista ja siihen liittyviä sairauksia, seulomaan lääkkeiden toksisuutta ja ehkä täydentämään munuaisten toimintaa.

Munuaissairaus vaikuttaa 10 prosenttiin maailman väestöstä [4]. Huolimatta monien munuaissairauksien taustalla olevan geneettisen syyn tunnistamisesta, niiden hallitsemiseen ei ole saatavilla optimaalisia hoitoja. Tämä valitettava tilanne heijastaa sellaisten in vitro -mallijärjestelmien puutetta, jotka yhdistävät ihmisen munuaissairauden kohdennettua terapeuttista kehitystä varten. Munuaisorganoidit tarjoavat ihmispohjaisen, personoitavan 3-D-tutkimusalustan geneettisten munuaissairauksien, munuaisvaurioiden ja lääketoksisuuden tutkimiseen. Sen lisäksi, että se toimii mallinnusjärjestelmänä, munuaisen organoidilla on potentiaalia edistää elinsiirtolääkettä. Siten maksimoidakseen potentiaalinsa molemmilla näillä kentillä munuaisen organoidin on muistutettava aikuisen ihmisen munuaisen rakennetta ja toimintaa. Tässä tarkastellaan pluripotenttisoluperäisen ihmisen munuaisorganoidin nykytilaa, sen mahdollisia käyttötarkoituksia ja parannuskohteita.

2. Ihmismunuaiset vs. munuaisen organoidit

HiPSC:t toimivat alkion PSC:iden välityspalvelimena. Siten munuaisorganoidin muodostaminen hiPSC:istä edellyttää ihmisen alkion munuaiskehityksen replikoitumista. Alla tutkimme, kuinka munuaisen organoidi kehittyy ja vertaamme sitä ihmisen munuaiseen.

2.1. Ihmisen munuaisten kehitys

Veri suodatetaan kolmessa eri vaiheessa alkion kehityksen aikana. Ensimmäisessä vaiheessa pronefros-niminen rakenne kehittyy 4-viikon ikäiseen ihmisalkioon ja käsittelee verta kohdunkaulan alueella noin viikkoon 5 asti [5]. Seuraavaksi mesonefros muodostuu alkion rintakehään ja suodattaa veren alkionkehityksen viikon 5 alusta noin viikkoon 10. Kun mesonefros suodattaa verta, lopullinen suodatusjärjestelmä, josta tulee lopultaaikuisen munuainen, alkaa muodostua (kuva 1). Se muodostuu seuraavista kahdesta osasta: metanefrisestä mesenkyymistä ja virtsanjohtimen silmusta. Metanefrinen mesenkyymi muodostaa nefronin kaikki osat keräyskanavaa lukuun ottamatta, kun taas virtsanjohtimen silmu muodostaa keräyskanavan. Nämä rakenteet käyvät läpi vastavuoroisen induktiosyklin, jossa metanefrinen mesenkyymi ja virtsanjohtimen silmu stimuloivat toistensa kasvua ja sulautuvat yhteen muodostaen rakenteen, jota kutsutaan metanefrokseksi. Äskettäin muodostunut metanefroi suodattaa verta suoliluun haaroista alas lantion alueelle. Samaan aikaan virtsanjohtimen silmu haarautuu ja jatkaa haarautumista muodostaen useita keräyskanavia munuaiseen [6,7]. Myöhemmin nämä fuusioituneet metanefriset rakenteet nousevat alkion vatsan alueelle sen kehittyessä ja muodostavat verenkiertoa primitiivisestä aortasta. Nämä prosessit on tiivistetty kuvassa 1. On tärkeää huomata, että metanefriset mesenkyymi- ja virtsanjohtimen silmusolut ovat primitiivisiä ja säilyttävät siten monipotenttipotentiaalin, kun taas aikuisen erilaistuneet munuaissolut ovat sitoutuneet tiettyyn sukulinjaansa [8].

Kuva 1. Ihmisen virtsajärjestelmän kehitys viikoilla 4–9 kohdussa.

