Tetrahydrobiopteriinin kohonneen tason havaitseminen ortostaattista intoleranssia sairastavien ME/CFS-potilaiden seeruminäytteistä: Pilottitutkimus

Abstrakti:Myalginen enkefalomyeliitti tai krooninen väsymysoireyhtymä (ME/CFS) on monisysteeminen krooninen sairaus, jolle on ominaista vakava lihasväsymys, kipu, huimaus ja aivosumu. Monet ME/CFS-potilaat kokevat ortostaattista intoleranssia (OI), jolle on tunnusomaista toistuva huimaus, huimaus ja pyörtymisen tunne säilyttäen samalla pystyasennon. Huolimatta intensiivisestä tutkimuksesta tämän heikentävän tilan molekyylimekanismia ei vielä tunneta. OI ilmenee usein sydän- ja verisuonimuutoksina, kuten alentunut aivoverenkierto, alentunut verenpaine ja hidastuva syke. Tetrahydrobiopteriinin (BH4), endoteelin typpioksidisyntaasi (eNOS) -entsyymin olennaisen kofaktorin, biologinen hyötyosuus liittyy tiiviisti sydän- ja verisuoniterveyteen ja verenkiertoon. BH4:n roolin tutkimiseksi ME/CFS:ssä, seeruminäytteet CFS-potilaista (n=32), CFS-potilaista, joilla on vain OI (n=10; CFS + OI) ja CFS-potilaista, joilla on sekä OI että OI pienikuitupolyneuropatia (n=12; CFS + OI + SFN) altistettiin BH4 ELISA:lle. Mielenkiintoista on, että tulokset paljastivat, että BH4:n ilmentyminen on merkittävästi korkea CFS-, CFS + OI- ja CFS + OI + SFN-potilailla verrattuna iän/sukupuolen mukaisiin kontrolleihin. Lopuksi ROS-tuotannon määritys viljellyissä mikrogliasoluissa, jota seurasi Pearson-korrelaatiotilastot, osoitti, että kohonnut BH4 CFS + OI -potilaiden seeruminäytteissä saattaa liittyä oksidatiiviseen stressivasteeseen. Nämä havainnot viittaavat siihen, että BH4-aineenvaihdunnan säätely voisi olla lupaava kohde CFS:n ja CFS:n molekyylimekanismin ymmärtämiselle OI:n kanssa.

Cistanche voi toimia väsymystä ja kestävyyttä lisäävänä aineena, ja kokeelliset tutkimukset ovat osoittaneet, että Cistanche tubulosa -keittiö voi tehokkaasti suojata maksan maksasoluja ja endoteelisoluja, jotka ovat vaurioituneet painoa kantavissa uimahiirissä, säätelevät NOS3:n ekspressiota ja edistävät maksan glykogeenia. synteesiä, jolloin se tehostaa väsymystä. Fenyylietanoli-glykosideja sisältävä Cistanche tubulosa -uute voi merkittävästi vähentää seerumin kreatiinikinaasi-, laktaattidehydrogenaasi- ja laktaattitasoja ja lisätä hemoglobiini- (HB)- ja glukoositasoja ICR-hiirillä, ja tällä voi olla väsymystä ehkäisevä rooli vähentämällä lihasvaurioita. ja maitohapon rikastamisen viivyttäminen energian varastointia varten hiirillä. Yhdiste Cistanche Tubulosa Tablets pidensi merkittävästi painoa kantavaa uintiaikaa, lisäsi maksan glykogeenivarastoa ja alensi seerumin ureatasoa harjoituksen jälkeen hiirillä, mikä osoittaa sen väsymystä ehkäisevän vaikutuksen. Cistanchis-keite voi parantaa hiirten kestävyyttä ja nopeuttaa väsymyksen poistumista harjoitushiiristä, ja se voi myös vähentää seerumin kreatiinikinaasin nousua kuormituksen jälkeen ja pitää hiirten luustolihasten ultrarakenteen normaalina harjoituksen jälkeen, mikä viittaa siihen, että sillä on vaikutuksia. fyysisen voiman lisäämiseen ja väsymykseen. Cistanchis pidensi myös merkittävästi nitriitimyrkytettyjen hiirten eloonjäämisaikaa ja paransi sietokykyä hypoksiaa ja väsymystä vastaan.

Napsauta Yliväsymys

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】

Avainsanat:ME/CFS; tetrahydrobiopteriini; ortostaattinen intoleranssi; pienkuitupolyneuropatia; endoteelin NOS; reaktiiviset happilajit

1. Esittely

Myalginen enkefalomyeliitti/krooninen väsymysoireyhtymä (ME/CFS) on krooninen monisysteemisairaus, jolle on ominaista heikentävä lihasväsymys, kipu, huimaus ja aivosumu [1,2]. Osalla ME/CFS-potilaita esiintyy vaikeaa ortostaattista hypotensiota [3], jolle on tunnusomaista merkittävä verenpaineen lasku, joka aiheuttaa huimausta ja pyörtymistä pystyasennossa [4]. Tätä tilaa kutsutaan usein ortostaattiseksi intoleranssiksi (OI). Osa OI-potilaista täyttää myös diagnostiset kriteerit pienkuitupolyneuropatialle [5,6], joka diagnosoidaan käyttämällä Kongon punaista värjäystä amyloidoosia varten ihobiopsianäytteissä [7]. Intensiivisestä tutkimuksesta huolimatta OI:n molekyylimekanismia ei tunneta.

