ABSTRAKTI

Melaniini on ihmisen ihon pääpigmentti, ja sillä on ensisijainen tehtävä suojaa ultraviolettisäteilyltä. Melaniinin tuotannon muuttuminen voi johtaa hyperpigmentaatiosairauksiin, joilla on sekä esteettisiä että terveydellisiä seurauksia. Siten melanogeneesin suppressoreita pidetään hyödyllisinä työkaluina lääketieteellisissä ja kosmeettisissa hoidoissa. Suuri kiinnostus kohdistuu luonnollisiin lähteisiin, joiden tavoitteena on löytää turvallisia ja kvantitatiivisesti saatavilla olevia depigmentoivia aineita. Jäkälän uskotaan olevan mahdollisia tämäntyyppisten yhdisteiden lähteitä, koska monien fenolimolekyylien esiintyminen viittaa mahdollisiin vaikutuksiin melaniinin synteesiin osallistuviin fenolaasientsyymeihin, kuten tyrosinaasiin. Tässä työssä käytimme neljää jäkälälajia, Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale ja Letharia vulpina (L.) Hue ja Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy, saadaksemme uutteita liuottimissa, joiden polaarisuus on kasvanut, ts. kloroformi, kloroformi-metanoli, metanoli ja vesi. Soluttomat tyrosinaasin estokokeet osoittivat korkeimman inhibition L. vulpina -metanoliuutteelle, jota seurasi C. islandica kloroformi-metanoli. Vertailukelpoisia tuloksia depigmentointiaktiivisuuksista havaittiin käyttämällä in vitro ja in vivo -järjestelmiä, kuten MeWo-melanoomasoluja ja seeprakalan toukkia. Tutkimuksemme tarjoaa ensimmäiset todisteet jäkäläuutteiden depigmentoivista vaikutuksista tyrosinaasin estämisestä solu- ja in vivo -malleihin, mikä viittaa siihen, että L. vulpina- ja C. islandica -uutteet ansaitsevat lisätutkimuksen ihonvalkaisutuotteiden kehittämiseksi.

Asiaankuuluvien tutkimusten mukaancistancheon yleinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "ihmeyrtti, joka pidentää elämää". Sen pääkomponentti oncistanosidi, jolla on erilaisia ​​vaikutuksia, kutenantioksidantti, tulehdusta ehkäiseväja immuunijärjestelmän toiminnan edistäminen. Mekanismi cistanchen jaihon valkaisuunpiilee cistanchen antioksidanttisessa vaikutuksessaglykosidit. Ihmisen ihossa oleva melaniini muodostuu tyrosiinin hapettumisesta, jota katalysoityrosinaasi, ja hapetusreaktio vaatii hapen osallistumista, joten kehon happivapaista radikaaleista tulee tärkeä melaniinin tuotantoon vaikuttava tekijä. Cistanche sisältää cistanosidia, joka on antioksidantti ja voi vähentää vapaiden radikaalien muodostumista kehossa, jotenestää melaniinin tuotantoa.

Napsauta Cistanche Tubulosa -lisäosaa valkaisuun

Lisätietoja:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

AiheetKasvitiede, ihotauti

AvainsanatTyrosinaasi, jäkälän sekundaariset metaboliitit, seeprakala, melanogeneesi, Letharia vulpina, Cetraria islandica

JOHDANTO

Selkärankaisilla melaniinin synteesin toteuttavat erikoistuneet solut, joita kutsutaan melanosyyteiksi, lysosomien kaltaisissa organelleissa, joita kutsutaan melanosomeiksi. Melanisaatiota säätelevät erilaiset prosessit, mukaan lukien ympäristötekijät (esim. UV-säteet) ja endogeeniset (esim. -MSH) tekijät, melanokortiini-1-reseptorin (MC1R) stimulaatio, cAMP- ja MAPK-reittien signaalinsiirto, mikroftalmian aktivaatio. siihen liittyvän transkriptiotekijän (MITF) ja premelanosomiproteiinin (Pmel), tyrosinaasin (TYR) ja tyrosinaasille läheisten proteiinien (TYRP1) ilmentymisen (D'Mello et al., 2016; Cheli et al., 2010).