2.2. Protokollat ​​munuaisorganoidien tuottamiseksi

Munuaisen organoidit voidaan muodostaa kudosperäisistä erilaistuneista soluista tai pluripotenteista kantasoluista. Munuaisen organoidin kehittämiseksi kudosperäisistä soluista voidaan järjestää erilaistuneita aikuisia soluja kolmiulotteiseen tilaan ex vivo jäljittelemään ihmisen elinarkkitehtuuria [9]. Kudosperäisten erilaistettujen solujen organoidiprotokollat ​​käsitellään muualla. Tässä katsauksessa keskitymme kantasoluista peräisin oleviin munuaisorganoideihin. Näiden järjestelmien luomiseksi tutkijat voivat viljellä pluripotentteja kantasoluja munuaisspesifisten endogeenisten morfogeenien ja solunulkoisten komponenttien läsnä ollessa. Kantasolut voivat sitten kokoontua itsestään munuaisen kaltaisiin rakenteisiin jäljittelemällä alkion munuaisten kehitystä. Elimissä, kuten suolistossa, on aikuisen kudoksen endogeenisiä kantasolupopulaatioita, joiden avulla tutkijat voivat luoda organoideja [10]. Koska ei ole kuitenkaan saatu selviä todisteita siitä, että aikuisen ihmisen munuaisissa olisi kantasolurako, kantasoluista johdettuja munuaisorganoideja on valmistettava pluripotenteista kantasoluista (joko alkion tai hiPSC:stä) [11].

Kantasoluista peräisin olevat munuaisen organoidit voidaan luokitella kahteen luokkaan: nefroni-progenitori (NP) organoidit ja virtsaputken silmujen (UB) organoidit. Molemmat organoidityypit ovat vakiintuneet tautimalleina. NP-organoidit muistuttavat metanefrista mesenkyymiä, joka sisältää multipotentteja NP-soluja. Itse asiassa yksi metanefrinen mesenkymaalinen solu voi synnyttää nefronin kaikki epiteelisolut keräyskanavaa lukuun ottamatta [8]. Menetelmiä hiPSC-peräisten NP-organoidien luomiseksi ovat 2D-viljelmä, jonka jälkeen aggregaatio tapahtuu huokoisessa transwell-levyssä (esim. Takasato et al. (2016), Morizane et al. (2015)) tai 3D-viljely hydrogeelissä (esim. Freedman et al. (2015)) [12–14]. Nämä organoidit kehittävät glomerulaarisia ja putkimaisia ​​rakenteita. Takasaton ja Morizanen kahdesta suosituimmasta NP-protokollasta johdettuja NP-organoideja verrattiin laajassa omiikka-analyysissä Wu et al. (2018) [15]. He havaitsivat, että vaikka Takasato-protokolla tuottaa noin 11 % podosyyttien kaltaisia ​​soluja ja 21 % kohteen ulkopuolisia soluja organoidia kohden, Morizan-protokolla tuottaa noin 28,5 % podosyyttien kaltaisia ​​soluja ja 14,3 % kohteen ulkopuolisia soluja [15]. Takasaton organoidit näyttävät myös kehittävän pienen määrän UB:n kaltaisia ​​alueita, mutta pääasiassa jäljittelevät metanefrista mesenkyymiä, joten ne luokitellaan NP-organoideiksi [12]. Lisäksi Morizane et ai. (2015) ja Takasato et al. (2016) protokollista puuttuu solunulkoinen hydrogeeliympäristö, joka on läsnä Freedmanin ym. (2015) työssä [14]. Garreta et ai. (2019) väittävät, että hydrogeelin läsnäolo organoidimuodostuksessa parantaa munuaisen rakenteen muodostumista ja tehostaa varhaisten IM-merkkien, posterioristen IM-markkerien ja anterioristen IM-markkereiden tuotantoa [16].