BH4 on tärkeä aminohappoaineenvaihdunnan kofaktori [8]. Aminohapot, kuten fenyylialaniini, tyrosiini ja tryptofaani, muuttuvat tärkeiksi soluvälituotteiksi hydroksylaasientsyymien vaikutuksesta. BH4 toimii kaikkien näiden hydroksylaasientsyymien välttämättömänä kofaktorina [9–11]. Näin ollen BH4:n biologinen hyötyosuus on kriittinen välittäjäaineiden, kuten dopamiinin ja serotoniinin, synteesille [10]. Näiden hydroksylaasientsyymien lisäksi BH4 säätelee myös typpioksidisyntaasientsyymien toimintaa ja säätelee typpioksidin (NO) tuotantoa endoteelissä [12]. NO:n endoteelin tuotanto tehostaa verisuonia laajentavaa vastetta, alentaa verenpainetta ja auttaa lihasten rentoutumista [13,14]. Toisaalta oksidatiivisen stressin läsnä ollessa BH4 irtoaa eNOS:n aiheuttamasta NO-tuotannosta [15] ja lisää suoraan mitokondrioiden stressivastetta sydänkudoksessa [16] ja luustolihaksessa [17]. Siksi BH4-aineenvaihdunnan säätely on kriittistä sydämen ja verisuonijärjestelmän toiminnalle ja verenkierron terveydelle. Koska OI-potilailla on raportoitu olevan kardiovaskulaarisia poikkeavuuksia, olemme kiinnostuneita tutkimaan, ovatko OI-potilaat muuttaneet BH4-aineenvaihduntaa. Toistaiseksi ei ole tehty tutkimusta, joka tutkisi BH4-aineenvaihdunnan roolia CFS:ssä. Lisäksi tutkimuksemme tutkii myös, ovatko OI-potilaat muuttaneet BH4-biosynteesiä.

Tutkimukseen otettiin mukaan 66 henkilön seeruminäytteet, joissa oli n=32 CFS- ja n=34 -kontrollia. Kaksoissokkoutettu kvantitatiivinen ELISA suoritettiin BH4-tasojen vertaamiseksi terveiden kontrollien ja CFS-potilaiden välillä. Mielenkiintoista on, että havaitsimme, että CFS-potilailla oli voimakasta BH4-säätelyä verrattuna terveisiin kontrolleihin. Verrattaessa BH4-tasoa CFS-potilailla, joilla oli OI (n=10) ja iän/sukupuolen mukaan vertailuryhmissä (n=10), havaitsimme myös, että CFS-potilailla, joilla oli OI, oli merkittävästi korkeampi taso BH4 seerumissa. Yhdessä nykyinen käsikirjoituksemme korostaa, että seerumin BH4-arvon nousu CFS-potilailla voi olla ratkaisevassa roolissa OI:n patogeneesissä.

2. Tulokset

Tutkimukseen osallistuvat kohteet: BH4-tasojen kvantifioimiseksi seeruminäytteissä tutkimukseen otettiin yhteensä 66 ihmistä. Taulukossa 1 on yhteenveto näiden koehenkilöiden iästä, sukupuolesta, etnisestä taustasta ja olemassa olevista olosuhteista. Neljällä koehenkilöllä kontrolliryhmästä oli syöpään liittyviä komplikaatioita, ja siksi heidät jätettiin pois lopullisesta analyysistä. Kontrolliryhmän vähimmäis-, mediaani- ja enimmäis-ikä ovat 18, 64,5 ja 82 vuotta. CFS-ryhmän osalta nämä arvot ovat 26, 59 ja 76 vuotta. Molempien ryhmien ikäjakauma osoitti samanlaista vinoutta, ja myöhempi Bland–Altman-analyysitesti paljasti, että erojen keskiarvo oli lähellä nollaa, mikä viittaa siihen, että ikään liittyvää harhaa ei ole. Kontrolliryhmässä oli 44 % miehiä ja 56 % naisia, kun taas CFS-ryhmässä 41 % miehiä ja 59 % naisia. Kaikki potilaat olivat valkoihoisia ja asuivat Pohjois-Nevadan ja Kalifornian maantieteellisellä alueella.

ME/CFS-potilaspopulaatio otettiin mukaan Kanadan vuoden 2003 ja Fakudan ME/CFS-kriteerien perusteella. Ne täyttivät myös SCID:n diagnostiset kriteerit (ME/CFS:n uusi nimi, jonka on perustanut Institute of Medicine). Kontrollit olivat iän/sukupuolen mukaisia ​​CFS-potilaiden kanssa, jotka myös kutsuttiin yhdessä potilaiden kanssa Dr. Petersonin sisätautiklinikalle.

CFS + OI ja CFS + OI_SFN-alajoukot määritettiin diagnostisten testaustietueiden (lääketieteellisen kaavion tarkistus-täydellinen) ja kliinisen korrelaation avulla. Esimerkiksi ihmiset, joilla oli OI, esittivät toimistolle muunnetun positiivisen NASAn laihatestin (näkyy OI) ja kaikki saivat IV tilavuuden laajennushoitoa (suolaliuosta). SFN-potilailla oli biopsianäytteitä. Mukana oleville CFS + OI + SFN -henkilöille kirjattiin Mass General Hospital -raportti, jossa nilkan lateraalisessa lihaskudoksessa tehtiin Kongonpunainen värjäys neuriittitiheyden laskemiseksi.