Tyrosinaasi (EC1.14.18.1) on melaniinin synteesin avainentsyymi, ja sitä on tutkittu laajalti melanisaation moduloivien aineiden kohteena. Se on monitoiminen kuparia sisältävä entsyymi, joka on laajalti levinnyt luonnossa ja vastaa melanisaatiosta eläimissä ja ruskeutumisesta kasveissa ja mikro-organismeissa (Kondo & Hearing, 2011). Entsyymi katalysoi kahta erilaista melaniinin muodostumisreaktiota: tyrosiinin hydroksylaatiota mykofenolaattiaktiivisuuden vaikutuksesta ja 3,4-dihydroksifenyylialaniinin (L-DOPA) hapettumista o-dopakinoniksi difenolien vaikutuksesta. Nämä reaktiiviset o-kinonit käyvät läpi ei-entsymaattisen polymeroinnin, jolloin muodostuu melaniinia.

Vaikka melaniini ihmisen ihossa on välttämätön pigmentti suojaamaan UV-säteilyn aiheuttamilta vaurioilta, liiallinen melaniinin tuotanto aiheuttaa hyperpigmentaatiohäiriöitä, kuten melasmaa, ephelidejä ja lentigiiniä (Mukherjee et al., 2018). Nämä sairaudet ovat ongelma monille ihmisille, ja sen seurauksena pigmentinpoistoaineiden etsiminen on herättänyt suurta kiinnostusta lääketieteen ja lääketieteen aloilla (Solano, 2014). Siksi on suunnattu huomattavaa tutkimustyötä uusien luonnollisten aktiivisten tuotteiden löytämiseksi, jotka sisältävät runsaasti turvallisia ja kvantitatiivisesti saatavilla olevia pigmentaation estäjiä (Li et al., 2013; Lo et al., 2013; Wang et al., 2011). Päästrategiana on kohdistaa tyrosinaasi, ja kiinnostus luonnontuotteisiin, joita käytetään tyrosinaasin estäjinä, kasvaa (Leyden et al., 2011). Kirjallisuudessa on raportoitu suuri määrä luonnollisista lähteistä peräisin olevia tyrosinaasin estäjiä niiden mahdollisesta käytöstä pigmentoituneiden ihosairauksien hoitoon (Mukherjee et al., 2018; Parvez et al., 2007). Monilla näistä yhdisteistä inhiboiva vaikutus on liittynyt niiden fenolirakenteeseen, joka tarjoaa korkean antioksidanttivoiman. Erilaiset todisteet osoittavat, että jäkälät ovat tutkimisen arvoisia tämäntyyppisten yhdisteiden mahdollisina lähteinä (Brandão et al., 2017; Higuchi ym., 1993; Honda et al., 2016; Lopes, Coelho & Honda, 2018).