Toisin kuin NP-organoidit, UB-organoidit jäljittelevät virtsaputken silmua, joka synnyttää keräyskanavajärjestelmän. Menetelmiä UB-organoidien tuottamiseksi on kehitetty äskettäin, ja niihin kuuluu alkioiden viljely ja myöhempi aggregaatio heikosti tarttuviin kuoppiin [17]. Näillä organoideilla on putkimaiset ja keräyskanavarakenteet. Lopuksi, NP- ja UB-organoidit on myös yhdistetty korkeamman asteen yhteisviljelyrakenteiden luomiseksi aikuisen ihmisen tiivistämiseksimunuaisten fenotyypit[17]. Suosituimmat protokollat ​​formunuaisten organoidiKuvassa 2 on yhteenveto alla [12–14,17–19].

Kuva 2. Yhteenveto suosituimmista organoidin muodostumisprotokollista

2.3. Kuinka ne kerääntyvät: Munuaisten organoidit vs. ihmisen munuaiset

Yllä kuvatut protokollat ​​sisältävät ensisijaisesti hiPSC:iden itsensä kokoamisen organoideiksi. Ne jäljittelevät sikiön olosuhteita saadakseen hiPSC:t erilaistumaan munuaisspesifisiksi linjoiksi ja muodostamaan munuaisspesifisiä rakenteita. Ensimmäinen sikiön tila, jonka he replikoivat, on primitiivinen juovamerkinanto. Alkukantainen juova on alkion osa, joka kehittyy ennen kuin kolme alkiokerrosta eroavat toisistaan. Useimmat protokollat ​​tekevät tämän käyttämällä WNT-signalointiagonistia CHIR. Seuraavaksi NP-linjan johtamista varten on indusoitava posterior-intermediate mesoderm (PIM) ja UB-linjalle anterior-intermediate mesoderm (AIM) [17]. Mielenkiintoista on, että Takasato et ai. (2015) havaitsivat, että mitä pidempi CHIR:n antojakso, sitä enemmän takaosan kaltainen mesoderma kehittyi, kun taas mitä lyhyempi jakso, sitä enemmän etuosan kaltainen mesoderma kehittyi [20]. Siten lisääntynyt WNT-signaloinnin kesto johtaa enemmän glomerulaarisen ja proksimaalisen rakenteen muodostumiseen, ja lyhentynyt WNT-signaloinnin kesto johtaa distaalisen rakenteen syntymiseen.

NP-protokollan päätyttyä kehittyvät organoidit, joissa on sekä glomerulaarisia että tubulaarisia alueita. He ovat kuitenkin kypsymättömiä. Tutkimukset ovat osoittaneet, että hiPSC-peräiset munuaisen organoidit jäljittelevät ensimmäisen raskauskolmanneksen sikiötä [20]. Subramanian et al. teki yhden laajimmista analyyseistä tästä aiheesta. (2019), joka käytti RNA-seq:a vertaamaan munuaisten organoideja 8-viikon, 17-viikon ja aikuisen ihmisen munuaisiin. He päättelivät, että munuaisten organoidit ovat samankaltaisempia kuin ihmisen munuaiset sikiön viikoilla 8 ja 17 kuin aikuisen munuaisissa [21]. Lisäksi munuaisten organoidit osoittavat primitiivisten multipotenttien markkerien, kuten SIX2+ värjäytymistä koko munuaisessa, kun taas aikuisen erilaistunut ihmisen munuainen ei ilmennä tällaisia ​​markkereita [22]. Siksi munuaisen organoidin käyttäminen aikuisen ihmisen munuaisen välityspalvelimena sairauden tutkimiseen, sen on edettävä raskausiässä.