BH4-taso on korkea ME/CFS-potilaiden seeruminäytteissä: Yhteensä 32 CFS- ja 34 kontrollihenkilöä otettiin mukaan tutkimukseen (taulukko 1) seerumin BH4-tasojen mittaamiseksi kilpailevalla ELISA:lla. BH4 ELISA:n standardikäyrä oli negatiivinen kaltevuus eksponentiaalinen käyrä, joka johdettiin kuudesta BH4-standardien kasvavasta pitoisuudesta (5, 10, 25, 50, 10{{52). }} ja 150 ng/ml). Standardikäyrän kulmakerrointa ja leikkauspistettä käytettiin mittaamaan BH4:n absoluuttisia tasoja OD-arvosta. Seeruminäytteiden sarjalaimennos, jota seurasi BH4 ELISA -määritys, paljasti, että seerumin laimennos 1:2 antoi kontrastisimman tuloksen nolla- tai taustaan ​​verrattuna. Siksi kaikki seeruminäytteet laimennettiin 1:2. Mielenkiintoista on, että kaksoissokkoutettu ELISA-analyysi, jota seurasi ei-parametrinen Mann–Whitney U -testi [* p < 0,05 (=0,033); U=304.5] paljasti, että BH4-tasot olivat merkitsevästi korkeammat n=32 CFS-potilaalla verrattuna n=28 kontrollihenkilöön (kuva 1A). Neljä koehenkilöä (n=4) vertailuryhmästä suljettiin pois heidän aiemman syövän vuoksi. Koska koehenkilöt otettiin mukaan satunnaisesti iästä ja sukupuolesta riippumatta, halusimme seuraavaksi analysoida BH4-tason korrelaatiota koehenkilöiden iän ja sukupuolen kanssa. Näin ollen ei-parametrinen Spearman-korrelaatioanalyysi (kuva 1B) paljasti, että BH4-tason ja koehenkilöiden iän välillä ei ollut korrelaatiota (Spearman r=−0,1657; p=0,1835). Seuraavaksi vertailimme BH4-tasoa miesten ja naisten välillä (kuva 1C). Miehen ja naisen (efektori#1 on sukupuoli) sekä kontrollin ja CFS:n (efektori#2 on terveydentila) välisen merkityksen arvioimiseksi suoritettiin kaksisuuntainen ANOVA-analyysi. Näin ollen miesten ja naisten BH4-tasoissa ei havaittu merkittävää eroa (p > 0,05; =0,3496). BH4:ssä oli kuitenkin merkittävä ero kontrolli- ja CFS-potilaiden välillä (p < 0,05; =0,0375) sukupuolierosta riippumatta.

Koska nykyinen kohortti on tiukasti rajoitettu samaan maantieteelliseen alueeseen, etniseen alkuperään ja yhden lääkärin vastaanotolle, BH4:n parikohtainen vertailuanalyysi tapausten ja kontrollien välillä, jotka vastaavat ikää ja sukupuolta, olisi vakuuttavampi. Yhteensä 15 paria verrattiin (kuva 1D). Ei-parametrinen Wilcoxon matched-pairs signed rank -testi paljasti, että CFS-potilailla oli merkittävästi korkeampi BH4 (** p<0.01; =0.0015) than age- and gender-matched controls. Collectively, our results suggest that the BH4 level is significantly higher in CFS patients compared to healthy control subjects, irrespective of age and gender differences.

CFS patients with OI have upregulated levels of BH4 in serum: Next, we wanted to analyze BH4 levels between control (n = 10) and CFS patients with OI (n = 10). An unpaired t-test revealed that CFS + OI patients had significantly higher BH4 [t1,18 = 2.499; * p < 0.05 (=0.0223)] levels compared to control subjects (Figure 2A). Table 2 displays that all controls were carefully matched with CFS + OI subjects in terms of age and gender. Moreover, a Kolmogorov–Smirnov normality distribution analysis followed by a Q-Q (quantile-quantile) plot (Figure 2B) indicated that all data points were normally distributed [p >alfa ({{0}}.05)]. Koska kaikki CFS- ja kontrollinäytteet vastaavat ikää ja sukupuolta, suoritettiin parikohtainen vertailuanalyysi. Myöhempi parillinen t-testi (t1, 9=3.834; ** p < 0.{7}}.004) osoitti, että CFS + OI seeruminäytteiden BH4 oli merkittävästi korkeampi kuin kontrolliseeruminäytteissä (kuva 2C). ). Kumulatiivinen sarakkeen tilastotesti (kuva 2D) paljasti lisäksi, että seitsemällä kymmenestä CFS + OI -potilaasta oli merkittävästi korkeampi BH4-taso kuin mediaani (=99,63 ng/ml). Toisaalta vain kahdella kymmenestä kontrollihenkilöstä oli korkeampi BH4 kuin mediaaniarvo. Nämä tiedot viittaavat yhdessä siihen, että CFS + OI -potilailla oli merkittävästi korkeampi BH4 verrattuna kontrollihenkilöihin.

CFS-potilaiden osajoukolla (n=12) on sekä OI että SFN. BH4-tasojen vertailu (kuvio 3A) terveiden kontrollien ja CFS + OI + SFN -potilaiden välillä paljasti, että CFS + OI + SFN -potilailla oli merkittävästi korkeampi BH4-taso [t1, 22=2.371; * s<0.05 (=0.0269)]. Table 3 shows that the cohort of 24 serum samples (n = 12 Control + n = 12 CFS + OI + SFN) was carefully selected based on age and gender. Subsequently, a Q-Q plot demonstrated all data points from both groups were normally distributed (Figure 3B). Since all subjects were matched in terms of age and gender, a paired analysis of control and CFS + OI + SFN subjects was performed. Accordingly, a significant difference in BH4  expression (* p < 0.05) was observed between these two groups (Figure 3C). A cumulative statistical analysis (Figure 3D) further indicated that n = 6 CFS + OI + SFN patients and n = 3 controls have higher BH4 levels than the median (=81.83 ng/mL) suggesting that the BH4  level is strongly elevated in serum samples of CFS + OI + SFN subjects.

Verrattaessamme BH4-tasoja pelkän CFS:n ja CFS + OI -potilaiden välillä havaitsimme, että CFS + OI -potilaiden seeruminäytteissä (n=14) oli korkeampi BH4-taso (kuva 4A) verrattuna kontrollihenkilöiden (n {{) 6}}). QQ-kaavioanalyysi osoittaa, että tietojen jakautuminen on normaali molemmissa ryhmissä (kuva 4B), mikä viittaa siihen, että parametritestiä voidaan käyttää keskiarvojen vertailuun. Näin ollen pariton t-testi keskiarvon merkitsevyyden analysoimiseksi ryhmien välillä paljasti vahvan eron [t1,22=2.592; * p < 0.05 (=0.0166)]. Valitun kohortin (n=22) saraketilastot osoittivat, että yhdeksällä 14:stä CFS + OI -potilaasta oli korkeammat seerumin BH4-tasot verrattuna mediaaniin 119,7 ng/ml (kuva 4C). Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että CFS-potilailla, joilla on OI, on kohonnut BH4-taso seerumissa. Yhdessä nykyinen käsikirjoituksemme tunnistaa BH4:n mahdolliseksi veren välityksellä levitettäväksi biomarkkeriksi CFS + OI- ja CFS + OI + SFN -potilaille.