Jäkälät ovat symbioottisia assosiaatioita heterotrofisen sienen (mykobiontin) ja yhden tai useamman fotosynteettisen kumppanin (fotobiontin) välillä (Nash III, 2006). Symbioosin seurauksena mykobiontti tuottaa useita sekundaarisia aineenvaihduntatuotteita (jäkäläaineita), joista useimmat ovat ainutlaatuisia näille organismeille (Ranković & Kosanić, 2015). Nämä metaboliitit voivat auttaa suojaamaan bioottisia ja abioottisia tekijöitä, kuten kasvinsyöjiä tai UV-säteilyä vastaan ​​(Phinney, Solhaug & Gauslaa, 2018). Useimmat niistä ovat fenolisia yhdisteitä, jotka on johdettu pääosin asetaatti-polymalonaattireitistä, ja niiden odotetaan tarjoavan useita biologisia aktiivisuuksia. Niinpä jäkälää käytetään perinteisessä lääketieteessä eri tarkoituksiin eri tarkoituksiin (Crawford, 2015; Devkota et al., 2017), kun taas erilaisia ​​jäkäläaineita on käytetty yrtti- ja lääkesovelluksissa (Einarsdóttir et al., 2010; Gül¸). cin et ai., 2002; Ranković & Kosanić, 2015). Eri ominaisuuksien joukossa näiden yhdisteiden fenolinen luonne viittaa vaikutuksiin fenolaasientsyymien, kuten tyrosinaasin, aktiivisuuteen (Honda et al., 2016). Jäkälät ovat hyviä luonnollisten antioksidanttien lähteitä, joista osa on tunnustettu tyrosinaasin estäjiksi (Behera, Adawadkar & Makhija, 2004). Jotkin patentit vaativat myös jäkäläuutteisiin tai jäkäläyhdisteisiin liittyviä tyrosinaaseihin liittyviä toimia (Takayama et al., 2010), mutta ne on pitkään laiminlyöty ja unohdettu pääasiassa siksi, että jäkäläaineita on vaikea saada sellaisina määrinä ja puhtaina, että ne ovat riittäviä rakenteellisen selvityksen ja farmakologinen testaus (Boustie, Tomasi & Grube, 2011; Muggia, Schmitt & Grube, 2009).

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää jäkäläaineiden biologisia vaikutuksia erilaisiin pigmentaatiomalleihin, sekä soluvapaisiin että soluisiin, mukaan lukien in vivo seeprakalakokeet. Lisäksi annoimme vihjeitä mahdollisuudesta hyödyntää jäkälää depigmentoivien yhdisteiden erottamiseen sekä farmaseuttisten ja kosmeettisten depigmentointituotteiden valmistukseen. Koska jäkälävaikutuksista melanisaatioon oli vain vähän tietoa, suoritimme ensin seulonnan erilaisille lajeille, jotka tunnettiin laajasta levinneisyydestään ja runsaudesta, nimittäin. Cetraria islandica Ach., Flavoparmelia caperata Hale, Letharia vulpina (L.) Hue ja Parmotrema perlatum (Hudson) M. Choisy. Jokaisesta lajista saimme neljän uutteen sarjan käyttämällä kasvavan polaarisuuden omaavia liuottimia, puhtaasta kloroformista veteen. Ensimmäisenä tutkimuksena kaikki uutteet testattiin soluttomissa tyrosinaasin estokokeissa. Uutteita, joilla oli huomattavaa annoksesta riippuvaa estoaktiivisuutta, käytettiin in vitro ja in vivo melanointimalleissa käyttämällä melaniinia tuottavien melanoomasolujen (MeWo) viljelmiä ja vastaavasti kehittyviä seeprakalan alkioita. Käytimme seeprakalaa, koska se on hiljattain perustettu in vivo -malliksi melanogeenisten säätelyyhdisteiden fenotyyppipohjaiseen seulomiseen (Lin et al., 2011). Erityisesti seeprakalasta on tullut tärkeä selkärankaisten malli lääkkeiden vaikutusten arvioinnissa, koska sillä on ainutlaatuisia ominaisuuksia, kuten ylläpidon ja lääkkeen antamisen helppous, lyhyt lisääntymiskierto, ulkoinen hedelmöitys ja kehitys, mikä mahdollistaa kehitysympäristön manipuloinnin ja optiset mittaukset läpinäkyvän kalvon kautta. kehon seinä.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kemikaalit

Kaikki reagenssit ostettiin Sigma-Aldrichilta (Milano, Italia), ellei toisin mainita.

