Komplementtiaktiivisuutta säätelevät C3-glomerulopatiassa IgG-tekijä H -fuusioproteiinit Properdin-kohdistusdomeenien kanssa ja ilman niitä

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Alyssa C. Gilmore, Yuchun Zhang, H. Terence Cook', Deborah P. Lavin, Suresh Katti, YiWang2, Krista K. Johnson, SungKwon Kim² ja Matthew C. Pickering

"Inflammatoristen tautien keskus, Imperial College London, Yhdistynyt kuningaskunta; and²Alexion Pharmaceuticals, New Haven, Connecticut, USA

C3 glomerulopatiaon ominaista komplementin C3 kerääntyminen glomeruluksiin. Syitä ovat, mutta eivät rajoitu niihin, poikkeavuudet tekijässä H, joka on komplementin vaihtoehtoisen reitin pääasiallinen negatiivinen säätelijä. Tekijä H-puutteellisilla (Cfh-/-) hiirillä kehittyy C3glomerulopatiayhdessä plasman C3-pitoisuuden alenemisen kanssa. Tämän mallin avulla arvioimme kahden fuusioproteiinin tehokkuuden, jotka sisältävät H-tekijän vaihtoehtoisen reitin säätelydomeenit (FH1-5).

liitettynä joko ei-kohdennettuun hiiren immunoglobuliiniin (IgG-FH1-5) tai anti-hiiri-propadiinivasta-aineeseen (Anti-P-FH1-5). Molemmat proteiinit lisäsivät plasman C3:a ja vähensivät glomerulusten C3:n kertymistä vastaavassa määrin, mikä viittaa siihen, että FH1-5 ei tarvinnut kohdistamista oikeaan C3:n aktivaatioon plasmassa tai glomeruluksissa. IgG-FH1-5:n antamisen jälkeen plasman C3-tasot korreloivat ajallisesti muutostekijä B:n pitoisuuksien kanssa, kun taas plasman C5-tasot korreloivat plasman megfelelődiinitasojen muutoksiin. Erityisesti plasman lisääntyminen

C5- ja megfelelődiinitasot säilyivät pidempään kuin C3- ja tekijä B:n nousu. Cfh-/--hiirillä IgG-FH1-5 vähensi munuaisvaurioita kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin aikana. Näin ollen tietomme osoittavat, että IgG-FH1-5 palautti verenkierron vaihtoehtoisen reitin aktiivisuuden ja vähensi glomerulaarista C3-kertymää Cfh-/--hiirissä ja että plasman propidiinitasot ovat herkkä C5-konvertaasiaktiivisuuden merkki tekijä H:n puutteessa. Immunoglobuliinikonjugoitu FH1-5-proteiini voi suhteellisen pitkän plasman puoliintumisajan ansiosta olla mahdollinen C3-hoitoglomerulopatia.

Cistanche voi auttaa glomerulopatiassa

Käännöslausunto

C3 glomerulopatia(C3G) on munuaissairaus, jolle on ominaista epänormaali komplementin C3 kerääntyminen glomeruluksiin ja glomerulusten vaurio. Se johtuu komplementin vaihtoehtoisen reitin hallitsemattomasta aktivaatiosta. Fuusioproteiinit, jotka koostuivat vaihtoehtoisen reitin säätelijän, tekijä H:n (FH) toiminnallisista domeeneista, jotka on liitetty vasta-aineeseen, palauttivat komplementin säätelyn ja vähensivät glomerulaarista C3:a C3G-hiirimallissa. Ei-kohdennettu vasta-ainekonjugaatio johti suhteellisen pitkään fuusioproteiinin puoliintumisaikaan plasmassa, ja tätä tai vastaavia konjugaatiomenetelmiä voitiin käyttää lisäämään FH-toimintoa C3G:n hoidossa.

C3 glomerulopatia(C3G) on komplementtivälitteinen munuaissairaus, jolle on tunnusomaista epänormaalit määrät C3:a glomeruluksissa.1 Se voi edetä munuaisten vajaatoimintaan, eikä sille ole varmaa hoitoa.2 C3G liittyy komplementin vaihtoehtoisen reitin (AP) epänormaaliin aktivaatioon. AP-aktivaatio johtaa C3bBb:n (C3-konvertaasi) tuotantoon, entsyymiin, joka pilkkoo C3:n. Toisen C3b-molekyylin lisäämisen jälkeen tuloksena oleva C3bBbC3b-kompleksi (C5-konvertaasi) voi pilkkoa komplementin C5:n. Hallitsematon

AP:n aktivaatio C3G:ssä voi liittyä verenkierron C3:n, C5:n, tekijän B:n (FB) ja propridiinin vähenemiseen. Hallitsemattoman AP-aktivaation syitä ovat komplementin säätelijöiden toimintomuutosten menetys ja komplementtiaktivaattoreiden toiminnan muutosten lisääntyminen.2 Keskeinen negatiivinen AP:n säätelijä on tekijä H (FH), ja FH-puutos ihmisillä, sioilla ja hiirillä liittyy C3G:hen. 3 C3-nefriittitekijä, AP C3-konvertaasia stabiloiva vasta-aine on yleinen C3G:ssä.4 C3-nefriittitekijä voi johtaa pelkän C3:n (oikeasta riippumaton C3-nefriittitekijä) vähenemiseen tai sekä C3:n että C5:n (properdiini- riippuvainen C3-nefriittitekijä).5,6

Vaikka oikeadiinin puute ei parantanut plasman C3-tasoja, C5-tasot nousivat, mikä viittaa siihen, että propidiini oli välttämätön C5-konvertaasin, mutta ei C3-konvertaasin, toiminnan kannalta.8,9

Mouse10:n tai ihmisen FH11,12:n antaminen Cfh–/–-hiirille vähensi glomerulusten C3-värjäytymistä ja lisäsi verenkierron C3-tasoja. Rakenteet, jotka sisältävät vain FH:n säätely- ja kohdedomeenit (mini-FH-molekyylit), ovat myös tehokkaita tässä mallissa.13 Muita lähestymistapoja ovat proteiinit, jotka kohdistuvat komplementin aktivaatiokohtiin. Näitä ovat TT30,14 proteiini, joka sisältää FH:n (FH1-5) komplementtia säätelevät domeenit liitettynä komplementtireseptori 2:n komplementtia sitoviin domeeneihin, ja homodimeeriset FH-molekyylit,15 mini-FH-molekyyliä, jotka sisältävät komplementtia sitovia domeeneja. H-tekijään liittyvää proteiinia 1.