Munuaisen organoidit eivät ehkä ainoastaan ​​jäljittele varhaista metanefroosia tarkemmin kuin oikea aikuisen ihmisen munuainen, vaan ne voivat muistuttaa jopa enemmän mesonefrosta kuin metanefrosta, jos morfogeenin pitoisuutta säädellään väärin [23]. Tsujimoto et al. (2020) tutki in vitro hiPSC:n erilaistumista mesonefrisiksi NP:iksi, metanefrisiksi NP:iksi ja UB-soluiksi [24]. Tässä tutkimuksessa tunnistettiin useita tekijöitä, jotka erottavat nämä kolme sukulinjaa, ja niitä voidaan siten soveltaa näiden kolmen erillisen järjestelmän tulevaan tutkimukseen [24]. Muita tärkeitä edistysaskeleita organoidikypsymisessä ovat NP-UB-vuorovaikutukset ja vaskularisaatio. Jotkut merkittävimmistä tutkimuksista näiden ongelmien ratkaisemiseksi suorittivat Taguchi ja Nishinakamura (2017) sekä Tsujimoto et al. (2020) [17,24]. Nämä tutkimukset tuottivat MM-UB-yhteisviljeltyjä organoideja ja siirrettiin ne hiiriin, joissa ne verisuivat. Näiden metanefristen korkeamman asteen rakenteiden luominen edistyi merkittävästi kantasoluista peräisin olevan munuaisen rakenteen kaltaiseksi todellisten ihmisen munuaisten kanssa. Kuitenkaan edes nämä kehittyneet järjestelmät eivät kyenneet toistamaan laajempaa UB-haaroittumista, joka tapahtuu koko toisen ja viimeisen kolmanneksen aikana in vivo [24]. Nämä havainnot korostavat tarvetta toistaa endogeenisiä kypsiä munuaisten toimintoja ja vuorovaikutuksia, joita nykyisiltä organoideilta puuttuu, kuten nestevirtausta.

3. Munuaisen organoidit mallijärjestelminä

Munuaisten organoidien samankaltaisuus ihmisen munuaisiin tekee niistä sopivia sairauksien mallintamiseen ja lääkeseulontaan. Ne voidaan valmistaa alle kuukaudessa, räätälöidä yksilölle ja tuottaa irtotavarana [12–14,17–19]. Lisäksi niitä voidaan viljellä in vitro tai siirtää hiiriin, rottiin tai kananmuniin täydellisten in vivo -mallien muodostamiseksi. Alla tutkimme analyyseja, joita voidaan tehdä munuaisorganoideilla, sekä munuaisorganoidien nykyisiä ja tulevia käyttöjä biolääketieteellisessä tutkimuksessa.

3.1. Munuaisen organoidianalyysi

3.1.1. In vitro -määritykset

Erilaisia ​​fysiologisia, molekyyli- ja toiminnallisia määrityksiä voidaan suorittaa munuaisten organoideille. Mitä tulee molekyylimäärityksiin, erilaisia ​​transkriptomisia analyysejä on suoritettu menestyksekkäästi munuaisten organoideissa [25]. Esimerkiksi Takasato et ai. (2015) erotti RNA:ta organoideista ja suoritti RNA-sekvensoinnin ja qRTPCR-analyysit [20].

Muut, kuten Wu et ai. (2018) ovat suorittaneet ytimien eristämisen ja snRNA-sekvensoinnin DropSeg scRNA-sekvensoinnin lisäksi munuaisorganoideissa. RNA-tasojen lisäksi erilaisia ​​proteiinitasoja on kvantifioitu ja verrattu munuaisorganoidilysaatista immunoblotilla (esim. Cruz et al., 2017; Morais et al., 2022) [26,27]. Lisäksi immunosytokemiallinen analyysi on suoritettu rutiininomaisesti munuaisten organoideissa spesifisten nefronirakenteiden tutkimiseksi. Tämä suoritetaan usein koko organoidivärjäyksenä; vaihtoehtoisesti kudosleikkeitä on käytetty myös koettamiseen (esim. Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20,26). Nämä tutkimukset ovat paljastaneet, että munuaisten organoideissa on glomeruluksia, proksimaalisia tiehyitä, distaalisia tiehyitä, tyvikalvoja ja keräyskanavajärjestely (20,27]). Alla olevassa kuvassa 3 on esimerkki parafiiniin upotetuista ja leikatuista ihmisen munuaisen organoideista, jotka on luotu käyttämällä Takasato et al.:n (2016) protokollaa (12) Leike värjätään glomerulaarisen, proksimaalisen tubuluksen ja distaalisen tubulusmarkkeriproteiineja ja siinä on jatkuvia munuaiskeräsistä distaaliseen tubulukseen nefronisia rakenteita. Rakenteiden lisäksi munuaisen organoideissa tiedetään olevan myös verisuonia. Se on kuitenkin rajallinen, nopeasti taantuva eikä organisoitu kuten tyypillisessä munuaisessa (28]).