Jäkälälajit ja uutteen valmistus

F. caperatan ja P. perlatumin thalli kerättiin Itä-Ligurian (Lounais-Italia) metsäalueelta, L. vulpina Valtournenchen metsäalueelta (Koillinen Valle d'Aosta, Italia) ja C. islandica ostettiin Kubjalta. Ürditalu (Tallinna, Viro). Italian lainsäädännön mukaan jäkälän keräämiseen ei vaadita lupia. Yksi meistä (PG) tunnisti jäkälämateriaalit mikroskooppianalyysillä tunnistusavainten ja pistetestien avulla. Sen jälkeen jäkälämateriaali puhdistettiin roskista, jätettiin kuivumaan huoneenlämpötilaan yön yli ja säilytettiin paperipusseissa huoneenlämmössä käyttöön asti.

Kuivatut jäkäläthallit uutettiin huoneenlämpötilassa (noin 23 ◦C) neljällä liuotinpolariteetilla kloroformista veteen: kloroformi, kloroformi-metanoli (9:1), metanoli ja vesi (14,4 g F. caperataa 70 ml:ssa kutakin). liuotin, 10,4 g P. perlatumia 60 ml:ssa, 13,3 g L. vulpinaa 75 ml:ssa ja 100,6 g C. islandicaa 500 ml:ssa). Uuttoja suoritettiin 5 päivän ajan ja 3 kertaa kullekin liuottimelle sekoittaen usein. Supernatanttineste suodatettiin sitten ja haihdutettiin kuiviin alennetussa paineessa pyörivässä järjestelmässä (Rotavapor Heidolph, Schwabach, Saksa) kuivattujen uutteiden saamiseksi (Souza et al., 2016). Jäkäläuutteen saannot on raportoitu taulukossa 1.

Tyrosinaasin estomääritys

Tavanomainen TLC-kromatografinen profiili suoritettiin 20 x 20 cm:n levyillä (Merck-silikageeli 60 F254) kirjallisuuden protokollien mukaisesti (Culberson & Kristinsson, 1970; White & James, 1985). Lyhyesti sanottuna L. vulpinan metanoliuutteen ja C. islandica kloroformi-metanoliuutteen näytteet liuotettiin uudelleen niiden uuttoliuottimiin ja sitten täplitettiin TLC-levylle kapillaariputkella. TLC-profiili suoritettiin käyttämällä tolueeni:etikkahappoa (200:30 ml) liikkuvana faasina (liuotin C). Kun liuotinrintama oli saavutettu, levy jätettiin kuivumaan huoneenlämpötilaan. Kuivatut levyt tutkittiin ja valokuvattiin aluksi näkyvässä valossa (päivänvalossa) pigmenttien havaitsemiseksi värillisinä täplinä, ja sitten fluoresenssivalossa käyttäen 254 ja 350 nm viritteitä.

Tyrosinaasi-inhibition läsnäolon visualisoimiseksi kussakin pisteessä TLC-levyt suihkutettiin L-tyrosiiniliuoksella (noin 2,5 x 10-5 mmol/cm2) ja sitten tyrosinaasiliuoksella (noin 3,6 U/cm2). Täplät, joilla oli tyrosinaasia estävää aktiivisuutta, näyttivät valkoisilta tummalla taustalla (Wangthong et al., 2007).

Soluviljely, solujen elinkelpoisuus ja melaniinimääritykset

Ihmisen MeWo-melanoomasolulinjaa (kat. HTB-65, ATCC, Manassas, VA, USA) käytettiin solujen elinkelpoisuusmäärityksessä, kuten ovat raportoineet Pastorino et al. (2017), ja melaniinimäärityksessä, kuten kuvataan Cornara ym. (2018).