Koska komplementin C3-aktivaation estämisen terapeuttista hyötyä tutkitaan C3G:ssä2, on tärkeää ymmärtää glomerulusten C3-kertymän kinetiikka ja sen suhde AP-aktivaatioon sekä glomeruluksissa että verenkierrossa. Immuunikompleksivälitteisen glomerulonefriitin malleissa glomerulaarinen C3c poistui 24 tunnin kuluessa komplementin aktivoitumisen estämisestä, kun taas glomerulaarinen C3d säilyi viikkoja.16 Vastaavasti Cfh–/–-hiirillä eksogeeninen FH johtaa glomerulusten C3c-värjäytymisen vähenemiseen 24 tunnin kohdalla. , kun taas glomerulaarinen C3d pysyy muuttumattomana.11

Tässä tutkimuksessa tutkimme kahden uuden fuusioproteiinin, joilla on komplementtisäätelyaktiivisuutta, tehokkuutta C3G:n Cfh–/–-hiirimallissa. Proteiinit sisälsivät hiiren FH:n (FH1-5) säätelydomeeneja, jotka konjugoitiin hiiren Ig:hen biologisen puoliintumisajan pidentämiseksi. Yksi fuusioproteiineista, nimeltään IgG-FH1-5, konjugoitiin ei-kohdennettuun hiiren monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Toinen, nimeltään anti-P-FH1-5, konjugoitiin hiiren propidiinin monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Tämä tehtiin sen hypoteesin testaamiseksi, että tämän fuusioproteiinin kohdistaminen komplementin aktivaatiokohtiin vuorovaikutuksessa megfelelődiinin kertymisen kanssa tehostaisi kudoskomplementin säätelyä. Tietomme osoittavat, että sekä ei-kohdistuva (IgG-FH1-5) että prodiiniin kohdistuva (anti-P-FH1-5) proteiini palautti plasman ja glomerulaarisen C3-säätelyn Cfh–/–-hiirissä. Aikavälitutkimukset osoittivat, että C3- ja FB-tasojen palautuminen heijasteli verenkierrossa olevien fuusioproteiinien tasoa. Sitä vastoin plasman C5:n nousu jatkui sen jälkeen, kun fuusioproteiinit olivat poistuneet verenkierrosta. Osoitamme, että IgG-FH1-5 paransi munuaiskerästen vaurioita kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin aikana Cfh–/–-hiirillä.

cistanche voi hoitaa munuaissairauksia parantaa munuaisten toimintaa

TULOKSET

Fuusioproteiinien tuottaminen ja aktiivisuuden arviointi in vitro ja in vivo Fuusioproteiinit luotiin yhdistämällä hiiren FH:n (FH1-5) ensimmäiset 5 lyhyttä konsensustoistodomeenia (SCR) joko anti-hiiri-propadiinivasta-aineeseen (anti -P-FH1-5) tai vasta-aine, jolla on ei-kohdennettu Ig-domeeni (IgG-FH1- 5, täydentävä kuva S1). Proteiinien aktiivisuus arvioitiin käyttämällä AP-spesifistä hemolyyttistä määritystä (kuvio la). Anti-P-FH1-5 ja IgG-FH1-5 estivät hemolyysiä annoksesta riippuvaisella tavalla ja anti-P-FH1-5 on tehokkaampi. Anti-properdiini (anti-P) vähensi myös hemolyysiä annoksesta riippuvalla tavalla, mutta IgG-kontrollilla ei ollut vaikutusta. Proteiinien ekvimolaaristen injektioiden jälkeen Cfh–/–-hiiriin IgG-FH1-5-proteiini oli havaittavissa 11 päivää injektion jälkeen, kun taas anti-P-FH1-5 oli havaittavissa jopa 4 päivää injektion jälkeen. injektio (lisäkuva S2). Sen määrittämiseksi, voisivatko IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 palauttaa plasman AP-sääntelyn Cfh–/–-hiirissä, mittasimme ensin plasman C3-tasot fuusioproteiinien injektion jälkeen (kuva 1b). . Joko IgG-FH1-5:n tai anti-P-FH1-5:n antaminen lisäsi merkittävästi plasman C3:a 24 tunnin kohdalla ja vähemmässä määrin 96 tunnin kuluttua injektiosta (kuva 1b). Nämä tiedot osoittivat, että sekä IgG-FH1-5 että anti-P-FH1-5 voivat tilapäisesti palauttaa plasman AP-sääntelyn Cfh–/–-hiirissä. Seuraavaksi suoritimme näiden muutosten yksityiskohtaisen analyysin karakterisoimalla ei vain plasman C3:n, vaan myös plasman C5:n ja vaihtoehtoisten reittien proteiinien FB ja propidiinin muutosten aikakulkua. Verenkierron C5- ja megfelelődiinitasojen nousut jatkuvat pidempään kuin C3:n ja FB:n nousu IgG-FH1-5- ja anti-P-FH1-5-annoksen jälkeen Cfh–/–-hiirille.

Vertasimme C3:n, C5:n, FB:n ja propertydin muutosten kinetiikkaa mittaamalla proteiineja 27 päivän välein joko IgG-FH1-5- tai anti-P-FH1-5 -injektion jälkeen ( kuva 2). IgG-FH1-5:n antamisen jälkeen C3:n, C5:n, FB:n ja propidiinin huippukohoaminen tapahtui päivänä 1 injektion jälkeen. Aika, jolloin nämä muutokset putosivat esikäsittelyä edeltäville tasoille, vaihteli. Paluu esikäsittelytasolle tapahtui päivien 1 ja 4 välillä FB:lle, päivien 7 ja 11 välillä C3:lle ja päivien 14 ja 21 välillä sekä prodiinille että C5:lle (kuvio 2a, c, e ja g). Anti-P-FH1-5:n antamisen jälkeen C3-huipputasot saavutettiin päivänä 1, mutta putosivat hoitoa edeltäville tasoille päivien 4 ja 7 välillä (kuvio 2b). C5-huipputasot tapahtuivat päivänä 4 ja palasivat hoitoa edeltäville tasoille päivien 7 ja 11 välillä (kuvio 2d). FB:n huippunousu tapahtui päivänä 1 ja laski hoitoa edeltävälle tasolle päivien 1 ja 4 välillä (kuvio 2f). Kuten odotettiin, vapaa plasman prodiini oli lopussa joko anti-P-FH1-5- tai anti-P-injektion jälkeen (kuvio 2h). Plasman vapaan propidiinin tasot pysyivät alhaisina jopa 7 päivää anti-P-FH1-5 jälkeen ja jopa 14 päivää anti-P:n jälkeen (kuva 2h). Vaikka molemmat fuusioproteiinit palauttivat tilapäisesti plasman AP-sääntelyn, C3-, FB- ja C5-tasojen paranemisen kesto heijasti niiden havaitsemisen kestoa plasmassa, joka oli lyhyempi anti-P-FH1-5 (lisäkuva S2) . Yhteenvetona, muutokset C3- ja FB-tasoissa kumman tahansa proteiinin injektion jälkeen olivat lyhyempiä kuin C5:n ja propidiinin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että plasman FB on herkkä C3-konvertaasiaktiivisuuden markkeri tässä tilanteessa, kun taas prodiini on C5-konvertaasiaktiivisuuden merkki. Erityisesti anti-P-injektion jälkeen C5 nousi klo 24 ja 96 tuntia ja päivä 7

Kuva 1| (a) Täydennä vaihtoehtoisesta reitistä riippuvaista hemolyysimääritystä. Vasta-aineet titrattiin 2--kertaisina laimennoksina 60 nM - 0,5 nM. IgG-FH1-5, anti-P-FH1-5 ja anti-P reagenssit vähensivät kanin punasolujen hemolyysiä annoksesta riippuvalla tavalla. IgG-kontrolliproteiinin estoa ei käytetty. Vaakapalkit osoittavat keskiarvoja ja virhepalkit SD. (b) Plasmakomplementti C3 Cfh–/–-hiirissä fuusioproteiinien injektion jälkeen. Plasma C3 mitattiin ennen ja 24 tuntia ja 96 tuntia sen jälkeen IgG-FH1-5 (punaiset kolmiot, n ¼ 5) Anti-P-FH1-5 (violetit kolmiot, n ¼ 6), Anti -P (vihreät pisteet, n ¼ 5) ja IgG-kontrolli (siniset pisteet, n ¼ 5). Vaakapalkit osoittavat keskiarvoja ja viikset SD. ***P # 0,001 verrattuna esikäsittelyarvoon ja johdettu 2-tapa-ANOVAsta Bonferronin useiden vertailujen testillä. FH, tekijä H; P, prodiini.

