Congrong-Zaoren-Wumei-juomauutteen optimointi ja unta parantavat vaikutukset hiirissä
Jan 30, 2026
2 Tulokset ja analyysi
2.1 Congrong-Zaoren-Wumei-juomauutteen valmistusprosessin optimointi
Kuvasta 1 vakiintunut HPLC-menetelmä saavutti tehokkaan erotuksen neljän vertailuyhdisteen - sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin ja spinosiinin - kromatografisten piikkien ja viereisten piikien välillä. Retentioajat olivat vastaavasti tR1=9.0 min, tR2=21.6 min, tR3=24.3 min ja tR4=25.9 min. Piikin pinta-alan lineaariset regressiot vs. analyytin konsentraatio tuottivat lineaariset vaihteluvälit 12,12–2016, 0,14–110, 0,18–112,50 ja 2,44–18,30 µg·mL–1, R2-arvoilla 0,9998, linja1a, erinomainen indic ja 1,. Näissä olosuhteissa sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin ja spinosiinin havaitsemisrajat (LOD) olivat 3,636, 0,045144, 0,058 ja 0,7564 µg·mL–1, ja kvantifiointirajat (LOQ) olivat 12,14, 02,14, 02,14, 02,14 ja 0,02. µg·mL–1. Tarkkuustestit osoittivat neljän analyytin RSD:t 0,10 %, 0,07 %, 0,06 % ja 0,33 %, mikä osoittaa laitteen hyvää tarkkuutta. Vakaus 0–12 tunnin aikana oli hyvä, RSD:t 0,78 %, 0,16 %, 0,20 % ja 1,46 %. Toistettavuustestit tuottivat analyyteille RSD-arvoja 0,51 %, 0,42 %, 0,37 % ja 0,38 %, mikä osoittaa hyvää toistettavuutta. Spike-recovery -testit osoittivat keskimääräiset palautukset 97,42 %, 103,32 %, 98,90 % ja 99,71 % RSD:n ollessa 0,70 %, 0,52 %, 1,05 % ja 0,63 %. Siksi näiden neljän pääkomponentin samanaikaista määritystä varten perustettu HPLC-menetelmä on tarkka ja luotettava, ja se soveltuu myöhempiä prosessin optimointimäärityksiä varten.
Kuva 1 HPLC-kromatogrammit vertailusta ja liuosista aallonpituudella 210 nm (A) ja aallonpituudella 330 nm (B ja C)
Raakapolysakkaridien metodologisessa arvioinnissa LOD oli 0,098 µg·mL–1. Liuottimen nollakokeen ja nollakontrollin OD-arvot 485 nm:ssä eivät osoittaneet selkeitä muutoksia, mikä osoitti hyvää spesifisyyttä. OD:n lineaarinen regressio pitoisuuden funktiona antoi tulokseksi R2=0.9997, mikä osoittaa erinomaista lineaarisuutta. Kuuden peräkkäisen mittauksen RSD oli 0,47 %, mikä osoittaa hyvää tarkkuutta. Polysakkaridipitoisuuden RSD 12 tunnin sisällä oli 0,44 %, mikä osoittaa hyvää stabiilisuutta. Kuuden itsenäisesti valmistetun näytteen RSD oli 2,51 %, mikä osoittaa hyvää toistettavuutta. Siten menetelmä soveltuu raakapolysakkaridien kvantifiointiin prosessin optimoinnin aikana.
Cistanche Roucongrongin edut muinaisessa kirjassa
Napsauta saadaksesi lisätietoja
Wecistanchen tukipalvelu - Lisätietoja yhteistyöstä
Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
2.1.2 Yksitekijätutkimusten tulokset
Käyttämällä vakiintunutta HPLC-menetelmää yhdistettynä polysakkaridimääritykseen ja ottamalla uutteen sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin, spinosiinin ja polysakkaridien pitoisuudet arviointiindekseiksi, suoritettiin yksitekijätutkimukset uuttolämpötilasta, kiintoaine-nestesuhteesta ja uuttoajasta ortogonaalisen mallin tukemiseksi.