Kohonneet BH4-tasot saattavat liittyä lisääntyneeseen oksidatiiviseen stressiin: Ymmärtääksemme kohonneen BH4:n toiminnallisen merkityksen seerumissa tutkimme OI-potilaiden (n=10) CFS-potilaiden seeruminäytteiden ROS-indusoivaa kykyä. DCFDA:lla infusoituja mikrogliasoluja käsiteltiin suhteessa 1:2 laimennetuilla seeruminäytteillä 10 CFS + OI:sta ja 10 iän/sukupuolen vertailusta 90 minuutin ajan, minkä jälkeen mitattiin ROS-tuotanto fluoresenssilevylukijalla (esim. Em { {12}} nm/535 nm) materiaalit ja menetelmä -osiossa kuvatulla tavalla. Kuten olemme aiemmin raportoineet [18], histogrammianalyysi osoitti, että CFS + OI - seeruminäytteiden ROS-tuottokapasiteetti oli merkittävästi korkeampi kuin kontrolliseeruminäytteiden (kuvio 5A) [t1, 18=2.541; p < 0,05 (=0,0205)]. Koska kaikki datapisteet molemmissa ryhmissä jakautuivat normaalisti (kuva 5B), suoritimme parametrisen testin tutkiaksemme keskiarvon merkitystä ryhmien välillä. Mielenkiintoista on, että Pearson-korrelaatiotilastollinen analyysi tässä kohortissa paljasti, että BH4-tasojen ja ROS-tuotannon välillä oli kohtalaisen positiivinen korrelaatio, mikä viittaa siihen, että kohonneet BH4-tasot CFS + OI- seeruminäytteissä saattoivat liittyä lisääntyneeseen oksidatiiviseen vasteeseen (kuva 5C).

Kaiken kaikkiaan nykyinen käsikirjoituksemme korostaa, että CFS-potilaat liittyvät kohonneisiin BH4-tasoihin seerumissa ja että lisääntynyt säätely havaittiin merkitsevämmin CFS-potilailla, joilla on OI. Lisäksi kohonnut BH4 saattaa liittyä oksidatiiviseen stressivasteeseen, mikä korostaa BH4-aineenvaihdunnan mahdollista roolia CFS:n ja CFS:n patogeneesissä OI:n kanssa (kuva 5D).

3. Keskustelu

Tetrahydrobiopteriinin (BH4) biosynteesi on tiukasti säädelty aineenvaihduntaprosessi terveydellä, ja sen epänormaali ilmentyminen liittyy useisiin sairauksiin. Sen puute johtaa aminohappoaineenvaihdunnan aineenvaihduntavajeeseen [19, 20], dopamiinisäätelyn heikkenemiseen [21] ja verenkierron heikkenemiseen [22, 23], ja se liittyy verenpaineeseen, diabetekseen, ateroskleroosiin, ikääntymiseen ja muut aineenvaihduntahäiriöt. Toisaalta lisääntynyt BH4-biosynteesi heikentää mitokondrioiden energiantuotantoa [24], indusoi oksidatiivista stressiä [25] ja lisää autofagian heikkenemistä [26]. Kohonnut BH4 liittyy myös verenpaineen laskuun [27] indusoimalla verisuonia laajentavaa vastetta aktivoimalla endoteelin NOS [28]. Siksi BH4:n lisääntynyt biosynteesi saattaa suoraan edistää verenpaineen tai hypotension laskua. Tutkimus viittaa siihen, että BH4:n puute vaimentaa LPS:n aiheuttamaa hypotensiota hiirillä [23]. Tähän mennessä BH4-aineenvaihdunnan roolia ei ole tutkittu CFS-potilailla, etenkään CFS-potilailla, joilla on OI. Siksi tavoitteemme oli arvioida seerumin BH4-ilmentymistä tässä potilaspopulaatiossa. Yllättäen ELISA-analyysimme paljasti, että CFS-potilaiden seeruminäytteissä oli merkittävästi korkeammat BH4-tasot verrattuna ikään ja sukupuoleen vastaaviin terveisiin kontrolliin. Näin ollen Spearman-korrelaatiotilastot osoittivat, että BH4:n lisääntymissääntelyssä ei ollut merkittävää korrelaatiota iän ja sukupuolen suhteen, mikä mitätöi mahdollisuuden joko ikään tai sukupuoleen liittyvään BH4-biosynteesin heikkenemiseen näillä potilailla.

Seuraavaksi havaitsimme, että CFS + OI -potilaiden seeruminäytteissä oli myös voimakas BH4 nousu verrattuna iän ja sukupuolen mukaan vastaavien kontrollien seeruminäytteisiin. Kumulatiivinen saraketilastomme paljasti, että seitsemällä kymmenestä CFS + OI -potilaasta oli huomattavan korkea BH4-taso, mikä viittaa siihen, että BH4:n nousu seerumissa saattoi olla yhteydessä OI:n patogeneesiin. Tulos vahvisti entisestään, kun pienikuitupolyneuropatiaa (SFN) sairastavien CFS + OI -potilaiden osajoukossa oli myös korkea BH4:n ekspressio seeruminäytteissään verrattuna iän ja sukupuolen mukaan vastaaviin kontrolleihin. Mielenkiintoista on, että seerumin BH4-tasojen vertailu vain CFS-potilaiden ja OI-potilaiden välillä osoitti, että OI-potilailla oli merkittävästi kohonneita BH4-tasoja.