Seeprakalan depigmentaatiomääritys

Täysikasvuinen seeprakala (Danio rerio) hankittiin kaupalliselta jälleenmyyjältä ja pidettiin kiertojärjestelmässä, jonka vedenjohtavuus oli 500–530 /cm 27 ◦C:ssa, pH 7,0–7,5 jatkuvassa 14/10 valossa/ tumma valojakso. Eläinten eläinlääkinnällinen hoito toteutettiin Italian lain (D.to L.Vo 26/2014) mukaisesti, ja kokeet hyväksyivät Institutional Ethics Review Body (Genovan yliopisto) ja Italian terveysministeriö (lupa 720/). 2015-PR). Aikuisten seeprakalojen kutu suoritettiin standardimenetelmien mukaisesti. Erityisesti synkronoidut alkiot saatiin luonnollisesta kutemisesta, joka aiheutettiin aamulla kytkemällä valo päälle. Alkiot järjestettiin 6-kuoppalevyille, jotka sisälsivät 2 ml alkioelatusainetta ja 15 alkiota kuoppaa kohti. Uutekantaliuokset laimennettiin haluttuihin pitoisuuksiin alkioelatusaineella juuri ennen käyttöä (L. vulpina metanoliuute: 6–45 µg/ml; C. islandica kloroformi-metanoliuute: 5–65 µg/ml). Laimennetut uutteet lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 8 - 56 hpf (tuntia hedelmöityksen jälkeen), mikä johti 48 tunnin altistukseen. Positiivisena kontrollina käytettiin 10 mM arbutiinia. Elatusaine vaihdettiin 24 tunnin välein koeyhdisteiden tasaisen jakautumisen varmistamiseksi. Alkiot, joiden teho oli 56 hevosvoimaa, poistettiin pihdeillä, nukutettiin trikaiinimetaanisulfonaattiliuoksessa (Sigma Aldrich) ja valokuvattiin sitten stereomikroskoopilla (Leica M205C). Vaikutukset pigmentaatioon arvioitiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa v. 1.74. Pikselimittausanalysaattoritoimintoa käytettiin seeprakalan pigmentaation alueen arvioimiseen.

Tilastollinen analyysi

Tyrosinaasin eston, MTT:n ja seeprakalan pigmenttitietojen avulla saadut annos-vastekäyrät analysoitiin logistisella regressiomallilla, jolloin saatiin IC50- ja IC05-arvot, jotka oletettiin mediaani- ja kynnysarvoiksi, vastaavasti. Tilastolliset vertailut tehtiin R 3.0.1 (R Core Team, 2013) -ympäristössä käyttämällä ANOVA-testiä, t Studentin kanssa Bonferronin korjausta ja Dunnettin testejä moninkertaisiin vertailuihin.

TULOKSET

Vaikutukset tyrosinaasiaktiivisuuteen

Jäkäläuutteet osoittivat monimutkaisia ​​moduloivia vaikutuksia sienten tyrosinaasiaktiivisuuteen, arvioituna in vitro soluttomassa määrityksessä. Jotkut uutteet indusoivat tyrosinaasin aktivaatiota, erityisesti F. caperata -metanoli-, kloroformi- ja L. vulpina -vesiuutteet, toiset osoittivat kaksifaasista käyttäytymistä, kun taas jotkut olivat estäviä (kuvio 1 ja taulukko 2). Erityisesti kloroformi-metanoli (kuvio 1B) ja metanoliuutteet (kuvio 1C) osoittivat kaiken kaikkiaan voimakkaampaa tyrosinaasin estoa annoksesta riippuvilla vaikutuksilla. Voimakkain estoaktiivisuus kirjattiin L. vulpinan metanoliuutteelle (kuvio 1C), jota seurasi C. islandican kloroformi-metanoliuutte (kuvio 1B). Näiden uutteiden inhiboivat aktiivisuudet olivat ainoita, jotka mahdollistivat IC50-arvojen arvioimisen 95 prosentin luottamusvälillä (taulukko 2). Positiivisena kontrollina näissä kokeissa kojiinihapon aiheuttama tyrosinaasin esto IC50-arvolla 13,9 µg/ml (95 prosentin luottamusväli: 12,4–15,7).

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501