(Kuva 2d). Kuten raportoitu, 8, 9 osoittaa, että C5-konvertaasi on riippuvainen oikeasta Cfh-/- hiirissä.

IgG-FH1-5 ja anti-P-FH1-5 vähensivät glomerulaarista C3c:tä, mutta eivät muuttaneet C3d-värjäytymistä Cfh–/–-hiirissä

Seuraavaksi arvioimme IgG-FH1-5- ja anti-P-FH1-5-vaikutuksen glomerulaarisiin C3b/iC3b/C3c-, C3d-, propediini- ja FH-sukuisiin (FHR) proteiineihin. 96 tuntia IgG-FH1-5-injektion jälkeen glomerulaarinen C3b/iC3b/C3c-värjäytyminen väheni, mutta glomerulaarinen C3d- (kuva 3a) ja FHR-värjäytyminen (kuva 3b) ei. Glomerulaarinen C3b/iC3b/C3c pysyi muuttumattomana joko IgG-kontrollin tai anti-P:n kanssa. Epänormaali lineaarinen glomerulaarisen prodiinivärjäytymisen kuvio hoitamattomissa Cfh–/–-hiirissä9 säilyi 96 tuntia IgG-kontrollin jälkeen. Cfh–/–-hiirillä, joille oli injektoitu joko anti-P- tai IgG-FH1-5, glomerulaarinen propidiinitaso oli lähes havaittavissa 96 tunnin kohdalla (kuva 3b). Yllättäen anti-P-FH1-5-injektio johti rakeiseen glomerulaariseen värjäytymiskuvioon käyttämällä anti-properdiini-, anti-FH/FHR- ja anti-IgG-vasta-aineita (kuva 3b). Tämä löytö viittasi siihen, että anti-P-FH1-5-proteiini oli kertynyt glomeruluksiin. Anti-P-FH1-5-proteiinin injektio villityypin hiiriin johti glomerulusten värjäytymiseen anti-properdiini-, anti-FH/FHR- ja anti-IgG-vasta-aineilla 96 tunnin kohdalla (lisäkuva S3), mikä osoittaa, että tämä reagenssi on vuorovaikutuksessa normaalien glomerulusten kanssa. Arvelimme kuitenkin, että anti-P-FH1-5-proteiini voisi myös olla vuorovaikutuksessa olemassa olevan glomerulaarisen prodidiinin kanssa Cfh–/–-hiirissä. Kun injektoimme reagenssia Cfh–/–-hiiriin, joita oli esikäsitelty anti-P:llä glomerulaarisen prodiinin poistamiseksi, rakeiset värjäytymiskuviot vähenivät käyttämällä anti-properdiini-, anti-FH/FHR- ja anti-IgG-vasta-aineita ( Täydentävä kuva S4). Nämä havainnot osoittavat, että anti-P-FH1-5-proteiinin munuaiskerästen vuorovaikutus Cfh–/–-hiirissä on osittain riippuvainen glomerulaarisesta prodiinista.

IgG-FH1-5 paransi munuaisvaurioita kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin aikana Cfh–/–-hiirillä

C3G-potilailla voi kehittyä akuutti munuaisvaurio välillisten infektioiden yhteydessä. Esimerkiksi munuaisten toiminnan menetys FHR5-nefropatiassa liittyy synfaryngittisen makroskooppisen hematurian jaksoihin.17 Taustalla oleva C3-säätelyhäiriö C3G-potilailla johtaa todennäköisesti lisääntyneeseen komplementtivälitteiseen munuaisvaurioon laukaisun jälkeen, joka johtaa munuaistulehdukseen. Tämän mallintamiseksi indusoimme kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitti, immuunikompleksi

Kuva 2| Plasmakomplementin profiilin aikakulku Cfh–/–-hiirissä, joihin on injektoitu IgG-FH1-5- ja anti-P-FH1-5. Plasma C3 (a,b), C5 (c,d), FB (e,f) ja propertydin (P; g,h) kokeen alusta 27 päivään IgG-FH{{1{{21 }}}} (a,c,e,g; punaiset kolmiot, n ¼ 5) tai anti-P-FH1-5 (b,d,f,h; violetit kolmiot, n ¼ 6). Kontrollit sisälsivät anti-P:n (vihreät pisteet, n ¼ 5) ja isotyyppiä vastaava monoklonaalinen vasta-aine (IgG-kontrolli; siniset pisteet, n ¼ 5). Vaakapalkit osoittavat keskiarvoja ja viikset SD. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 verrattuna esikäsittelyarvoon ja johdettu 2-varianssin tapa-analyysistä Bonferronin useiden vertailujen testillä. FB, tekijä B; FH, tekijä H.

glomerulonefriittimalli, joka sisältää komplementti- ja Fc-reseptorivälitteiset reitit,18,19 Cfh–/–-hiirillä. Aiemmin osoitimme, että Cfh–/–-hiiret ovat yliherkkiä munuaisvaurioille tässä tilanteessa7 ja oletimme, että FH1-5-proteiini voi parantaa AP:n säätelyä parantamalla komplementtivälitteistä munuaisvauriota tässä mallissa. Koska tietomme osoittivat, että anti-P-FH1-5-proteiini oli kerrostunut normaaleihin munuaiskeräsiin, käytimme IgG-FH1-5-proteiinia kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin aikana. 24 tuntia ennen lampaan nefrotoksisen seerumin injektiota hiiret saivat joko IgG-kontrollin (n ¼ 7) tai IgG-FH1-5 (n ¼ 8) ip-injektion. Kokeellinen protokolla on kuvattu kuvassa 4a. Hiiret teurastettiin 6 päivää lampaan nefrotoksisen seerumin antamisen jälkeen. Kaikki kolme glomerulaarisen patologian histologista mittaa (vakavuuspisteet, solujen kokonaismäärä ja makrofagien lukumäärä) olivat merkittävästi alhaisempia IgG-FH1-5-ryhmässä (kuva 4b). Tubulointerstitiaalinen vaurio oli myös pienempi IgG-FH1-5-ryhmässä (kuva 4b). Seerumin urea oli huomattavasti kohonnut