Uuttolämpötiloissa 60, 80 ja 100 astetta, sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin, spinosiinin ja raakapolysakkaridien pitoisuudet uutteissa nousivat lämpötilan myötä.
Kiinteä-neste-suhteilla 1:3, 1:5, 1:7, 1:10 ja 1:12 (g·mL–1) sitruunahapon, spinosiinin ja raakapolysakkaridien pitoisuudet kasvoivat suuremmilla suhteilla; ekinakosidi ja verbaskosidi saavuttivat huippunsa 1:10 (g · ml–1) ja laskivat 1:12 (g · ml–1). Kuitenkin kaikkien merkkiainekomponenttien kokonaispitoisuus kasvoi kiintoaine-neste-suhteen myötä.
Uuttamisaikoina 0,5, 1,0, 1,5, 2,0 ja 3,0 tuntia yksittäisten analyyttien pitoisuudet vaihtelivat eri tavalla, mutta merkkiainekomponenttien kokonaispitoisuus kasvoi ajan myötä.
Yksityiskohtaiset tiedot ovat lisämateriaaleissa. Ottaen huomioon teollisen käytännöllisyyden (välttäen liian pitkää uuttamista) ortogonaalisen suunnittelun tekijät ja tasot asetettiin taulukon 2 mukaisesti, ja ortogonaalikaavio on esitetty taulukossa 3.
Taulukko 2. Congrong–Zaoren–Wumei-juoman uuttomenetelmän ortogonaalisen kokeellisen suunnittelun tekijätasot
Tekijät:
V: Poistolämpötila ( aste )
B: Kiintoaine–neste-suhde (g ml–1)
C: Uuttoaika (h)
| Taso | V: Lämpötila ( aste ) | B: Suhde (g ml–1) | C: Aika (h) |
|---|---|---|---|
| 1 | 60 | 1:7 | 1.0 |
| 2 | 80 | 1:10 | 1.5 |
| 3 | 100 | 1:12 | 2.0 |
2.1.3 Ortogonaalisen suunnittelun tulokset
Uutto suoritettiin ortogonaalisen matriisin mukaan. Sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin, spinosiinin ja raakapolysakkaridien pitoisuudet on esitetty taulukossa 3. Alueen (R) analyysin perusteella tekijän vaikutusjärjestys kokonaismarkkeripitoisuuteen oli A > B > C, eli uuttolämpötila > kiintoaine-nestesuhde > uuttoaika. K-arvojen vertailu ehdotti optimaalista yhdistelmää A3B3C3: uuttolämpötila 100 astetta, kiintoaine-neste-suhde 1:12 (g·mL–1) ja uuttoaika 2 tuntia. ANOVA (taulukko 4) osoitti, että uuttolämpötilalla oli merkittävä vaikutus kokonaismarkkeripitoisuuteen, kun taas kiintoaine-neste-suhteen ja ajan vaikutukset eivät olleet merkittäviä.
