Mikrokuplavarjoaineen yhdistäminen pulssilasersäteilytykseen transdermaaliseen lääkeannostukseen, osa 1

Abstrakti: Laser-indusoidun mikrokuplakavitaation (MB) optodynaamista prosessia nesteissä hyödynnetään erilaisissa lääketieteellisissä sovelluksissa. Kuitenkin, kuinka tuleva lasersäteily on vuorovaikutuksessa MB:iden kanssa ultraäänivarjoaineena, arvioidaan harvoin, kun neste sisältää jo stabiileja MB:itä. Tässä tutkimuksessa tutkittiin albumiinin kuorittujen MB:iden laservälitteisen kavitaation tehokkuutta transdermaalisen lääkkeen annostelun tehostamisessa. Ensin arvioitiin MB:iden laservälitteisen inertiakavitaation eri tyypit ja olosuhteet. CO2-fraktiopulssilaser valittiin MB:iden kanssa yhdistämistä varten in vitro ja in vivo -kokeissa. In vitro -arbutiinin ihon tunkeutuminen 2 tunnin kuluttua oli 2 kertaa suurempi ryhmässä, jossa laser yhdistettiin MB:iden kanssa, kuin kontrolliryhmässä. Pieneläinkokeissa valkaisuvaikutus C57BL/6J-hiirten iholla ryhmässä, jossa laser yhdistettiin iholla olevien MB:iden ja tunkeutuvan -arbutiinin kanssa, kasvoi (merkittävästi) 48.0 prosenttia päivinä 11 ja 5 0,0 prosenttia 14. päivänä ja sen jälkeen vakiintui 20-päivän kokeilujakson loppuosan ajaksi. Tämänhetkiset tulokset osoittavat, että CO2-laserin yhdistäminen albumiinikuorittujen MB:iden kanssa voi lisätä ihon läpäisevyyttä tehostaen -arbutiinin toimittamista melanogeneesin estämiseksi hiirillä vahingoittamatta ihoa.

Asiaankuuluvien tutkimusten mukaancistancheon yleinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "ihmeyrtti, joka pidentää elämää". Sen pääkomponentti oncistanosidi, jolla on erilaisia ​​vaikutuksia, kutenantioksidantti, tulehdusta ehkäisevä, jaimmuunijärjestelmän toiminnan edistäminen. Mekanismi cistanchen jaihon valkaisuunpiilee antioksidanttisessa vaikutuksessacistanche-glykosidit. Ihmisen ihossa oleva melaniini muodostuu tyrosiinin hapettumisesta, jota katalysoityrosinaasi. Hapetusreaktio vaatii hapen osallistumista, joten kehon happivapaista radikaaleista tulee tärkeä melaniinin tuotantoon vaikuttava tekijä. Cistanche sisältää cistanosidia, joka on antioksidantti ja voi vähentää vapaiden radikaalien muodostumista kehossa, jotenestää melaniinin tuotantoa.

Napsauta Cistanches Herba valkaisuun

lisätietoja:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

1. Esittely

Kavitaatiolla tarkoitetaan onteloiden muodostumista nesteeseen ja se tapahtuu yleensä, kun neste altistuu nopeille paineenvaihteluille. Tällaisia ​​paineen muutoksia voidaan saada aikaan useilla eri menetelmillä, jolloin akustinen kavitaatio alkaa, kun käytetyn akustisen paineen amplitudi ylittää tietyn kynnyksen [1]. Akustiseen kavitaatioon liittyy mikrokuplien (MB) muodostuminen, kasvu, sykkiminen ja romahtaminen nesteisiin ultraääniaaltojen (US) ultraäänikäsittelyn aikana. Näiden ilmiöiden uskotaan olevan vastuussa sekoittumisesta, pirstoutumisesta, eroosiosta, kostumisesta, sonokapillaarista ja muista vaikutuksista, joilla on useita käytännön teollisia sovelluksia [1].