Kuva 3| Glomerulaarisen komplementin immunovärjäys Cfh–/–-hiirillä 96 tuntia joko IgG-FH1-5- tai anti-P-FH1-5-injektion jälkeen. (a) Edustavia kuvia yhdessä glomerulaaristen C3b/iC3b/C3c:n ja C3d:n kvantifioinnin kanssa neljässä koeryhmässä: IgG-FH1-5 (punaiset kolmiot, n ¼ 5), anti-P-FH1-5 (violetit kolmiot, n ¼ 6), anti-P (vihreät pisteet, n ¼ 5) ja IgG-kontrolli (siniset pisteet, n ¼ 5). (b) Datapisteet edustavat mediaaniarvoja ja viikset osoittavat kvartiiliväliä. P-arvot johdettu Kruskal-Wallis-testistä Dunn-monivertailutestillä. (b) Edustavia kuvia glomerulaarisesta IgG:stä, FHR:stä ja värjäyksestä neljässä kokeellisessa ryhmässä. Tanko ¼ 100 mm. AFU, mielivaltaiset fluoresoivat yksiköt; FH, tekijä H; P, prodiini. Jos haluat optimoida tämän kuvan katselun, katso tämän artikkelin online-versio osoitteessawww.kidney-international.org.

IgG-kontrolliryhmä, mutta seerumin albumiinin ja virtsan albumiinin ja kreatiniinin suhteen muutokset eivät eronneet (kuvio 4b). Kuten odotettiin, glomerulaarinen C3b/iC3b/C3c väheni merkittävästi IgG-FH1-5-ryhmässä (kuva 4b), mutta glomerulaarinen hiiren IgG (kuva 4b) ja lampaan IgG (tietoja ei näy) eivät eronneet ryhmien välillä. .

Kuva 4| Esikäsittely IgG-FH1-5 paransi munuaisvaurioita kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin aikana Cfh–/–-hiirillä. (a) Kaavio nopeutetun seerumin nefrotoksisen nefriittiprotokollasta. Lampaan IgG:llä esiimmunisoidut hiiret saivat joko IgG-FH1-5 (hoitoryhmä, n ¼ 8) tai IgG-kontrolli (kontrolliryhmä, n ¼ 7) 24 tuntia ennen lampaan nefrotoksisen seerumin antamista. (b) Munuaisten toiminta ja histologia 6 päivää kiihtyneen seerumin nefrotoksisen nefriitin induktion jälkeen hiirillä, joita hoidettiin joko IgG-FH1-5:lla (hoito; punaiset kolmiot, n ¼ 8) tai IgG-kontrollilla (kontrolli; siniset ympyrät, n ¼ 7). Vaakapalkit osoittavat mediaaniarvoja ja viikset merkitsevät kvartiilien välistä aluetta. *P # 0.05, **P # 0,01, ***P # 0,001 verrattuna kontrolliin ja johdettu Mann-Whitneyn testistä. FH, tekijä H; P, prodiini.

KESKUSTELU

Sekä IgG-FH1-5 että anti-P-FH1-5 normalisoivat C3-, FB- ja C5-tasot Cfh–/–-hiirissä. Tämä havainto on yhdenmukainen sen tosiasian kanssa, että hiiren FH:n komplementin säätelydomeenit sijaitsevat SCR-domeeneissa 1–5 (C3b-sitoutumiskohta ja kofaktoriaktiivisuus tekijä I:n välittämässä C3b:n katkaisussa).20 Pintatunnistusdomeenit, jotka vaikuttavat sitoutumiseen hepariiniin ja endoteelisoluihin ja sisältävät toisen C3b:tä sitovan kohdan, ovat läsnä SCR-domeeneissa 18-

20 (FH18-20) ja siksi niitä ei ole läsnä fuusioproteiineissa.20 Siitä huolimatta molemmat proteiinit vähensivät glomerulaarista iC3b/C3b/C3c:tä, mikä osoittaa, että FH18-20 ei ollut tarpeen tässä asetuksessa. Tämä havainto on yhdenmukainen aiempien tietojen kanssa, jotka osoittavat, että Cfh–/–-hiiret, jotka ekspressoivat mutantti-FH-proteiinia, joka koostuu SCR-domeeneista 1–15 (Cfh–/– .FHD16-20), eivät kehittäneet epänormaalia glomerulaarista C3-kertymää.21,22 Cfh–/–.FH D16-20 -eläimet eivät kuitenkaan kyenneet säätelemään C3:n aktivaatiota munuaisten endoteelissä, ja niille kehittyi tromboottinen mikroangiopatia. On mahdollista, että pintaan kohdistuvien FH18-20-domeenien puuttumisen vuoksi FH1-5-proteiinia sisältävien fuusioproteiinien antaminen FH-puutostilanteessa voi johtaa alttiuteen tromboottiselle mikroangiopatialle. On myös mahdollista, että lisääntynyt aviditeetti C3b:n sitoutumiselle fuusioproteiinien dimeerisen rakenteen alla on riittävä kompensoimaan pintaan kohdistuvien FH18-20-domeenien puuttumisen. C3b:n pinnan tunnistamiseen vaikuttavat kuitenkin myös FH:n konformaatiomuutokset.23 Streptococcus pneumoniae FH:ta sitova proteiini (PspCN, joka sitoo SCR-domeenia 9), laukaisee FH-konformaatiomuutoksen, ja FH-PspCN-kompleksi oli lisännyt C3b:n sitoutumista ja lisääntynyt rappeutumista kiihdyttävä aktiivisuus. FH20 C3d-sitoutumiskohta ei paljasteta FH:ssa, mutta paljastuu FH-PspCN-kompleksissa. Tämä saattaa selittää, miksi FH19-20 on vuorovaikutuksessa pinnan C3d kanssa, mutta FH ei.24,25 Arvelemme, että aineemme voivat konformaatiomuutosten kautta olla tehokkaasti vuorovaikutuksessa sekä nestefaasin että pinnan C3b kanssa. Erityisesti sekä IgG-FH1-5 että anti-P-FH1-5 suojasivat erytrosyyttejä hajoamiselta AP-riippuvaisessa hemolyysimäärityksessä.

Kumpikaan fuusioproteiini ei vähentänyt glomerulaarisen C3d-värjäytymistä, ehkä johtuen glomerulaarisen C3d:n pysyvästä luonteesta. Kokeellisessa immuunikompleksinefriitissä glomerulaarinen C3c hävisi 24 tunnin kuluessa komplementin aktivaation lopettamisesta, mutta C3d säilyi viikkoja.16 Lisäksi glomerulaarinen C3d on pysyvä lupusnefriitissä.26 Tämä heijastaa todennäköisesti sen kovalenttista vuorovaikutusta glomerulusten pintojen kanssa. Ihmisen FH:n toistuvat injektiot Cfh–/–-hiirissä osoittivat glomerulaarisen C3d:n vähenemisen 10 päivän aikana.11 On todennäköistä, että IgG-FH1-5:n toistuva annostelu saattaa vähentää glomerulaarista C3d:tä tässä mallissa. Myöskään glomerulusten FHR-värjäytymisessä ei tapahtunut muutosta. Hiiren FHR-proteiinien toiminnoista tiedetään vähän, mutta ne voivat olla vuorovaikutuksessa sekä C3b27:n,28:n että C3d:n kanssa.27 Itse asiassa sekä FHR-A:n että FHR-B:n näennäinen affiniteetti C3d:hen on vahvempi kuin FH:n.27 Arvelemme, että glomerulaariset FHR-proteiinit todennäköisesti poistuvat glomeruluksista vain, kun C3d on poistettu. Tässä yhteydessä on huomionarvoista, että ihmisen C3G:ssä H-tekijään liittyvä proteiini 5 liittyy glomerulaariseen C3d.29:ään.