Miten kohonnut BH4 vaikuttaa ME/CFS:n patogeneesiin? On olemassa useita reittejä, joilla kohonnut BH4 voi suoraan myötävaikuttaa ME/CFS:n patogeneesiin (kuva 5D). Ensinnäkin BH4-ylössäätelyn on raportoitu aiheuttavan mitokondrioiden energia-aineenvaihdunnan heikkenemistä estämällä elektroninkuljetusketjun I:n ja IV:n kompleksia, mikä johtaa mitokondrioiden kalvopotentiaalin vähenemiseen, sytokromi C:n vapautumiseen ja apoptoosiin [24]. BH4-altistuksen on myös raportoitu aiheuttavan oksidatiivista stressiä [29]. Vaikka fysiologisesti BH4 tukee endoteelin NO-tuotantoa eNOS-aktivoinnin kautta, BH4:n hapettuminen superoksidin vaikutuksesta irrottaa sen eNOS:sta, mikä aiheuttaa oksidatiivista stressiä sydänkudokselle ja vaikuttaa sydämen ja verisuonien terveyteen (kuva 5C). Tuloksemme osoittivat tueksi, että kohonneilla BH4-tasoilla CFS + OI - seeruminäytteissä oli positiivinen korrelaatio ROS:a indusoivien kykyjen kanssa. Lisäksi BH4 aktivoi myös rapamysiinikompleksi1 (mTORC1) -kinaasin nisäkäskohteita autofagian heikentämiseksi. Aiemmin raportoimme, että mTORC1:n aktivaatio ja myöhempi autofagian heikkeneminen voivat liittyä ME / CFS-patogeneesiin. Sekä mTORC1-riippuvaisen autofagian vajaatoiminnan [18] että energia-aineenvaihdunnan mitokondrioiden puutteen [30] on raportoitu myötävaikuttavan ME/CFS:n patogeneesiin. Siksi BH4-tason kohoaminen ME/CFS-potilaiden seeruminäytteissä voi aiheuttaa oksidatiivista stressiä ja lisätä eNOS:n irtoamista, mitä seuraisi kardiovaskulaarinen stressi, hypotensio, mitokondriotoksisuus ja autofagian heikkeneminen CFS-potilailla.

4. Materiaalit ja menetelmät

Näytteen hankinta: Näytteen hankinnasta, tunnistamisen poistamisesta ja varastointisuunnitelmasta keskusteltiin aiemmin [18]. Lyhyesti sanottuna verinäytteet ja kyselylomakkeen tiedot kerättiin tohtori Daniel Petersonin (Sierra Internal Medicine, Incline Village, NV, USA) valvonnassa (Western IRB) #20201812. Verinäytteet sentrifugoitiin ja seeruminäytteet jaettiin eriin ja jäädytettiin sitten välittömästi -80 ◦C:seen. Jokaiselle näytteelle annettiin yksilöllinen tunnistenumero ja se tallennettiin sekä muistikirjaan että Microsoft Exceliin päivämäärällä ja allekirjoituksella IRB-hyväksytyn protokollan mukaisesti. Näytteet toimitettiin sitten tutkimuslaitokseemme Wisconsiniin kuivajäällä yön yli. Vastaanottamisen jälkeen näytteet käsiteltiin ja analysoitiin välittömästi. Kyselylomake ja tunnistamattomat kliiniset tiedot tallennetaan suojattuun, rajoitettuun Redcap-palvelintietokantaan, jota hallinnoivat Sierra Internal Medicinen tutkimushenkilöstö ja kliininen stipendiaatti. Potilasrekisteriä ylläpidettiin Sierra Internal Medicinen asettamien tietosuojakäytäntöjen mukaisesti. ME/CFS-potilaiden osajoukot OI- ja OI + SFN-ryhmissä määritettiin sokeakartan tarkastelulla, ja laboratorion jälkeinen analyysi vahvistettiin kliinisellä PI:llä. Neljä syöpäpotilasta sisällytettiin sokeasti tähän analyysiin ja toimi tautipositiivisena kontrollina.

OI:n diagnostiset kriteerit sisälsivät asiaankuuluvat löydökset (sydämen kallistustaulukon tulokset) kliinisen kaavion tarkastelusta. Lisäksi kliininen stipendiaatti suoritti verenoton yhteydessä NASAn lean-analyysin. SFN-diagnoosi määritettiin kliinisen kaavion tarkastelun ja esisääriluun alueelta kerätyn ihonlävistysbiopsian histologisen tutkimuksen avulla. Ihobiopsiat arvioitiin itsenäisesti Massachusettsin yleissairaalassa epidermaalisten hermopäätteiden morfometristä kvantitointia varten ihon pinta-alan neuriittitiheyden tutkimiseksi.

BH4-kilpailukykyinen ELISA: BH4-taso mitattiin ja kvantifioitiin ME-CFS-potilaiden seeruminäytteistä ja iästä vastaavista terveistä kontrolleista valmistajan ohjeiden mukaisesti (Human BH4 Competitive ELISA Kit; Toimittaja: MyBioSource, Inc, San Diego, CA 92195, USA; Cat # MBS733839). Sarja validoitiin laboratoriossamme (multimodaalinen Perkin Elmer Victor X3 -levylukija, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA), ja sen standardikäyrä (R2=0.98) ja herkkyys oli niinkin alhainen kuin 1 ng/ml positiivista kontrollia koskeva pitoisuus. Lyhyesti sanottuna seeruminäytteet laimennettiin määrityslaimennusaineella (tai 1 x PBS:llä) ja pipetoitiin sitten mikrolevylle, joka oli esipäällystetty polyklonaalisella anti-BH4-vasta-aineella. 30 minuutin inkuboinnin jälkeen näytteen kanssa BH4-HRP-konjugaatti lisättiin levylle ja inkuboitiin vielä 1 tunti 37 ◦C:ssa. Jäljelle jääneet seeruminäytteet dekantoitiin ja pestiin levyllä 1 x pesupuskurilla (vaihtoehtoisesti 1 x PBS-T:llä) kolme kertaa viiden minuutin ajan käyttäen monikanavaista pipettiä. Pesun jälkeen jokainen kuoppa saatettiin reagoimaan TMB-substraatin kanssa 10 minuutin ajan pimeässä. Värin kehittyminen tapahtuu 10 minuutin alustan inkuboinnin jälkeen ravisteluolosuhteissa. BH4-HRP-konjugaatti kilpailisi seerumin BH4:n kanssa sitoutumisesta päällystettyyn primääriseen vasta-aineeseen. Siksi mitä enemmän seerumin BH4:ää näytteessä on, sitä vähemmän BH4-HRP-sitoutumista tapahtuisi ja näin syntyy vähemmän väriä. Yhteensä 66 seeruminäytettä (34 kontrolli-+ 32 ME-CFS-potilasta) hankittiin (yksityiskohdat "näytteiden hankinta" -osiossa) asianmukaisten institutionaalisten sääntelyohjeiden mukaisesti ja analysoitiin GLP-olosuhteissa. Näytteen jakautuminen oli satunnaista, ja määritys kaksoissokkoutettiin, kuten on kuvattu kohdassa "näytteen koon perustelu".