USA:n aiheuttamalla MB-varjoaineiden kavitaatiolla on myös tärkeä rooli sekä diagnostisissa että terapeuttisissa lääketieteellisissä sovelluksissa. Uh-varjoaineet ovat stabiloituja ja päällystettyjä MB:itä, jotka injektoidaan suonensisäisesti diagnostisen usa-kuvantamisen resoluution parantamiseksi [2]. Lukuisista tutkimuksista on saatu näyttöä siitä, että MB-varjoaineiden läsnäolo veressä voi alentaa kynnystä useille USA:n aiheuttamille biologisille vaikutuksille sekä in vitro että in vivo, kuten hemolyysi, kapillaarin repeämä ja sonoporaatio [3]. Jotkin tutkimukset ovat osoittaneet, että MB-varjoaineiden läsnäolo veressä alentaa merkittävästi USA:n aiheuttamien ennenaikaisten sydämen supistusten kynnystä [4,5]. MB:iden resonanssi (stabiili kavitaatio) johtaa epälineaarisiin harmonisiin emissioihin, joita voidaan hyödyntää MB-spesifisessä kontrastikuvauksessa. Inertiakavitaatio ja MB:iden tuhoutuminen voivat aiheuttaa voimakkaita mekaanisia rasituksia, jotka lisäävät solukalvojen ja veri-aivoesteen läpäisevyyttä terapeuttisten aineiden annostelun parantamiseksi. Aiemmissa tutkimuksissamme olemme käyttäneet Yhdysvaltojen indusoimaa MB:iden inertiakavitaatiota tehostaaksemme transdermaalista lääkeainekuljetusta (TDD), koska inertiakavitaation havaittiin parantavan marraskeden paljon enemmän läpäisevyyttä verrattuna stabiiliin kavitaatioon [6–8] .

Lasersäteilytys on vaihtoehtoinen tapa parantaa lääkkeen läpäisyä ja siten helpottaa lääkkeen kulkua ihoon tai ihon läpi. Kun laserpulssi, jonka intensiteetti ylittää tietyn kynnyksen, kohdistetaan nesteeseen, nesteen räjähdysmäinen höyrystyminen voi myös aiheuttaa MB-kavitaatiota [9,10]. Laser-indusoidun kavitaation aggressiivinen luonne on johtanut siihen, että sitä on käytetty monenlaisissa sovelluksissa, mukaan lukien solulyysi, solukalvoporaatio ja silmäkirurgia [11]. Strategioita leikkauksen jälkeisten, atrofisten ja aknen arpien ulkonäön turvalliseksi parantamiseksi on äskettäin osoitettu käyttämällä fraktioitavia ablatiivisia ja ei-nablatiivisia lasereita [12]. Ablatiivinen laserihon pinnoitus tarjoaa suurimmat kliiniset parannukset, mutta leikkauksen jälkeinen toipuminen kestää useita viikkoja [13]. Ei-nablatiiviset lasertoimenpiteet saattavat olla sopivampia potilaille, jotka eivät pysty tai eivät halua sietää pitkäkestoista postoperatiivista paranemista. Aikaisempi herpes simplex -infektio voi kuitenkin aktivoitua uudelleen ei-nablatiivisen laserihon uudelleenmuotoilun jälkeen laserin tai muun valonlähteen tuottaman voimakkaan lämmön vuoksi [13].

Lasersäteilyn tuottaman lämmön vähentämiseksi on kehitetty joitain menetelmiä, kuten kosketusjäähdytyskäsikappaleiden tai dynaamisten kryogeenisten laitteiden käyttö, jotka pystyvät tuottamaan vaihtelevan kestoisia jäähdytyssuihkeita [14]. Vielä ei kuitenkaan ole yksimielisyyttä siitä, mikä jäähdytysmenetelmä on tehokkain hoidon aikana. Lisäksi, toisin kuin Yhdysvalloissa, laserin aiheuttaman kavitaation vaikutusten taustalla stabiloiduilla päällystetyillä MB:illä nesteissä on edelleen epäselvä.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Albumin-Shelled MB:iden tuotanto