Anti-P-FH1-5-proteiini vähensi plasman vapaan properdiinin tasoja odotetusti, koska tämän fuusioproteiinin anti-properdiiniosa voi estää AP-aktiivisuuden (properdiinin ehtymisen vuoksi) 8 päivän ajan yhden injektion jälkeen.30 tietomme osoittivat, että FH1-5:n teho plasman C3-tasojen lisäämisessä ja munuaiskerästen C3b/iC3b/C3c-värjäytymisen vähentämisessä oli vertailukelpoinen kahden fuusioproteiinin välillä (eli oli riippumaton propidiinin kohdentamisesta). Lisäksi epänormaali munuaiskerästen värjäytyminen väheni merkittävästi joko anti-P:n tai IgG-FH:n1-5 antamisen jälkeen. Ilmeisesti, toisin kuin C3d- ja FHR-proteiineissa, glomerulaarinen prodiini poistuu helposti C3-säätelyn palautumisen jälkeen. Glomerulaarinen prodiini muuttui kuviossaan anti-P-FH1-5-proteiinin antamisen jälkeen, mutta tätä monimutkaisi havainto, että havaitsimme tämän fuusioproteiinin laskeuman sekä Cfh-/- että villityypin glomeruluissa. Tämä johtui osittain vuorovaikutuksesta glomerulaarisen propidiinin kanssa, mutta kertyminen villityypin glomeruluksiin osoitti, että se oli myös osittain täysin riippumaton glomerulaarisesta komplementista ja todennäköisesti liittyi fuusioproteiinin fysikaalis-kemiallisiin ominaisuuksiin.

Kineettiset tietomme osoittivat uusia löydöksiä koskien ajallisia muutoksia FB:ssä, C5:ssä ja megfelelődiinissä, jotka liittyvät C3:n nousuun Cfh–/–-hiirillä fuusioproteiinien injektion jälkeen. FB-tasot nousivat nopeasti injektion jälkeen

ja palasivat lähtötasolle aikana, jolloin sekä C5- että propidiinitasot pysyivät koholla. Properdiinitasot Cfh–/–-hiirillä laskivat lähtötilanteessa ja nousivat normaaleille tasoille (20 mg/ml30) IgG-FH1-5-injektion jälkeen ja pysyivät näillä tasoilla vähintään 14 päivää. Plasman C5-tasojen nousussa havaittiin samanlainen aika. Hämmästyttävää kyllä, IgG-FH1-5 ei ollut enimmäkseen verenkierrosta 11 päivän kohdalla, mikä osoittaa, että C5-konvertaasin muodostuminen Cfh–/–-hiirissä on hitaampaa kuin C3-konvertaasin (koska C3-tasot palasivat lähtötasolle välillä 7 ja 11 päivää). Plasman C5 lisääntyi anti-P-hoidon jälkeen ja lisääntyi edelleen anti-P-FH1-5-proteiinin myötä. Siten sekä propodiinin kohdistus että FH{20}} vaikuttivat C5-tasojen nousuun ja osoittavat, että C5-konvertaasi on osittain Prodiiniriippuvainen Cfh–/–-hiirissä. Tämä havainto on yhdenmukainen C5-säätelyhäiriön paranemisen kanssa hiirillä, joilla on yhdistetty FH:n ja propidiinin puutos.8,9 C3G:ssä verenkierrossa olevat megfelelődiinipitoisuudet voivat laskea ja näyttävät korreloivan pinnan C5-konvertaasiaktiivisuuden kanssa toisin kuin plasman C5 tai liukoinen C5b{ {30}}.31,32 Tietomme tukevat tiivistä yhteyttä propertydiinitasojen ja C5-konvertaasiaktiivisuuden välillä ja tukevat propertydiinitasojen käyttöä jatkuvan glomerulaarisen C5-aktivaation biomarkkerina.

Erityisesti IgG-FH1-5-proteiini oli edelleen havaittavissa verenkierrossa jopa 11 päivää yhden injektion jälkeen. Tämä on paljon pidempi kuin mitä aiemmin raportoimme konjugoimattomalle hiiren FH1-5-proteiinille, joka poistettiin verenkierrosta 24 tunnin kuluessa.14 Tämä havainto osoittaa, että IgG-FH{:n pidempi puoliintumisaika plasmassa on {9}} -proteiini on peräisin vasta-ainekonjugaatiosta. IgG-FH1-5-proteiinin puoliintumisaika plasmassa oli myös pidempi kuin mitä aiemmin havaitsimme täyspitkälle FH:lle.10,11 Esimerkiksi ihmisen FH poistui verenkierrosta 96 tunnin kuluttua yhden injektion jälkeen. Cfh–/–-hiirissä.11 Yhdessä tietojemme kanssa, jotka osoittavat IgG-FH1-5-proteiinin tehokkuuden komplementin säätelyssä, katsomme, että FH1-5-proteiinin konjugaatiolla sen farmakokineettisen profiilin pidentämiseksi on mahdollista terapeuttista vaikutusta. apuohjelma C3G:ssä.

Yhteenvetona osoitamme, että huolimatta pinnantunnistusdomeenien puutteesta, FH1-5-fuusioproteiinit vähensivät tehokkaasti glomerulaarista C3-aktivaatiota ja palauttavat plasmakomplementin säätelyn FH-puutostilanteessa. FH1-5-domeenien konjugoinnista anti-properdiiniin ei ollut ilmeistä etua, ja IgG-FH1-5-proteiini vähensi munuaisvaurioita kokeellisessa nefriitissä. Päinvastoin kuin FH:n laajamittaisten valmisteiden valmistuksessa terapeuttista käyttöä varten, vasta-ainepohjaisten hoitojen laajamittainen tuotanto on vakiintunutta, mikä tekee IgG-FH{10}} houkuttelevan potentiaalisen terapeuttisen aineen C3G:lle.

MENETELMÄT

Fuusioproteiinit

IgG-FH1-5. Ensimmäiset 5 linkitettyä hiiren FH SCR -verkkotunnusta (mFH1-5)

ei-kohdistavaan hiiren IgG1-Ig:hen (anti-idiotyyppinen vasta-aine, joka on kehitetty hiiren monoklonaalista vasta-ainetta vastaan).

Anti-P-FH1-5. Hiiren FH1-5 liitetty hiiren anti-properdiinivasta-aineeseen (anti-P),30 toimittaa Alexionille W. Song, Pennsylvanian yliopisto).