Useita toiminnallisia määrityksiä voidaan myös suorittaa munuaisten organoideissa. Esimerkiksi, kuten Freedman et ai. (2022), munuaisorganoidit voidaan altistaa pulssi-chase-määrityksille, joissa erilaisia ​​fluoresoivia molekyylejä voidaan lisätä väliaineeseen ennen kuin ne korvataan uusilla fluoresoimattomilla väliaineilla [29]. Organoideista voidaan sitten analysoida näiden molekyylien otto, ja saatua tietoa voidaan käyttää päättelemään tietoja kerääntymisestä, turpoamisesta, suodattumisesta, endokriinisestä tai vauriosta [29]. Yksi tämän määrityksen ongelmista organoidialustalla on kuitenkin se, että molekyylejä voidaan viedä ulkoisesti suljettuihin putkimaisiin rakenteisiin sen sijaan, että ne kulkevat apikaalisen pinnan läpi, kuten tapahtuisi in vivo. Näin ollen fluoresoivat molekyylit voivat imeytyä ulkopuolelta basolateraalisesta kalvosta, koska ei ole mitään keinoa hallita, minne nämä molekyylit voivat mennä, kun niitä viedään karkeasti väliaineeseen. Lisäksi molekyylien kuljetusta voidaan rajoittaa diffuusiolla organoideissa, mikä luo erilaisia ​​suuntauksia kertymiseen saman organoidin sisällä.

Lisäksi munuaisten paranemista voidaan arvioida myös organoidisissa alustoissa, mikä mahdollistaa käsityksen munuaisvaurion palautusmekanismeista ja geneettisestä perustasta, jotka voivat altistaa potilaat munuaissairauksille. Esimerkiksi tutkimukset, kuten Gupta et ai. (2022) ovat tutkineet geenireittejä, jotka lisääntyivät, kun sisplatiinille, munuaisvauriomolekyylille, oli yksi tai useampi altistuminen munuaisten organoidialustalla [30]. Lopuksi kystojen muodostumista voidaan analysoida organoideissa polykystisen munuaissairauden (PKD) tutkimiseksi cAMP-aktivaation kautta [26]. Kystat voidaan sitten mitata, kvantifioida ja niitä voidaan käsitellä ihmisen munuaiskystojen välityspalvelimena.

3.1.2. In vivo -analyysi

Merkittävä haittapuoli in vitro munuaisorganoidien käyttämisessä mallijärjestelmänä on niiden vuorovaikutuksen puute muun organismin kanssa. Lukuisat olosuhteet, jotka vaikuttavat kehon syrjäisiin osiin, voivat vaikuttaa munuaisiin ja päinvastoin. Esimerkiksi verenpaineen muutokset voivat muuttaa radikaalisti glomeruluspainetta, jota munuaiset voivat puolestaan ​​säädellä. Organoidijärjestelmät eivät kuitenkaan ota huomioon näitä systeemisiä vuorovaikutuksia in vitro. Siten on tutkittu siirtomenetelmiä, joihin liittyy ihmisperäisiä munuaisorganoideja hiirissä, rotissa ja kananmunissa. Tällaisissa tutkimuksissa ihmisen ja eläimen kudokset erotetaan ihmisen ydinantigeenin immunovärjäyksellä tai Y-kromosomin lukukohdistus yhdistetyn genomiviitteen kanssa [21]. Lisäksi organoidit voidaan siirtää rakennustelineen (esim. silkki) kautta, jotta saadaan aikaan korkeampi rakenteellinen eheys [31]. Tämä lähestymistapa voi mahdollistaa helpompia organoidikudosspesifisiä analyyseja transplantaation jälkeen.