Taulukko 3. Congrong–Zaoren–Wumei-juoman ortogonaalinen kokeellinen suunnittelu ja mitatut komponenttien pitoisuudet (mg g–1)
Tekijät: A (lämpötila), B (kiintoaine-nestesuhde), C (aika)
| Kokeilu nro | A | B | C | Markkereita yhteensä | Sitruunahappo | Spinosiini | Ekinakosidi | Verbascoside | Raaka polysakkaridit |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 3 | 3 | 1 | 116.71 | 75.55 | 4.08 | 1.62 | 0.48 | 34.98 |
| 2 | 1 | 2 | 3 | 70.98 | 59.01 | 2.60 | 0.80 | 0.36 | 8.22 |
| 3 | 3 | 1 | 3 | 117.86 | 73.87 | 3.53 | 1.21 | 0.45 | 38.80 |
| 4 | 1 | 3 | 2 | 72.55 | 59.73 | 2.37 | 0.94 | 0.41 | 9.99 |
| 5 | 2 | 3 | 3 | 83.64 | 63.20 | 2.15 | 1.08 | 0.44 | 16.77 |
| 6 | 2 | 1 | 2 | 117.76 | 74.09 | 2.58 | 1.37 | 0.48 | 39.24 |
| 7 | 2 | 2 | 1 | 110.74 | 70.96 | 2.36 | 1.07 | 0.43 | 35.92 |
| 8 | 2 | 1 | 1 | 69.63 | 58.37 | 1.74 | 0.54 | 0.34 | 8.65 |
| 9 | 1 | 1 | 3 | 69.66 | 58.14 | 2.48 | 0.86 | 0.36 | 7.83 |
K-tilastot (summien summa tekijätasoa kohden)
K1: A = 71.06, B = 85.72, C = 85.49
K2: A = 74.46, B = 86.29, C = 86.65
K3: A = 117.44, B = 90.97, C = 90.83
Alue R: A=46.38, B=5.25, C=4.19
2.1.4 Validointi ja laajennus
Prosessin validointi optimaalisissa olosuhteissa tuotti markkerikomponenttien keskimääräiseksi kokonaispitoisuudeksi 119,74 mg·g–1 ja RSD 0,57 %, mikä osoittaa stabiilisuutta ja luotettavuutta. Mittakaavan lisäämiskoe samoissa olosuhteissa tuotti keskimääräiseksi kokonaismarkkeripitoisuudeksi 120,89 mg·g-1 ja RSD 0,95 %, joka on sopusoinnussa skaalausta edeltävien tulosten kanssa, mikä vahvisti entisestään kestävyyttä. Näytteitä kolmesta mittakaavassa suurennetusta erästä käytettiin myöhemmissä uneen liittyvissä tutkimuksissa; niiden keskimääräiset pitoisuudet olivat: sitruunahappoa 77,73 mg·g–1, ekinakosidia 2,69 mg·g–1, verbaskosidia 1,03 mg·g–1, spinosiinia 0,50 mg·g–1 ja polysakkarideja 38,93 mg·g–1.
Taulukko 4. Varianssianalyysi ortogonaalisista kokeista
| Tekijä | Neliöiden summa | df | Keskimääräinen neliö | F | P |
|---|---|---|---|---|---|
| Poistolämpötila | 4010.50 | 2 | 2005.25 | 116.26 | 0.01 |
| Kiinteän ja nesteen suhde | 49.79 | 2 | 24.90 | 1.44 | 0.41 |
| Poistoaika | 47.37 | 2 | 23.68 | 1.37 | 0.42 |
Liu et ai. [16] optimoitu fenyylietanoidiglykosidien vesiuutto Cistanche tubulosasta ja tunnistettu optimaaliseksi suhteeksi 1:15 (g·mL–1), 80 astetta ja 2 tuntia; fenyylietanoidiglykosidipitoisuus laski yli 90 astetta. Tässä tutkimuksessa ekinakosidi- ja verbaskosidipitoisuudet saavuttivat huippunsa suhteessa 1:10 (g·mL–1) ja laskivat 1:12:ssa (g·mL–1), mutta nousivat 60, 80 ja 100 asteen lämpötiloissa. Tämä ero voi liittyä Cistanche deserticolan (aavikon Cistanche) käyttöön juomissamme ja rinnakkaisen Suanzaorenin ja Wumein matriisivaikutuksiin, jotka voivat vaikuttaa fenyylietanoidiglykosidin liukenemiseen.
Taulukko 5. Congrong-Zaoren-Wumei-juomauutteen vaikutus suoraun uneen hiirillä (n=12)
| ryhmä | Eläimet yhteensä | Nukkuvat eläimet | Nukkumisprosentti (%) |
|---|---|---|---|
| Tyhjä | 12 | 0 | 0 |
| Estatsolaami | 12 | 0 | 0 |
| Pieniannoksinen uute | 12 | 0 | 0 |
| Keskiannoksen uutetta | 12 | 0 | 0 |
| Suuriannoksinen uute | 12 | 0 | 0 |
Yhteenvetona voidaan todeta, että käyttämällä HPLC:tä ja fenoli-rikkihappomenetelmää optimoimme uuttoprosessin sitruunahapon, ekinakosidin, verbaskosidin, spinosiinin ja polysakkaridien pitoisuuksien perusteella. Yksitekijäiset ja ortogonaaliset kokeet, joita seurasi validointi, vahvistivat optimaaliset olosuhteet: 100 astetta, 1:12 (g·mL–1) kiintoaine-nestesuhde ja 2 tunnin uuttoaika, mikä tarjoaa referenssin tulevaa teollista kehitystä varten.