Säätimet. Kontrollit olivat isotyyppisovitettu ei-kohdennettu hiiren Ig (IgG-kontrolli) ja hiiren anti-properdiini (anti-P) (lisäkuva S1). Proteiinit tuotettiin käyttämällä pVEK-vektoreita ja Expi293-soluja (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), jotka puhdistettiin proteiini A:lla (MabSelect SuRe, Cytiva, Marlborough, MA).

AP-spesifinen hemolyyttinen määritys

Kaksikymmentä prosenttia normaalia hiiren seerumia, joka oli titrattu arvosta 60 nM 0,5 nM:iin, inkuboitiin kanin punasolujen (15 106 solua/ml) kanssa 37 °C:ssa 30 minuuttia. Hemin vapautuminen kvantifioitiin spektrofotometrisesti (optinen tiheys 415 nm); 100-prosenttinen hajoaminen oli seerumia, jossa ei ollut inhibiittoria.

Plasma FB ja FH

Plasma saatiin etyleenidiamiinitetraetikkahappoa sisältäviin putkiin kerätyn veren sentrifugoinnin jälkeen (Sarstedt, Nordrhein-Westfalen, Saksa). Proteiinit mitattiin kapillaarielektroforeesi-immunomäärityksellä (WES, ProteinSimple, San Jose, CA). Käytetyt vasta-aineet olivat polyklonaalinen anti-hiiri-FH-vasta-aine (Alexion Pharmaceuticals, Boston, MA) ja anti-hiiri FB-vasta-aine (Abcam, Cambridge, UK); Käytettiin WES-kanin vastaista tunnistusmoduulia (ProteinSimple, San Jose, CA). Kemiluminesenssisignaalit analysoitiin Compass for SW -ohjelmistolla (ProteinSimple, versio 5.{6}}.1), kvantifioitiin huippualueiksi ja normalisoitiin määrityskontrolliin.

Hiiret

Kaikki hiiret pidettiin erityisissä patogeenittomissa olosuhteissa; menettelyt suoritettiin institutionaalisten ohjeiden mukaisesti ja Yhdistyneen kuningaskunnan kotitoimiston hyväksymät. C57BL/6-villityypin hiiret ostettiin Jackson Laboratorylta (Bar Harbor, ME), ja Cfh–/–-hiiret luotiin aiemmin kuvatulla tavalla.7 Hiiret yhdistettiin iän ja sukupuolen mukaan; ekvimolaariset proteiiniannokset annettiin ip-injektiona (1 mg anti-properdiinia ja IgG-kontrollia varten; 1,4 mg IgG-FH1-5- ja anti-P-FH1-5). Nopeutettu seerumin nefrotoksinen nefriitti indusoitiin antamalla iv-injektio lampaan nefrotoksista seerumia hiiriin, jotka oli esiimmunisoitu lampaan IgG:llä.7 Fuusioproteiinien anto suoritettiin 24 tuntia ennen lampaan nefrotoksisen seerumin induktiota (kuvio 4a).

C3, C5 ja vapaa propidiini Plasma C3 mitattiin entsyymikytketyllä immunosorbenttimäärityksellä.14 Plasman "vapaa" propidiini- ja C5-tasot mitattiin käyttämällä elektrokemiluminesenssi-immunomäärityksiä (Meso Scale Discovery [MSD], Meso Scale Diagnostics, Rockville, MD) anti-testillä. - prodiini tai mukautettu hiiren vastainen C5, joka on päällystetty voimakkaasti sitoutuville MSD-levyille. Sitoutunut "vapaa" properdiini ja C5 havaittiin anti-properdiinilla (W. Songilta) tai biotinyloidulla monoklonaalisella anti-C5:llä (Alexion) yhdistettynä streptavidiini-SULFO:han (MSD, Meso Scale Diagnostics). Kemiluminesenssisignaali hankittiin käyttämällä SECTOR S 6000 -kuvalaitetta (MSD, Meso Scale Diagnostics) ja analysoitiin MSD Discovery Workbench -ohjelmistolla (Meso Scale).

Diagnostiikka, versio 4.{1}}.12.1). Standardeina käytettiin hiiren rekombinanttipropadiinia ja C5:tä.

Munuaisten toiminta ja histologia

Hematuria ja proteinuria arvioitiin käyttämällä Hema-Combistixia (Bayer, Reading, UK); plasman urea mitattiin ja munuaiskudosta käsiteltiin aiemmin kuvatulla tavalla.9 Virtsan kreatiniini määritettiin pistevirtsanäytteistä käyttämällä Creatinine Companion Protocol -määritystä (nro 1012; Excel, Philadelphia, PA) ja pistevirtsaa/ plasman albumiini mitattiin entsyymi-immunosorbenttimäärityksellä (#E99-134; Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Jaksottaiset happo-Schiff-värjätyt munuaisleikkeet arvioitiin sokkomenetelmällä ja luokiteltiin glomerulaarisen ja tubulointerstitiaalisen vaurion vakavuuden mukaan (0 [ei mitään], 1 [lievä], 2 [kohtalainen]). Kymmenen glomerulusta leikkausta kohti arvioitiin keskimääräisen glomerulaaristen solujen lukumäärän määrittämiseksi. Immunofluoresenssivärjäys suoritettiin 5- mm:n kryosektioissa, jotka oli asennettu käyttäen Vectashield-elatusainetta DAPI:n kanssa (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Käytetyt vasta-aineet olivat fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu polyklonaalinen vuohen anti-hiiri C3b/C3c/iC3b (1:200; #55500; MP Biomedical, Santa Ana, CA)9; Kuvaketjuspesifinen FITC-konjugoitu polyklonaalinen vuohen anti-hiiri-IgG (1:400; #F5387; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); FITC-konjugoitu monoklonaalinen hiiren anti-vuohen/lampaiden IgG (1:100; #F5137; Sigma-Aldrich); tai FITC-konjugoitu vuohen anti-ihmispropudiini (1:50; #GAHu/PPD/FITC, Nordic Immunologic Laboratories, Kööpenhamina, Tanska).9 Biotinyloitu vuohen anti-hiiri C3d (1:10; # BAF2655; R&D Systems , Minneapolis, MN) käytettiin biotiinilla suojatuissa leikkeissä (Biotin Blocking System; Agilent Dako, Santa Clara, CA) sekundaarisen streptavidiini AF488 -vasta-aineen kanssa (1:200; #S-32354; Thermo Fisher Scientific). FH visualisoitiin puhdistetuissa rotan anti-hiiri-CD16/CD{52}}-estetyissä osissa (1:100; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) käyttämällä vuohen anti-ihmis-FH:ta (1:1000; #A312; Quidel, San Diego , CA) ja monoklonaalinen anti-vuohen IgG-FITC-sekundaarinen vasta-aine (1:100; klooni GT-34; F4891; Sigma-Aldrich). Glomerulaariset makrofagit tunnistettiin käyttämällä FITC-konjugoitua rotan anti-hiiri CD68:aa (FA-11-klooni GTX43518; GeneTex, Irvine, CA). Kvantitatiivinen immunofluoresenssianalyysi suoritettiin käyttämällä Leica DM4B optista mikroskooppia yhdistettynä Leica DFC700T -digitaalikameraan (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa) ja Image-Pro Plus -ohjelmistoon (Media Cybernetics, Rockville, MD, versio 7). Kymmenen glomerulusta tutkittiin leikkausta kohden, ja keskimääräinen intensiteetti ilmaistiin mielivaltaisina fluoresenssiyksiköinä.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliseen analyysiin käytettiin GraphPad Prism, versio 8.{1}} (GraphPad, San Diego, CA). Aikakuluanalyysiin käytettiin toistuvien mittausten 2-varianssianalyysiä Bonferronin useiden vertailujen testillä (tekijät olivat aika ja hoito). Useita ryhmiä verrattaessa käytettiin Kruskal-Wallis ja Dunn -monivertailutestiä ja 2 ryhmässä Mann-Whitney-testiä.