Munuaisten organoidien siirtämisen tärkein etu on, että sen avulla organoidit verisuivat, kypsyvät ja jopa suodattavat virtsaa. Van den Berg et ai. (2018) ovat osoittaneet, että subkapsulaarisen munuaisensiirron jälkeen hiiriin munuaisten organoidikeräset ja tubulukset kypsyvät merkittävästi [32]. Toisessa tutkimuksessa Subramanian et ai. (2019) ovat osoittaneet, että hiPSC-peräisten organoidien siirtäminen hiiriin johtaa lisääntyneeseen proksimaaliseen ja distaaliseen tubulusten kypsymiseen ja kohdesolupopulaatioiden vähentymiseen organoidissa [21]. Vielä tärkeämpää on, että transplantaation jälkeen munuaisten organoidit voivat suorittaa munuaisen lopullisen tehtävän, suodattaa verta. Hiirten ihonalaisen siirron jälkeen munuaisten organoidit muodostivat virtsaa suodattavia rakenteita, mistä on osoituksena FITC-leimatun dekstraanin siirto [33]. Siten transplantaatio ei ainoastaan ​​mahdollista munuaisen organoidin mutaation vaikutusten tutkimista in vivo, vaan se myös parantaa organoidin samankaltaisuutta ihmisen munuaisen kanssa ja tekee siitä jonkin verran toimivan järjestelmän.

Vaikka immuunipuutoshiiriä käytetään usein hiPSC-munuaisen organoidinsiirtoon, on käytetty myös muita isäntiä, kuten kanan korioallantoiskalvoja (CAM). CAM on luonnostaan ​​immuunipuutos ja edistää organoidin vaskularisointia [16]. Siitä puuttuu kuitenkin tyypillisiä nisäkkään elinjärjestelmiä, mikä tekee munuaisten organoidit irti muista järjestelmistä, toisin kuin hiirissä. Isäntään liittyvistä takaiskuista huolimatta kimeerien muodostuminen ihmisperäisillä munuaisorganoideilla mahdollistaa ihmisen munuaissairauden laajan in vivo -tutkimuksen erittäin vaikuttavalla alustalla.

3.2. Tähän mennessä suoritetut sairauden mallinnustutkimukset

3.2.1. Munuaisorganoidit geneettisten sairauksien malleina

Munuaisorganoideja on käytetty tubulaaristen ja glomerulaaristen geneettisten munuaissairauksien tutkimiseen [26,34,35]. Ihmisillä huomattavimpia tubulaarisia sairauksia ovat lasten polykystinen munuaistauti (PKD), joka johtuu fibrokystisen geenin (PKHD1) autosomaalisista resessiivisistä mutaatioista, ja aikuisten PKD, joka johtuu polykystiinin autosomaalisista dominanteista mutaatioista-1 ja -2 geenit [36–38]. Nämä mutaatiot voidaan viedä keinotekoisesti hiPSC-soluihin geeninmuokkaustekniikoiden, kuten CRISPR-Cas 9 -järjestelmän, avulla. Muokatut hiPSC:t voidaan myöhemmin kasvattaa PKD:tä mallintaviksi ihmisen munuaisorganoideiksi ja analysoida proteiinivärjäyksellä ja RNA-profiloinnilla. Esimerkiksi Freedman et ai. (2015) ja Cruz et ai. (2017) ovat poistaneet polykystiinigeenit hiPSC-linjoista käyttämällä CRISPR/Cas9-järjestelmää ja myöhemmin johtaneet organoideja, jotka jäljittelevät in vivo sairaiden potilaiden kystistä fenotyyppiä [14,26]. Nämä tutkimukset osoittavat, että munuaisten organoideja voidaan käyttää helposti havaittavissa, taudin kannalta merkityksellisinä alustoina PKD:n tutkimiseen. Lisäksi potilasperäisistä solulinjoista valmistetut organoidit mahdollistavat käsityksen potilaskohtaisista mutaatioista ja taudin kehittymisen todennäköisyydestä. Esimerkiksi Low et ai. (2019) kehittivät munuaisorganoideja, jotka olivat peräisin potilaista, joilla oli PKHD1-mutaatioita, ja vertasivat niitä villityypin organoideihin [39]. Sairaat organoidit osoittivat merkittävästi enemmän kystamuodostusta, mikä osoitti munuaisten organoidien potentiaalin ennustaa taudin ilmenemistä genotyypin perusteella [39]. Toisessa tutkimuksessa Hernandez et ai. (2021) johtivat hiPSC:t potilailta, joilla on mutaatioita mukula-skleroosikompleksin -2 geenissä, mikä tekee potilaan alttiiksi munuaiskasvaimen kehittymiselle [40]. Sitten he korjasivat potilaan mutaation CRISPR/Cas9-järjestelmällä. Näistä korjatuista isogeenisistä mutanttilinjoista peräisin olevat munuaisen organoidit osoittivat vähentynyttä kystien muodostumista ja palautuneita geenireittejä sairaisiin organoideihin verrattuna, mikä osoitti munuaisten organoidien hyödyllisyyden tutkittaessa spesifisten mutaatioiden funktionaalisia vaikutuksia isogeenisissä elimen kaltaisissa järjestelmissä.