Albumiinikuorilliset MB:t valmistettiin aiemmissa tutkimuksissamme käytetyn menettelyn mukaisesti [7,15]. Lyhyesti sanottuna albumiinikuoriset MB:t tuotettiin sonikaatiolla 10 ml:ssa liuosta, joka sisälsi 140 mg albumiinia (Octapharma, Wien, Itävalta) ja perfluorihiilikaasua fysiologisessa suolaliuoksessa (pH 7,4, { {21}},9 prosenttia natriumkloridia) käyttämällä sonikaattoria (Branson Ultrasonics, Danbury, CT, USA) 2 minuutin ajan. Perflfluorihiilellä täytettyjen albumiinin MB:ien määrä liuoksessa mitattiin MultiSizer III -laitteella (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) 30-µm-aperture-anturilla ja mittausrajoilla 0,6–20 µm. Kokojakauma suspensiossa mitattiin dynaamisen valonsironta (Zetasizer Nano, ZS90, Malvern, UK), mikä paljasti, että albumiinikuorittujen MB:iden halkaisija oli 1,02 ± 0,11 µm (keskiarvo ± SD) ja pitoisuus 1,40 × 108 MBs/ml.

2.2. Laserin aiheuttama MB-häiriö 

Aiemmat tutkimukset ovat ehdottaneet, että USA:n välittämä MB-häiriö (eli inertiakavitaatio) vaatii tehokkaan TDD:n [8,16,17]. Tässä tutkimuksessa mitattiin MB-häiriön tehokkuutta käytettäessä erityyppisiä lasereita eri olosuhteissa. MB:n pitoisuus säädettiin arvoon 2,8 × 107 MBs/ml (viisinkertainen laimennus) ja 1,4 × 107 MBs/ml (kymmenkertainen laimennus) Eppendorf-putkessa, ja säteilytys toteutettiin neljällä laserilla: ilmajäähdytteinen argon-ioni-laser. (515 nm, jatkuva aalto), superjatkuvuuskuitulaser (1064 nm, pulssiaalto), Nd: YAG-laser (532 nm, pulssiaalto) ja CO2-fraktiolaser (10 600 nm, pulssiaalto). Erityyppisten lasereiden yksityiskohtaiset ehdot on lueteltu taulukossa 1.

Esimerkki optisesta asetelmasta on esitetty kuvassa 1. Lämpötilan muutos lasersäteilytyksen aikana mitattiin lämpömittarilla (Optris LS, Optris, Berliini, Saksa). Sitten laserille altistuksen jälkeen 100 ui MB-liuosta lisättiin mikroskoopin objektilasille tarkkailua varten. Valomikroskopiakuvien MB-määrät ennen lasersäteilytystä ja sen jälkeen muutettiin 8-bittisiksi harmaasävykuviksi MATLAB-tekniikalla (The MathWorks, Natick, MA, USA) MB-häiriöiden havaintojen helpottamiseksi. MB:iden tuhoutumisnopeus määritettiin vaurioituneiden alueiden mukaan seuraavan yhtälön avulla:

2.3. Siannahkaan tunkeutumissyvyys

2.4. In vitro ihon tunkeutuminen -arbutiiniliuoksella

{{0}} mm paksu näyte siannahasta otettiin Humby-veitsellä, puhdistettiin huolellisesti PBS:llä ja leikattiin neliömäisiksi paloiksi (2 cm × 2 cm). Ihonäytteiden pyöreät alueet, joiden säde oli 1,5 cm ja korkeus 5 mm, ympäröitiin geelillä vuodon estämiseksi, kun näytettä ladattiin 5{{30}}0 µl:lla MB:tä. Sen jälkeen, kun näyte oli säteilytetty seitsemän kertaa (olosuhteet on lueteltu taulukossa 1) CO2-fraktiolaserin avulla, ihon läpäisyä testattiin käyttämällä staattisia Franz-diffuusiokennoja 2,14 cm2:n alueella aiemmin kuvaamamme koesuunnitelman mukaisesti [7]. Diffuusiokokoonpanon lämpötila pidettiin 37 ◦C:ssa. -arbutiini (30 mg/ml, 500 µl, 4-hydroksifenyyli- -D-glukopyranosidi, molekyylimassa=272,25 Da; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) oli levitetty ihon epidermaaliselle puolelle ja peitetty parafilmillä (Pechiney Laboratory Safety Products and Apparel, Chicago, IL, USA). Ihon puolta päin oleva reseptoridiffuusioosasto täytettiin 12 ml:lla PBS:ää (pH 7,4), jota sekoitettiin 600 rpm:llä pyörivällä magneettisangolla. Testiliuokset, jotka eivät sisältäneet MB:itä, suodatettiin 02-µm mikrohuokossuodattimen (Nalgene, Rochester, NY, USA) tai 022-µm mikrohuokossuodattimen (Millex, Darmstadt, Saksa) läpi. Alikvootit (200 ui) reseptoriliuosta otettiin 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12 ja 24 tunnin kohdalla ja korvattiin samalla tilavuudella tuoretta reseptoriliuosta.

2.5. -arbutiinin HPLC-analyysi

-arbutiinipitoisuuksien mittaamiseen käytettiin Inspire™ C18 -kolonnia (250 mm × 4,6 mm, hiukkaskoko 5 µm; Dikma Technologies, Lake Forest, CA, USA). HPLC-järjestelmä varustettiin binääripumpulla (PU-2089, Jasco, Tokio, Japani), ja ultravioletti (UV) -detektorin (UV-2075, Jasco) aallonpituus asetettiin 280 nm:iin. Liikkuva faasi koostui metanolista: tislatusta vedestä (pH 5,5, 70:30 tilavuus/tilavuus) [18] nopeudella 0,6 ml/min. Kaikki analysoitavat näytteet injektoitiin 20 ui:n tilavuudella. -arbutiinin retentioaika oli noin 4,3 minuuttia.

2.6. Eläinten hoidot

Organoidien melaniinipitoisuutta tutkittiin C57BL/6J-hiirimallilla [19]. Viiden viikon ikäiset 20–25 g painavat hiiret saatiin Bio Lascosta (Taipei, Taiwan). Koeprotokollan hyväksyi Taiwanin Taipeissa sijaitsevan National Defense Medical Centerin laitoseläinten hoito- ja käyttökomitea. Eläinten hoidon menettelyt olivat laitosten ohjeiden ja määräysten mukaisia ​​(hyväksyntänumero IACUC-17-092). Kaikkien kokeiden ajan eläimiä pidettiin ruostumattomasta teräksestä valmistetuissa häkeissä ilmastoiduissa tiloissa, joiden lämpötila pidettiin 25–28 ◦C ja valon ja pimeyden vuorotellen 12 tuntia.

Eläimet sopeutuivat 7 päivää ennen koetta. Kun heidän karvansa oli poistettu 2 cm × 2 cm:n alueelta, ihon väri mitattiin kromametrillä (CR-400, Konica Minolta Sensing, Tokio, Japani). Tämän jälkeen eläimet altistettiin ultravioletti-B (UVB) -säteilylle (G8T5E, Sankyo, Tokio, Japani) hyperpigmentaation aiheuttamiseksi (energian kokonaisannos per altistus=1 J/cm2, aallonpituus=306 nm, kolme kertaa per viikolla 2 viikon ajan), minkä jälkeen ihon väri mitattiin uudelleen.