ILMAISEKSI

MCP on saanut konsulttipalkkioita Alexionilta, ChemoCentryxiltä, ​​Novartikselta, Gyroscopelta ja Achillion Pharmaceuticalsilta. HTC on saanut konsulttipalkkioita Alexionilta, Novartisilta, Aurinialta ja Achillion Pharmaceuticalsilta. YZ, YW, KKJ ja SK-K ovat Alexion Pharmaceuticalsin työntekijöitä. SK on Alexion Pharmaceuticalsin entinen työntekijä ja tällä hetkellä Gemini Pharmaceuticalsin palveluksessa. Kaikki muut kirjoittajat eivät ilmoittaneet kilpailevia etuja.

KIITOKSET

MCP on Wellcome Trust Senior Fellow in Clinical Science (apurahaviite 212252/Z/18/Z), ja tämä apuraha tukee ACG:tä ja DPL:tä. YZ, SK, YW, KKJ ja SK-K rahoitti Alexion Pharmaceuticals.

OHEISMATERIAALI

Täydentävä tiedosto (PDF)

Kuva S1. Tässä tutkimuksessa käytetty fuusioproteiini.IgG-FH1-5 sisältää hiiren tekijän H:n (FH1-5) 5 ensimmäistä domeenia, jotka on linkitetty ei-kohdennettuun hiiren Ig:hen. Anti-P-FH1-5 koostuu mFH1-5:sta, joka on liitetty neutraloivaan hiiren anti-hiiri-propudiini-vasta-aineeseen (anti-P; katso Miwa et al.30). Kontrolliproteiineja olivat isotyyppisovitettu ei-kohdennettu hiiren Ig (IgG-kontrolli) ja neutraloiva hiiren anti-hiiri-propadiini-vasta-aine (Anti-P). Kuva S2. WES-blot-analyysi FH1-5:n havaitsemiseksi plasmanäytteistä FH-puutteellisista hiiristä, joihin on injektoitu joko (A) IgG-FH1-5 tai (B) Anti-P-FH1-5. 94-kDaIgheavychainlinkedtomouseFH1-5 (HC-FH1-5) on havaittavissa jopa 11 päivää IgG-FH1-5-injektion jälkeen ja jopa 4 päivää anti-P-FH1-5-proteiinin (punaiset laatikot) injektion jälkeen ).Sisältyi plasma villityypin hiiristä, joissa täyspitkä H-tekijän proteiini havaitaan (FH, mustat laatikot, kaista C1) ja ei-injektoidut FH-puutteelliset hiiret, joissa FH ei ole ilmeistä (mustat laatikot, kaista C2). Kuten odotettiin, kumpikaan FHnorFH1-5 ei ole havaittavissa plasmanäytteistä hiiristä, joille on injektoitu Anti-P- tai IgG-kontrolli.

Kuva S3. Glomerulaarisen komplementin immunovärjäys 96 tuntia IgG-kontrollin tai anti-P-FH1-5-injektion jälkeen villityypin hiirissä. Edustavia glomerulaariskuvia näytetään (palkki ¼ 100 mm).

Kuva S4. Prodidiinin rooli anti-P-FH1-5:n laskeutumiseen FH-puutteellisten hiirten glomeruluksiin. Cfh–/–-hiirille injektoitiin joko IgG-kontrollia tai anti-P:tä (hoito 1), minkä jälkeen 24-tuntia myöhemmin joko IgG-kontrolli tai anti-P-FH1-5 (hoito 2). Eläimet teurastettiin 120 tuntia ensimmäisen käsittelyn jälkeen, ja glomerulaarinen värjäys IgG:n, megfelelődiinin ja FH/FHR:n suhteen arvioitiin. Edustavia kuvia näytetään. Anti-P-injektio vähensi merkittävästi propertydin (rivi 1, sarake 2) värjäytymistä, mutta ei FH/FHR (pysyy muuttumattomana) tai IgG (poissa) värjäytymistä. Anti-P-FH{20}}tuntia IgG-kontrollin jälkeen johti rakeiseen värjäytymiseen anti-IgG-, anti-FH/FHR- ja anti-P-vasta-aineilla, kuten anti-P-FH-injektion jälkeen. 1-5 yksinään (katso kuva 3b). Tämä rakeinen värjäytyminen väheni, kun anti-P-FH1-5-injektiota edelsi anti-P-injektio, joka tyhjentää sekä verenkierron (katso kuva 1h) että glomerulaarisia (katso kuva 3b). Glomerulaarinen värjäys anti-IgG:llä oli ilmeistä vain hiirillä, joille oli injektoitu anti-P-FH1-5 (rivi 3, sarakkeet 3 ja 4), ja se oli merkittävästi pienempi hiirillä, jotka saivat anti-P-FH1-5 jota edeltää anti-P. Päätimme, että anti-P-FH1-5:n laskeutuminen Cfh–/–-hiirten glomeruluksiin oli osittain riippuvainen oikeasta. Vaakapalkit osoittavat mediaaniarvoja ja viikset osoittavat kvartiilien välistä aluetta. P-arvo johdettiin Mann-Whitneyn testistä. Tanko ¼ 100 mm.

VIITTEET

1.FakhouriF, Frémeaux-Bacchi V, Noöl LH, et al C glomerulopathy∶ uusi dassification. Nat Rev Nephrol.20106:494-499.

2 SmithRH.AppeG8.BlomAMet aLC3gkomeripatia – harvinaisen komplementtilähtöisen todellisen sairauden ymmärtäminen. Nat ReyNephrol.201915129-143

3. Pickering MC, Cook HT. Translational mini-review -sarja komplementtitekijästä H: komplementtitekijä H:hen liittyvät munuaissairaudet uusia näkemyksiä ihmisiltä ja eläimiltä. Cin Exp Immunol.2008;151:210-230.

4. Daha MR Fearon DT Austen KF, C3nekriittisen tekijän （C3NeF）∶nestefaasin ja soluun sitoutuneen vaihtoehtoisen reittikonvertaasin stabilointi. J Immunol 1976; 116: 1-7.

5. Mollnes TE, Ng YC, Peters DK, nefriittitekijän vaikutus C3:een ja komplementin terminaaliseen reittiin in vivo ja in vitro. Oin Exp Immunol. 1986;65:73-79.