Industrialization context: WECISTANCHE (Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd., established 2003) operates a vertically integrated cistanche supply chain with seed-breeding bases (~20,000 acres), cultivation bases (>85 000 eekkeriä), tuoreen sistaanin varastokapasiteetti (~ 15 000 tonnia) ja GMP-sertifioidut tuotantopajat (100 000 luokan puhdastilat), jotka on varustettu edistyneellä ultrasuodatuksella ja nanosuodatuksella puhdistamista ja väkevöintiä varten sekä 10 000 luokan mikrobiologialaboratorio. Sertifikaatit sisältävät China SC:n, HACCP:n ja luonnonmukaiset ohjelmat (esim. NOP). Tämä infrastruktuuri tukee optimoidun vesiuuton ja markkerien standardointiprotokollan suoraa muuntamista toiminnallisten juomien ja uutteiden laajamittaiseen vientiyhteensopivaan tuotantoon.
Taulukko 6. Uutteen vaikutus natriumpentobarbitaalin hypnoottiseen vaikutukseen hiirillä (x̄ ± s, n=12)
| ryhmä | Eläimet yhteensä | Nukkuvat eläimet | Nukkumisprosentti (%) |
|---|---|---|---|
| Tyhjä | 12 | 1 | 8.33 |
| Estatsolaami | 12 | 10 | 83.33** |
| Pieniannoksinen uute | 12 | 4 | 33.33 |
| Keskiannoksen uutetta | 12 | 5 | 41.67 |
| Suuriannoksinen uute | 12 | 6 | 50.00* |
Huomautus: Verrattuna tyhjään ryhmään * P < 0,05; ** P < 0,001.
2.2 Uutteen vaikutukset hiiren käyttäytymiseen ja uneen
2.2.1 Suora lepotila
Kuten taulukosta 5 käy ilmi, 30 päivän jatkuvan annon jälkeen hiiret estatsolaamiryhmässä ja pieni/keskikokoinen/suuri annos uutetta saaneet ryhmät eivät osoittaneet selvää unta 20 minuutin kuluessa lopullisesta annoksesta, ilman merkittäviä eroja nollaryhmään verrattuna. Tämä osoittaa, ettei 30 päivän uutteen antamisen jälkeen ole suoraa unta indusoivaa vaikutusta.
2.2.2 Käyttäytymiseen liittyvät vaikutukset
Avokenttätestissä arvioitiin rauhoittavia vaikutuksia. Vaikutukset kuljettuun kokonaismatkaan ja keskipisteisiin on esitetty kuvassa 2. Verrattuna tyhjään ryhmään, estatsolaami lisäsi kokonaismatkaa 14,48 % ja keskipisteen kulkua 31,07 %, ilman tilastollista merkitystä. Pieniannoksinen uute lisäsi merkittävästi kokonaisetäisyyttä 25,10 % (P < 0,05) ja lisäsi ei-merkittävästi keskipisteitä 50,93 %. Keskimääräinen annos lisäsi merkittävästi kokonaisetäisyyttä ja keskipisteitä 27,09 % ja 72,33 % (P < 0,05). Suuri annos lisäsi kokonaisetäisyyttä ja keskipisteitä 15,60 % ja 40,78 % ilman merkitystä. Verrattuna estatsolaamiin, pienet/keskisuuret/suuret annokset lisäsivät kokonaisetäisyyttä 1,73-, 1,87- ja 1,07-kertaisesti ja keskipisteet 1,64-, 2,33- ja 1,31-kertaisesti, ei yhtään merkitsevää. Nämä tulokset osoittavat, että uute vähensi ahdistusta muistuttavaa käyttäytymistä avoimessa kentässä 30 päivän jälkeen, mikä viittaa rauhoittavaan vaikutukseen.