Eläimet jaettiin seuraaviin viiteen ryhmään (n {0}} ryhmää kohden, hoitoa käytettiin kerran 3 päivässä 20 päivän ajan): (1) ei hoitoa (ryhmä C); (2) tunkeutuvan -arbutiinin levitys yksinään (300 ug/ml, 0,2 ml/cm2) (ryhmä A); (3) ihon lasersäteilytys suoraan käyttämällä tunkeutuvaa -arbutiinia (300 ug/ml, 0,2 ml/cm2) (ryhmä L plus A); (4) lasersäteilytys suolaliuoksella peitetylle iholle ja levittämällä tunkeutuvaa -arbutiinia (300 ug/ml, 0,2 ml/cm2) (ryhmä L plus S plus A); ja (5) ihon lasersäteilytys yhdessä MB:iden kanssa iholla ja tunkeutuvan -arbutiinin (300 ug/ml, 0,2 ml/cm2) levittäminen (ryhmä L plus MB:t plus A). Kunkin käsittelyn aiheuttama muutos ihon värissä arvioitiin ennalta määrättyinä aikoina kromametriä käyttäen. Valoisuusindeksi L [20] laskettiin jokaisena mittauspäivänä ennen käsittelyä ja sen jälkeen.

2.7. Histologinen tutkimus

Ihokudosnäytteet (noin 8 mm × 8 mm) otettiin hoitoalueelta välittömästi kokeiden jälkeen ja säilytettiin 10-prosenttisessa formaliiniliuoksessa. Käytettiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäystä (HE; Sigma-Aldrich), ja asiantuntija-ihopatologi (HWG) analysoi näytteet. Jotkut muut näytteet värjättiin Fontana-Masson hopeanitraatilla (Kojima Chemical, Kashiwabara, Japani) 30 minuutin ajan 60 ◦C:ssa, pestiin sitten tislatulla vedellä ja kiinnitettiin 5-prosenttisessa natriumtiosulfaattiliuoksessa (Duksan, Soul, Korea) 2 min, ennen kuin peset uudelleen tislatulla vedellä. Sitten näytteet värjättiin ydinnopean punaisella liuoksella (Fluka, Buchs, Sveitsi) 5 minuutin ajan ja pestiin kahdesti tislatulla vedellä. Lopuksi näytteet kuivattiin 95-prosenttisesti, mitä seurasi 100-prosenttinen etanoli ja pestiin sitten kahdesti ksyleenillä (Duksan) [21].

2.8. Tilastollinen analyysi

Saadut tiedot analysoitiin tilastollisesti Studentin t-testillä. Todennäköisyysarvon p < 0,05 katsottiin merkitsevän merkittävää eroa.

3. Tulokset

3.1. Laserin aiheuttama MB-häiriö

Kuvassa 2 on mikroskooppikuvat viisinkertaisesti laimennetuista MB:istä ilman säteilytystä 10,8 mW:n jatkuvalla (ilmajäähdytteisellä argonioni) laserilla ja 10,8 mW:n pulssilaserilla (superjatkuvuuskuitu) laserilla 60, 120 ja 180 sekunnin ajan. pulssilaserin tuhoutumisnopeudet kasvoivat 17,66 prosenttia, 20,52 prosenttia ja 39,05 prosenttia jatkuvaan laseriin verrattuna 60, 120 ja 180 sekunnin kohdalla. Kuva 3 esittää viisi- ja kymmenkertaisesti laimennettujen MB:iden tuhoamistehokkuutta käytettäessä Nd:YAG-pulssilaseria 60, 120 ja 180 sekunnin kohdalla. Viisi- ja kymmenkertaisesti laimennettujen MB:iden tuhoutumisaste oli 72,46 prosenttia ja 78,59 prosenttia 60 sekunnin kohdalla, 88,06 prosenttia, 96,10 prosenttia 120 sekunnin kohdalla, 85,22 prosenttia ja 98,80 prosenttia 180 sekunnin kohdalla. Kuvio 4 esittää kymmenkertaisesti laimennettujen MB:iden tuhoamistehokkuutta, kun niitä säteilytetään yksi, kolme ja seitsemän kertaa kliinisellä CO2-fraktiopulssilasereilla. Tuhoamisnopeus kasvoi säteilytysajan myötä, ja se oli lähellä 100 prosenttia seitsenkertaisella säteilytyksellä, joten tätä tilaa käytettiin seuraavissa in vitro ja in vivo -kokeissa.

lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501