6. Nq YC, Peters DK. G3-nefriittitekijä (C3NeF): vaihtoehtoisen reitin C3-konvertaasin soluun sitoutuneen ja nestefaasin stabiloinnin dissosiaatio. Cn Exp Imunol.19865:450-457.

7. Pickering MC, Cook HT, Warren J, et ai. Hallitsematon C3:n aktivaatio aiheuttaa membranoproliferatiivisen glomerulonefriitin hiirillä, joista puuttuu komplementtitekijä H. Nat Genert.2002:31;424-428.

8. Lesher AM, Zhou L, Kimura Y, et ai. Tekijä H -mutaation ja megfelelődiinin puutteen yhdistelmä aiheuttaa vakavan C3-glomerulonefriitin. J Am Soc Nephrol. 2013;24:53–65.

9. Ruseva MM, Veron KA, Lesher AM, et ai. Prodidiinin menetys pahentaa tekijä H:n puutteesta johtuvaa C3-glomerulopatiaa. J Am Soc Nephrol. 2013;24:43-52.

10. Paixao-Cavalcante D, Hanson S, Botto M, et ai. Tekijä H helpottaa GBM:ään sitoutuneen iC3b:n poistumista säätelemällä C3:n aktivaatiota nestefaasissa. Mol Immunol.2009;46:1942-1950.

11Fakhouri F, de Jorge EG. Brune F, et ai. Hoito ihmisen komplementtitekijä H:lla kumoaa nopeasti munuaiskomplementin kertymisen hyytymistekijä H:n puutteellisissa hiirissä. Kidney Int.2010:78:279-286.

12. Michelfelder S, Parsons J, Bohlender Ll, et ai. Mossin tuottama, glykosylaatiooptimoitu ihmisen tekijä H terapeuttiseen käyttöön komplementtihäiriöissä. JAm Soc Nephrol.201728:1462-1474.

13. Nichols EM, Barbour TD, Pappworth Y, et ai. Laajennettu minikomplementtitekijä H -molekyyli parantaa kokeellista C3-glomerulopatiaa. Kidney Int. 201588:1314-1322.

14. Ruseva MM, Peng T, Laser MA, et ai. Kohdennettu komplementin eston tehokkuus kokeellisessa C3-glomerulopatiassa. J Am Soc Nephrol. 2016;27:405-416.

15. Yang Y, Denton H, Davies OR, et ai. Muokattu komplementtitekijä H -konstrukti C3-glomerulopatian hoitoon. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1649-1661.

16. Schulze M, Pruchno CJ, Burns M, et ai. Glomerulaarinen C3-klokalisaatio osoittaa jatkuvaa immuunikertymän muodostumista ja komplementin aktivaatiota kokeellisessa glomerulonefriitissä. Olen J PatholL. 1993:142179-187.

17. Athanasiou Y, Voskarides K Gale DP, et ai. CFHRS-mutaatioihin liittyvä familiaalinen C3-glomerulopatia 91 potilaan kliiniset ominaisuudet 16 sukutaulussa. CTn JAm Soc Nephrol.20116:1436-1446.

18. Kaneko Y, Nimmer动hn F, Madaio MP, et ai. Patologia ja suoja nefrotoksisessa nefriitissä määritetään spesifisten Fc-reseptorien selektiivisellä sitoutumisella. J Exp Med.2006;203:789-797.

19. Sheerin NS, Springall T, Carroll MC, et ai. Suojaus antiglomerulaarista tyvikalvoa vastaan ​​(GBM-välitteinen nefriitti C3-- ja C4--puutteellisilla hiirillä. C Exp Immunol. 1997;110:403-409.

20. Cheng ZZ Hellwae J, Seeberger H et ai. Hiiren ja ihmisen komplementtitekijän pinnantunnistus- ja C3b-sitoutumisominaisuuksien vertailu H.Mol Immunol.2006;43.972-979.

21dp mäti EG. Macor P.Paixao-Caakante D. et al Tyypillisen hemolyyttisen ureemisen oireyhtymän kehittyminen riippuu komplementista C5.J Am Soc Nephrol.2011;22:137-145.

22. Pdkering MC, de Jorge EG. Martinez-Barricarte Ry et ai. Spontaani hemolyyttinen ureeminen oireyhtymä, jonka laukaisee komplementtitekijä H, josta puuttuu pinnantunnistusdomeeneja. J Exp Med.2007;204:1249-1256.

23Herbert AP. Mike E, Chen ZAet aL. Komplementin kiertäminen, jota välittää siepatun tekijä H:n tehostaminen: vaikutukset itsepintojen suojaamiseen komplementilta. J Immunol. 2015;195:4986-4998.

24. Goicoechea de Jorge E Caesar JJ, Malik TH, et ai. Komplementtitekijä H:hen liittyvien proteiinien dimerointi moduloi komplementin aktivaatiota. Proc Natl Acad Sci US A.2013;110:4685-4690.

25. Schmidt CQ, Bai H Lin Z, et ai. Minimoidun immuuni-inhibiittorin rationaalinen suunnittelu, jolla on ainutlaatuiset kolminkertaiset kohdistusominaisuudet. J Immunol. 2013;190:5712-5721.

26. Wilson HR, Medjera-Thomas NR, Gilmore AC, et ai. Glomerulaarinen kalvohyökkäyskompleksi ei ole luotettava merkki C5-aktivaatiosta lupusnefriitissä. Kidney Int. 2019.{4}}.

27. Antonioli AH White J, Crawford F, et ai. Komplementin vaihtoehtoisen reitin modulointi hiiren tekijä H:hen liittyvien proteiinien avulla. J Immunol. 2018;200:316-326.

28. Cserhalmi M, CsincsiALMezei Z, et ai. Hiiren tekijä H:n sukuinen proteiini FHR-B edistää komplementin aktivaatiota. Front Immunol.20178:1145.

29. Medjeral-Thomas NR, Moffett H, Lomax-Browne HJ et ai. Glomerulaarinen komplementtitekijä H:hen liittyvä proteiini 5 (FHR5) on erittäin yleistä C3-glomerulopatiassa ja liittyy munuaisten vajaatoimintaan Kdney Int Ren. 2019;4:1387-1400.

30. Miwa T, Sato S, Gullipalli D, et ai. Proderdinin, vaihtoehtoisen reitin ja anafylatoksiinireseptorien estäminen parantaa munuaisten iskemia-reperfuusiovauriota rappeutumista kiihdyttävillä tekijä- ja CD59-kaksoispoistohiirillä. J Immunol. 2013;190:3552-3559.

31. Corillo F, Bravo Garcia-Morato M, Nozal P, et ai. Seerumin prodiinin kulutus C5-konvertaasin dysregulaation biomarkkerina C3-glomerulopatiassa. Clin Exp Immunol.2016;184:118-125.8. Lesher AM, Zhou L Kimura Y, et ai. Tekijä H -mutaation ja prodiinin puutteen yhdistelmä aiheuttaa vakavan C3-glomerulonefriitin.JAm Soc Nephrol.2013;2453-65.

32. zhang Y, Nester OM Martin B. et al. C3-glomerulopatian komplementtibiomarkkeriprofiilin määrittäminen. Clin J Am Soc Nephvol.20149:186-1882.