Tutkijat ovat myös käyttäneet potilaista peräisin olevia organoideja saadakseen tietoa geneettisistä sairauksista, jotka vaikuttavat glomerulukseen. Esimerkiksi Hale et ai. (2018) keskittyi NPHS1 (nefriini) -geeniin, joka mutatoituessaan aiheuttaa viallisen podosyyttijalkaprosessin muodostumisen ja vuotavan virtsan suodatuksen, mikä johtaa munuaissairauteen [34]. Hale et ai. (2018) käyttivät potilaista peräisin olevia mutantteja NPHS1 hiPSC:itä johtamaan munuaisorganoideja, jotka mallinsivat näitä viallisia podosyyttijalkaprosesseja, mukaan lukien podosyyttispesifisten proteiinien, nefriinin ja podosiinin alentuneet tasot [34]. Samoin Freedman et ai. (2015) tyrmäsi glomerulaarisen geenin PODXL hiPSC:issä ja havaitsi, että organoideissa on viallinen podosyytti-podosyyttiarkkitehtuuri [14].

Yksi munuaisten organoidien suurelta osin hyödyntämätön potentiaali on niiden kyky mallintaa alkio- ja sikiövaurioita. Tällä hetkellä tutkijat pyrkivät mallintamaan aikuisen ihmisen munuaista munuaisen organoidilla. Nykyisessä ensimmäisen ja toisen raskauskolmanneksen tilassaan munuaisorganoidia voidaan kuitenkin käyttää munuaisvaurioiden tutkimiseen [41]. Virtsaelinten kehityshäiriöt, kuten munuaisten dysplasia, ovat yksi yleisimmistä ja vakavimmista kehityshäiriöistä [42]. Koska monet näistä sairauksista voidaan havaita jo 11 viikon iässä, munuaisten organoidit soveltuvat erityisen hyvin synnynnäisten munuaisten vajaatoiminnan tutkimiseen. Meillä ei ole vain metanefrisia ensimmäisen ja toisen raskauskolmanneksen kaltaisia ​​munuaisorganoideja, vaan meillä on myös primitiivisiä mesonefrisia munuaissolulinjoja (esim. Tsujimoto et al., 2020) alkion ja sikiön vaurioiden tutkimiseen [24]. Koska harvat järjestelmät mahdollistavat kehittyvän ihmisen munuaisen tutkimisen ja manipuloinnin, munuaisorganoidi mahdollistaa valtavat mahdollisuudet sikiön geneettisiin, toksikologisiin ja kehitystutkimuksiin.