Otoskoon perustelu ja tilastollinen analyysi: Näytteen koko perustettiin käyttämällä seuraavaa yhtälöä. Otoskoko {{0}} n=z2p(1−p)/ε2=1.282∗0.95∗(1−0. 95)/0.052=32. Z on z-pistemäärä, joka on 1,28 teholle 0.8. p on väestöosuus; 95 %:n luottamusvälillä p on {{20}},95. ε on virhemarginaali, joka on 0,05. Siksi ryhmien välisen keskiarvon eron merkitsevyyden saavuttamiseksi p < 0,05:llä, yhteensä n=32 näytettä ryhmää kohden sisällytettiin. Kontrolli- ja CFS + OI -potilaiden vertailua varten otettiin mukaan n=10 näytettä ryhmää kohden. Samanlainen näytekoko otettiin mukaan verrattaessa kontrolli- ja kontrolli +OI + SFN-ryhmiä. Otoskoon laskeminen suoritettiin perustuen ε=0.05 ja p=0.99. Ei-parametrinen Mann-Whitney U -testi käytettiin testaamaan keskiarvon merkitystä kahden ryhmän välillä aina, kun kahdella ryhmällä oli identtiset ja normaalit datajakaumat; muuten suoritettiin parametrinen pariton t-testi. Ryhmien välistä parianalyysiä varten suoritettiin parametrinen parillinen t-testi, jos molempien ryhmien datapisteet jakautuivat normaalisti; muussa tapauksessa suoritettiin Wilcoxonin rank-testi ryhmien välisen merkityksen arvioimiseksi. Kaksisuuntaista ANOVAa post hoc Bonferronilla tai Tukeylla käytettiin keskiarvon merkityksen testaamiseksi useammassa kuin kahdessa ryhmässä, joissa sukupuoli (mies tai nainen) ja terveys (terve tai CFS) tarkasteltiin vaikuttajina. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism version 9.5.1 (733) ohjelmistolla (Boston, MA 02110, USA).

ROS-määritys:Ihmisen alkion HMC3-mikrogliasoluja kasvatettiin ja siirrostettiin täydellisen DMEM-elatusaineen kanssa. Lyhyesti, HMC3-solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle ROS-fluorometristä tutkimusta varten. Solut kasvatettiin 75–80 %:n konfluenssiin ja niitä inkuboitiin DCFDA-koettimen (Cat# ab113851; Abcam, Cambridge, UK) kanssa 45 minuuttia 37 ◦C:ssa pimeässä. Vakioelatusaine korvattiin 100 µl:lla (1:2-laimennus=50 µl seerumia + 50 µL elatusainetta) seerumilla täydennettyä elatusainetta 90 minuutin ajaksi optimaalisen fluoresenssiarvon saavuttamiseksi. Inkubointijakson lopussa väliaine imettiin ja mitattiin sitten viritysemissiolla käyttämällä 485 nm:n ja 535 nm:n suodatinsarjoja PerkinElmer Victor X3 -levylukijassa (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).

Tekijän panokset:AR keksi idean, suunnitteli, suoritti tutkimusta ja kirjoitti käsikirjoituksen. CGG teki tutkimuksen ja kirjoitti käsikirjoituksen. RW auttoi verinäytteiden keräämisessä ja potilaskirjanpidossa. DP on kliininen PI, joka vastasi bionäytteiden, kyselylomakkeiden ja IRB-hyväksynnän keräämisestä. Kaikki kirjoittajat ovat lukeneet käsikirjoituksen julkaistun version ja hyväksyneet sen.

Rahoitus:Tätä työtä tuki Simmaron Research Inc., voittoa tavoittelematon 501C-tutkimusorganisaatio, Incline Village, NV 89451 Solve ME -aloitteen ja Foundation Hesse Sibylla, Quebec, QC, Kanadan myöntämän Ramsay Award 2023:n AR:lle myöntämän rahoituksen tuloksena.

Institutionaalisen tarkastuslautakunnan lausunto:Mitään osaa tästä tutkimusartikkelista, mukaan lukien kuvat ja tekstit, ei ollut aiemmin julkaistu tai jäljennetty missään kirjassa, artikkelissa tai muussa julkaistussa kirjallisuudessa. Kuvat ovat alkuperäisiä, eikä niitä ole kopioitu mistään muusta lähteestä. Tämä ei ole kliininen tutkimus, vaan laitosten havainnointitutkimus. Bionäytteiden, kyselylomakkeiden ohjeiden, tallentamisen ja yksilöllisten tunnistenumeroiden keräämisen suoritti Western IRB, protokolla #20201812 (nykyinen uusimispäivä 21.7.23).

Ilmoitettu suostumus:Kaikki kirjoittajat antoivat suostumuksensa julkaista tämän arvosteluartikkelin.

Tietojen saatavuusilmoitus:Tähän paperiin ei liity sähköistä tietolomaketta. Ei tietoja sähköisessä arkistossa.

Eturistiriidat:AR, CGG, RW ja DP ovat voittoa tavoittelemattoman 501C-tutkimusorganisaation Simmaron Research INC:n työntekijöitä. Kirjoittajat eivät ilmoittaneet eturistiriitaa.