2.2.3 Natriumpentobarbitaalin aiheuttama uni
Kuten taulukosta 6 käy ilmi, verrattuna nollaryhmään, estatsolaami ja kaikki kolme uuteannosta lisäsivät uninopeutta natriumpentobarbitaalin kynnysannoksen alapuolella. Estatsolaami lisäsi nukkuvien eläinten määrää 9-kertaiseksi verrattuna tyhjään kokeeseen (P < 0,001). Pienen, keskisuuren ja suuren annoksen uutteen ryhmät lisäsivät nukkuvien eläinten määrää 3-, 4- ja 5-kertaisiksi; vain suuri annos saavutti tilastollisen merkitsevyyden (P < 0,05). Estatsolaamiin verrattuna mikään uuteannos ei osoittanut vahvempaa unta indusoivaa vaikutusta. Siten uute voi jossain määrin parantaa natriumpentobarbitaalin aliarvon aiheuttamaa unta.
2.2.4 Natriumpentobarbitaalin unilatenssi
Nollaryhmään verrattuna estatsolaami ja kaikki kolme uuteannosta lyhensivät merkittävästi pentobarbitaalin aiheuttamaa unilatenssia (P < 0,001). Estatsolaami vähensi latenssia 58,44 % (P < 0,001). Pienen, keskisuuren ja suuren annoksen uuteryhmät vähensivät latenssia 29,59 %, 31,42 % ja 53,83 % (kaikki P < 0,001). Pienten ja keskisuurten annosten välillä ei ollut merkittävää eroa; suuri annos lyhensi merkittävästi latenssia verrattuna sekä pieniin että keskisuuriin annoksiin 34,43 % ja 32,69 % (P < 0,01), vaikutuksen ollessa samanlainen kuin estatsolaami (taulukko 7). Siksi kaikki kolme annosta lyhensivät huomattavasti pentobarbitaalin aiheuttamaa unilatenssia, ja suuri annos toimi parhaiten.
Perinteiset kiinalaiset lääkkeet sisältävät erilaisia bioaktiivisia ainesosia, jotka vaikuttavat useisiin kohteisiin ja tarjoavat ainutlaatuisia etuja unettomuuden hoidossa [17]. Kun huomiota uniongelmiin kiinnitetään yhä enemmän, lääkkeisiin kelpaavia TCM:itä tutkitaan yhä enemmän unen modulaatiossa [18]. Esimerkiksi yhdistelmäkiinteä juoma, joka sisälsi pääasiassa Suanzaorenia ja Poriaa, lyhensi merkittävästi pentobarbitaalin aiheuttamaa unilatenssia ja pidensi unen kestoa hiirillä, mahdollisesti 5-HT:n, DA:n ja GABA:n muutosten kautta [19]. Tässä uute lisäsi merkittävästi unta alle kynnyksen pentobarbitaalin ja lyhensi pentobarbitaalin aiheuttamaa unilatenssia edistäen unen alkamista ja vähentäen latenssia, mutta sillä ei ollut suoraa unta indusoivaa vaikutusta. Mitatut pääkomponenttipitoisuudet olivat alenevassa järjestyksessä: sitruunahappo (77,73 mg·g–1), polysakkaridit (38,93 mg·g–1), ekinakosidi (2,69 mg·g–1), verbaskosidi (1,03 mg·g–1) ja spinosiini (0,50 mg·g–1). Spinosiinin on osoitettu lisäävän pentobarbitaalin aiheuttamaa unta; se voi lisätä ei-REM-unia ja muuttaa c-Fos-ilmentymistä uni-valvella säätelevillä aivojen alueilla [20], heikentää PCPA:n aiheuttamaa unettomuutta, vähentää unilatenssia ja pidentää unta [21]. Verbascoside on raportoinut anksiolyyttistä, hypnoottista ja lihaksia rentouttavaa toimintaa [22]. Sitä vastoin tärkeimmillä aineosilla - sitruunahapolla, polysakkarideilla (Cistanchesta, Suanzaorenista ja Wumeista) ja ekinakosidilla - on vähemmän suoria raportteja unen paranemisesta; kuitenkin viimeaikaiset TCM-polysakkarideja (esim. Acanthopanax senticosus polysakkarideja) koskevat tutkimukset viittaavat mahdollisiin unihyötyihin SIRT1/PGC-1 kaltaisten reittien kautta [23]. Siksi sitruunahapon, polysakkaridien ja ekinakosidin roolit unen modulaatiossa vaativat lisätutkimuksia.