3.2.2. Munuaisten organoidit mallina muille sairauksille

Geneettisten sairauksien lisäksi munuaisten organoideja on käytetty tutkittaessa ihmisen järjestelmien vastetta virusinfektioihin, syöpään ja vammoihin. Esimerkiksi Jansen et ai. (2021) käytti munuaisorganoidialustaa arvioidakseen viruksen SARS-CoV-2 vaikutuksia ihmisen munuaisiin [43]. Tämä ryhmä havaitsi, että SARS-CoV{5}}-infektio johtaa lisääntyneeseen kollageeni-I:n ilmentymiseen ihmisen munuaisten organoideissa, mikä tarjoaa mekaanisen selityksen munuaisvauriolle ja fibroosille, jotka usein liittyvät vakaviin pitkiin COVID-tapauksiin-19 [ 43]. Mitä tulee syöpätutkimukseen, Hernandez et ai. (2021) siirsi munuaisen organoideja immuunivajavaisille rotille mallintaakseen harvinaisia ​​geneettisesti vaikuttavia munuaiskasvaimia. Täällä potilaista peräisin oleville organoideille kehittyi kasvainmaisia ​​vaurioita, mikä toi yhteen ihmisen munuaiskasvaimet [40]. Lisäksi he käyttivät munuaisten organoidipohjaisia ​​kasvainmalleja puolitoiminnallisina ihmisperäisinä rakenteina ja testasivat lääkkeitä ja nanopartikkeleihin perustuvia hoitoja. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että munuaisten organoideja voidaan käyttää munuaisvauriovasteen testaamiseen. Esimerkiksi Prezpiorski et ai. (2022) osoittivat, että munuaisten organoidit tuottavat oksidatiivisen vaurion markkereita ja lisäävät vauriomarkkerin ilmentymistä antamalla munuaisten organoideihin vauriomolekyyliä hemiiniä yhdessä biosensorin kanssa [44].

3.2.3. Munuaisorganoidit huumeiden arvioinnissa

Munuaisten organoideja on sen lisäksi, että ne antavat tietoa sairauksista, lääkkeiden seulonnassa. Erityisesti munuaisten organoideja on käytetty lääkeaineperäisen munuaisvaurion (DIKI) tutkimiseen, joka on akuutin munuaisvaurion johtava syy [45]. Sisplatiinin sivuvaikutusten arvioinnissa Czerniecki et ai. (2018) osoittivat, että munuaisten organoidit ovat hyödyllisiä korkean suorituskyvyn malleina uusien lääkkeiden testaamiseen erilaisissa ihmisgenetiikan joukossa [46].

Muut, kuten Wu et ai. (2018) ovat suorittaneet ytimien eristämisen ja snRNA-sekvensoinnin DropSeg scRNA-sekvensoinnin lisäksi munuaisorganoideissa. RNA-tasojen lisäksi erilaisia ​​proteiinitasoja on kvantifioitu ja verrattu munuaisorganoidilysaatista immunoblotilla (esim. Cruz et al., 2017; Morais et al., 2022) [26,27]. Lisäksi immunosytokemiallinen analyysi on suoritettu rutiininomaisesti munuaisten organoideissa spesifisten nefronirakenteiden tutkimiseksi. Tämä suoritetaan usein koko organoidivärjäyksenä; vaihtoehtoisesti kudosleikkeitä on käytetty myös koettamiseen (esim. Takasato et al., 2015; Cruz et al., 2017) (20,26). Nämä tutkimukset ovat paljastaneet, että munuaisten organoideissa on glomeruluksia, proksimaalisia tiehyitä, distaalisia tiehyitä, tyvikalvoja ja keräyskanavajärjestely (20,27]). Alla olevassa kuvassa 3 on esimerkki parafiiniin upotetuista ja leikatuista ihmisen munuaisen organoideista, jotka on luotu käyttämällä Takasato et al.:n (2016) protokollaa (12) Leike värjätään glomerulaarisen, proksimaalisen tubuluksen ja distaalisen tubulusmarkkeriproteiineja ja siinä on jatkuvia munuaiskeräsistä distaaliseen tubulukseen nefronisia rakenteita. Rakenteiden lisäksi munuaisen organoideissa tiedetään olevan myös verisuonia, mutta se on rajoitettua, nopeasti taantuvaa eikä organisoitunut kuten tyypillisessä munuaisessa (28]).

Kuva 4. Yhteenveto tavoista, joilla munuaisten organoideja voidaan käyttää sairauden mallintamiseen. Yhteenveto tavoista, joilla munuaisten organoideja voidaan käyttää mallintamaan di