Lyhenteet

ME/CFS=Myalginen enkefalomyeliitti tai krooninen väsymysoireyhtymä; OI=Ortostaattinen intoleranssi; SFN=pienkuitupolyneuropatia; BH4=tetrahydrobiopteriini; eNOS=endoteelin typpioksidisyntaasi; EI=Typpioksidia. ROS=Reaktiiviset happilajit. ME/CFS=Myalginen enkefalomyeliitti tai krooninen väsymysoireyhtymä; OI=Ortostaattinen intoleranssi; SFN=pienkuitupolyneuropatia; BH4 =-tetrahydrobiopteriini; eNOS=endoteelin typpioksidisyntaasi; EI=Typpioksidi; ja ROS=Reaktiiviset happilajit.

Viitteet

1. Lim, EJ; Ahn, YC; Jang, ES; Lee, SW; Lee, SH; Son, CG Kroonisen väsymysoireyhtymän/myalgisen enkefalomyeliitin (CFS/ME) esiintyvyyden systemaattinen katsaus ja meta-analyysi. J. Transl. Med. 2020, 18, 100. [CrossRef]

2. Poika, C.-G. Katsaus kroonisen väsymyksen esiintyvyydestä maailmanlaajuisesti. J. Korean Med. 2012, 33, 25–33.

3. Natelson, BH; Lin, J.-MS; Blate, M.; Khan, S.; Chen, Y.; Unger, ER Ortostaattisen intoleranssin fysiologinen arviointi kroonisessa väsymysoireyhtymässä. J. Transl. Med. 2022, 20, 95. [CrossRef]

4. Bateman, L.; Bested, AC; Bonilla, HF; Chheda, BV; Chu, L.; Curtin, JM; Dempsey, TT; Dimmock, ME; Dowell, TG; Felsenstein, D. Myalgic enkefalomyeliitti/krooninen väsymysoireyhtymä: Diagnoosin ja hallinnan perusasiat. julkaisussa Mayo Clinic Proceedings; Elsevier: Amsterdam, Alankomaat, 2021; s. 2861–2878.

5. Basantsova, NY; Starshinova, AA; Dori, A.; Zinchenko, YS; Yablonskiy, PK; Shoenfeld, Y. Pienikuituisen neuropatian määritelmä, diagnoosi ja hoito. Neurol. Sci. 2019, 40, 1343–1350. [CrossRef]

6. Shoenfeld, Y.; Ryabkova, VA; Scheibenbogen, C.; Branch, L.; Martinez-Lavin, M.; Ikeda, S.; Heidecke, H.; Watad, A.; Bragazzi, NL; Chapman, J. Monimutkaiset kroonisen kivun, väsymyksen ja kognitiivisen heikentymisen oireyhtymät, jotka liittyvät autoimmuunihäiriöön ja pienikuituiseen neuropatiaan. Clin. Immunol. 2020, 214, 108384. [CrossRef]

7. Leonardi, L.; Adam, C.; Beaudonnet, G.; Beauvais, D.; Cauquil, C.; Ei, A.; Morassi, O.; Benmalek, A.; Trassard, O.; EchanizLaguna, A.; et ai. Ihon amyloidikertymät ja hermosäikeiden menetys neuropatian alkamisen ja etenemisen merkkiaineina perinnöllisissä transtyretiiniamyloidoosissa. euroa J. Neurol. 2022, 29, 1477–1487. [CrossRef] [PubMed]

8. Ichinose, H.; Nomura, T.; Sumi-Ichinose, C. Tetrahydrobiopteriinin aineenvaihdunta: sen merkitys monoaminergisissa hermosoluissa ja neurologisissa häiriöissä. Chem. Rec. 2008, 8, 378–385. [CrossRef] [PubMed]

9. Xia, T.; Harmaa, DW; Shiman, R. Rotan maksan fenyylialaniinihydroksylaasin säätely. III. Katalyysin hallinta (6R)-tetrahydrobiopteriinilla ja fenyylialaniinilla. J. Biol. Chem. 1994, 269, 24657–24665. [CrossRef]

10. Nagatsu, T.; Nagatsu, I. Tyrosiinihydroksylaasi (TH), sen kofaktori tetrahydrobiopteriini (BH4), muut katekoliamiiniin liittyvät entsyymit ja niiden ihmisgeenit Parkinsonin taudin (PD) lääke- ja geenihoidoista: Historiallinen yleiskatsaus ja tulevaisuudennäkymät. J. Neural Transm. 2016, 123, 1255–1278. [CrossRef]

11. Sawada, M.; Sugimoto, T.; Matsuura, S.; Nagatsu, T. (6R)-Tetrahydrobiopteriini lisää tryptofaanihydroksylaasin aktiivisuutta rotan rapheviipaleissa. J. Neurochem. 1986, 47, 1544–1547. [CrossRef]

12. Chen, D.-D.; Chen, L.-Y.; Xie, J.-B.; Shu, C.; Yang, T.; Zhou, S.; Yuan, H.; Chen, AF Tetrahydrobiopteriinin eNOS-pelkistysfunktion säätely. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3554–3562. [CrossRef] [PubMed]

13. Higashi, Y.; Sasaki, S.; Nakagawa, K.; Kimura, M.; Noma, K.; Hara, K.; Jitsuiki, D.; Goto, C.; Oshima, T.; Chayama, K. Tetrahydrobiopterin parantaa ikääntymiseen liittyvää endoteeliriippuvaisen verisuonten laajentumisen heikkenemistä lisäämällä typpioksidin tuotantoa. Ateroskleroosi 2006, 186, 390–395. [CrossRef]

14. Wang, WZ; Fang, XH; Stephenson, LL; Khiabani, KT; Zamboni, WA BH4-lisäyksen vaikutukset pitkittyneen iskemian jälkeen luustolihaksessa. Microsurgery 2007, 27, 200–205. [CrossRef]

15. Yang, Y.-M.; Huang, A.; Kaley, G.; Sun, D. eNOSin irtoaminen ja endoteelin toimintahäiriö ikääntyneissä suonissa. Olen. J. Physiol.-Heart Circ. Physiol. 2009, 297, H1829–H1836. [CrossRef]