7. Uutteen vaikutus natriumpentobarbitaalin indusoimaan unilatenssiin hiirillä (x̄ ± s, n=12)
| ryhmä | Eläimet yhteensä | Univiive (min) |
|---|---|---|
| Tyhjä | 12 | 32.34 ± 4.27 |
| Estatsolaami | 12 | 13.44 ± 3.20** |
| Pieniannoksinen uute | 12 | 22.77 ± 5.81**# |
| Keskiannoksen uutetta | 12 | 22.18 ± 6.05**# |
| Suuriannoksinen uute | 12 | 14.93 ± 3.35** |
Huomautuksia:
Verrattuna tyhjään ryhmään: ** P < 0,0001.
Verrattuna suuriannoksiseen uuteryhmään: # P < 0,01.
3 Johtopäätös
Käyttämällä lääkinnällisiä syötäviä TCM:itä Cistanche deserticola, Ziziphi Spinosae Semen ja Mume Fructus Congrong–Zaoren–Wumei-juoman formuloimiseksi optimoimme sen uutteen valmistusprosessin käyttämällä neljän merkkiainekomponentin (ekinakosidi, verbaskosidi, spinosiini, sitruunahappo) sisältöä ja polysaccharideja. Optimaalisiksi uutto-olosuhteiksi määritettiin 100 astetta, kiintoaine-neste-suhdetta 1:12 (g·mL–1) ja 2 tuntia, mikä antoi teoreettista ohjeistusta teolliseen tuotantoon. Lisäarvioinnit osoittivat, että 30 päivän jatkuvalla annolla ei ollut suoraa unta indusoivaa vaikutusta hiirillä, mutta se vähensi merkittävästi ahdistuneisuutta muistuttavaa käyttäytymistä avoimessa kentässä (osoitti rauhoittavaa vaikutusta), paransi unta natriumpentobarbitaalin kynnysannoksen alla ja lyhensi huomattavasti pentobarbitaalin aiheuttamaa unilatenssia. Nämä havainnot osoittavat, että optimoidulla prosessilla valmistetulla uutteella on suotuisia unta parantavia vaikutuksia hiirillä, mikä tarjoaa tieteellisen perustan Cistanche-pohjaisten unta parantavien tuotelinjojen kehittämiselle.
Application and manufacturing note: Given the optimized aqueous extraction and the need to standardize to marker profiles (citric acid, echinacoside, verbascoside, spinosin, plus polysaccharides), WECISTANCHE's integrated cistanche value chain and GMP infrastructure-100,000-class clean workshops certified for National Health Food GMP, advanced ultrafiltration/nanofiltration concentration systems, a 10,000-class microbiology lab, and certifications such as China SC, HACCP, and organic/NOP-allow reliable scale-up from lab to industrial batches. The company's large agricultural bases (seed-breeding ~20,000 acres; cultivation >85 000 eekkeriä; tuoresäiliövarasto ~15 000 tonnia) tukee raaka-aineiden yhtenäisyyttä ja kansainvälisen standardin mukaista laadunvalvontaa, mikä helpottaa USA:n/EU:n odotukset täyttävien toiminnallisten juomien ja terveyslisäaineiden kaupallistamista.