16. Karbach, S.; Wenzel, P.; Waisman, A.; Munzel, T.; Daiber, A. eNOS:n irrottaminen sydän- ja verisuonisairauksissa - oksidatiivisen stressin ja tulehduksen rooli. Curr. Pharm. Des. 2014, 20, 3579–3594. [CrossRef]

17. Sindler, AL; Delp, MD; Reyes, R.; Wu, G.; Muller-Delp, JM Ikääntymisen ja harjoittelun vaikutukset eNOS- irtoamiseen luurankolihasten vastustusvaltimoissa. J. Physiol. 2009, 587, 3885–3897. [CrossRef]

18. Gottschalk, G.; Peterson, D.; Knox, K.; Maynard, M.; Whelan, RJ; Roy, A. Kohonnut ATG13 ME/CFS-potilaiden seerumissa stimuloi oksidatiivista stressivastetta mikrogliasoluissa aktivoimalla kehittyneiden glykaation lopputuotteiden (RAGE) reseptorin. Mol. Cell. Neurosci. 2022, 120, 103731. [CrossRef] [PubMed]

19. Blau, N.; Thony, B.; Spada, M.; Ponzone, A. Tetrahydrobiopteriini ja periytyneet hyperfenyylialaninemiat. Turkki. J. Pediatr. 1996, 38, 19–35. [PubMed]

20. Birnbacher, R.; Scheibenreiter, S.; Blau, N.; Bieglmayer, C.; Frisch, H.; Waldhauser, F. Hyperprolaktinemia, työkalu tetrahydrobiopteriinin puutteen hoitoon: Endokriiniset tutkimukset sairastuneella tytöllä. Pediatr. Res. 1998, 43, 472-477. [CrossRef]

21. Hyland, K.; Kasim, S.; Egami, K.; Arnold, L.; Jinnah, H. Tetrahydrobiopteriinin puutos ja dopamiinin menetys Lesch-Nyhanin taudin geneettisessä hiirimallissa. J. Peri. Metab. Dis. 2004, 27, 165–178. [CrossRef]

22. Li, L.; Chen, W.; Rezvan, A.; Jo, H.; Harrison, DG Tetrahydrobiopteriinin puutos ja typpioksidisyntaasin irrottaminen edistävät virtaushäiriön aiheuttamaa ateroskleroosia. Valtimotauti. Thromb. Vasc. Biol. 2011, 31, 1547–1554. [CrossRef]

23. Chuaiphichai, S.; Starr, A.; Nandi, M.; Channon, KM; McNeill, E. Endoteelisolujen tetrahydrobiopteriinin puutos heikentää LPS-indusoitua verisuonten toimintahäiriötä ja hypotensiota. Vasc. Pharmacol. 2016, 77, 69–79. [CrossRef] [PubMed]

24. Choi, HJ; Lee, SY; Cho, Y.; Ei, H.; Kim, SW; Hwang, O. Tetrahydrobiopteriini aiheuttaa mitokondrioiden toimintahäiriöitä dopaminergisissä soluissa: Vaikutukset Parkinsonin tautiin. Neurochem. Int. 2006, 48, 255–262. [CrossRef] [PubMed]

25. Lee, SY; Moon, Y.; Hee Choi, D.; Jin Choi, H.; Hwang, O. Rotan mesenkefaalisten dopaminergisten hermosolujen erityinen haavoittuvuus tetrahydrobiopteriinille: Merkitys Parkinsonin taudin kannalta. Neurobiol. Dis. 2007, 25, 112–120. [CrossRef]

26. Kwak, SS; Suk, J.; Choi, JH; Yang, S.; Kim, JW; Sohn, S.; Chung, JH; Hong, YH; Lee, DH; Ahn, JK; et ai. Tetrahydrobiopteriinin puutteen aiheuttama autofagian induktio. Autofagia 2011, 7, 1323–1334. [CrossRef] [PubMed]

27. Porkert, M.; Sher, S.; Reddy, U.; Cheema, F.; Niessner, C.; Kolm, P.; Jones, DP; Hooper, C.; Taylor, WR; Harrison, D.; et ai. Tetrahydrobiopteriini: uusi verenpainetta alentava hoito. J. Hum. Hypertensistä. 2008, 22, 401–407. [CrossRef] [PubMed]

28. Channon, K. Tetrahydrobiopterin: Endothelial Typpioksidisyntaasin säätelijä verisuonisairauksissa. Trends Cardiovasc. Med. 2004, 14, 323–327. [CrossRef]

29. Feng, Y.; Feng, Y.; Gu, L.; Liu, P.; Cao, J.; Zhang, S. Tetrahydrobiopteriinin (BH4) aineenvaihdunnan kriittinen rooli radioherkkyyden moduloinnissa: BH4/NOS-akseli enkelinä tai paholaisena. Edessä. Oncol. 2021, 11, 720632. [CrossRef]

30. Mandarano, AH; Maya, J.; Giloteaux, L.; Peterson, DL; Maynard, M.; Gottschalk, CG; Hanson, MR Myalgista enkefalomyeliittiä/kroonista väsymysoireyhtymää sairastavilla potilailla on muuttunut T-solujen aineenvaihdunta ja sytokiiniyhdistykset. J. Clin. Tutki. 2020, 130, 1491–1505. [CrossRef] [PubMed]

Vastuuvapauslauseke/julkaisijan huomautus:Kaikkiin julkaisuihin sisältyvät lausunnot, mielipiteet ja tiedot ovat yksinomaan yksittäisten kirjoittajien ja avustajien, eivät MDPI:n ja/tai toimittajan (toimittajien) lausuntoja. MDPI ja/tai toimittaja(t) eivät ole vastuussa ihmisille tai omaisuudelle aiheutuvista vahingoista, jotka johtuvat sisällössä mainituista ideoista, menetelmistä, ohjeista tai tuotteista.

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatsApp:8613632399501】