Adoptiivisen NK-soluinfuusion yhdistäminen dopamiinia vapauttavaan peptidiin vähentää vanhenevia soluja ikääntyneissä hiirissä

Ota yhteyttäoscar.xiao@wecistanche.comLisätietoja

JOHDANTO

Ikääntyminen on yksi tärkeimmistä riskitekijöistä monille sairauksille [1], ja ikääntymiseen vaikuttavien menetelmien kehittäminen vähentää merkittävästi useiden ikääntymiseen liittyvien sairauksien, kuten sydän- ja aivoverisuonisairauksien [2, 3] ja syövän, riskiä. [4] ja Alzheimerin tauti [5]. Vanhenevat solut (SNC) kerääntyvät asteittain kudoksiin ikääntymisprosessin aikana, ja niitä pidetään ikääntymiseen liittyvien sairauksien pääasiallisena syynä [6-8]. SNC:iden poistamisen hiirimalleissa on osoitettu estävän tai viivästävän kudosten toimintahäiriöitä ja pidentävän terveitä elinikää [9, 10]. Sitä vastoin pienten SNC-määrien siirtäminen aiheuttaa fysiologisia toimintahäiriöitä nuorilla hiirillä [1]. Nämä tutkimukset ovat avanneet ovia sellaisten menetelmien kehittämiseen, jotka tähtäävät SNC:iden poistamiseen ikään liittyvien kroonisten sairauksien parantamiseksi.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja

SNC:iden kohdentaminen, jota kutsutaan "senolyyttiseksi lääkkeeksi", oli ensimmäinen kemoterapia, joka on testattu menestyksekkäästi prekliinisessä in vivo -mallissa, ja tällä hetkellä on olemassa useita senolyyttisiä aineita [12]. Monet näistä lääkkeistä kohdistuvat SNC:issä säädeltyihin anti-apoptoottisiin reitteihin selektiivisesti poistamaan tietyntyyppiset SNC:t, ja ne ovat osoittaneet potentiaalin pidentää elinikää ja parantaa kehon toimintoja [13, 14].Cistanche-uute Anti-säteilyHuolimatta ikään liittyvän patologian onnistuneesta kumoamisesta eläinmalleissa, senolyyttisten lääkkeiden käytöllä ihmisillä voi olla esteitä SNC:iden heterogeenisyyden ja suuren toksisuusriskin vuoksi [15]. Siksi olisi tutkittava vaihtoehtoinen menetelmä, jolla voidaan turvallisesti eliminoida monenlaisia ​​SNC:itä ihmisissä.

Immuunijärjestelmä voi tunnistaa ja poistaa SNP:t [16]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että SNC:t aktivoivat luonnollisia tappajasoluja (NK) säätelemällä pääasiallisen histokompatibiliteettiluokan I ketjuun liittyvää A- ja B-proteiinia aktivoivaa ligandia [17]. Iän kasvaessa immuunijärjestelmän tehokkuus kuitenkin heikkenee, mikä voi johtaa SNC:iden immuunipakoon [18]. Syövän hoidossa on tutkittu menetelmiä immuunijärjestelmän heikentyneen toiminnan aiheuttaman pakenemisen voittamiseksi [19]. Viime aikoina on edistytty NK-solujen adoptiivisessa siirtämisessä kasvainten eliminoimiseksi, mikä on osoittanut jonkin verran tehoa [20]; näin ollen oli järkevää olettaa, että NK-solujen adoptiivinen infuusio saattaa aiheuttaa sytotoksisuutta SNC:issä.

Hermosto ja immuunijärjestelmä ovat kehon kaksi tärkeintä mukautuvaa järjestelmää. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että dopamiini (DA) immuunisäätelijänä on avain neuroimmuuniviestintään [21]. DA suorittaa biologiset tehtävänsä vuorovaikutuksella ja aktivoimalla dopamiinireseptoreja (DR), jotka on jaettu kahteen alaryhmään, D1-like (D1 ja D5) ja D2-like (D2, D3, ja D4). Mitä tulee eri toimintoihinsa, D1-like DR:n sitoutuminen stimuloi cAMP-tuotantoa, kun taas D2-like DR:n sitoutuminen estää cAMP-tuotantoa [22]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että D1-kaltainen DR-stimulaatio lisää NK-solujen sytotoksisuutta sekä in vitro [23] että in vivo [24]. DA-tasot kuitenkin laskevat ihmisen iän kasvaessa [25]. Siten oletimme, että dopaminergiset lääkkeet voisivat lisätä NK-solujen adoptiivisen infuusion sytotoksisuutta.

Cistanche voi estää ikääntymistä

Tässä ehdotamme nonapeptidin Acein käyttöä, joka oli vuorovaikutuksessa angiotensiiniä konvertoivan entsyymin (ACE I) kanssa indusoimaan DA:n eritystä [26], yhdessä systeemisen NK-soluterapian kanssa SNC:iden eliminoimiseksi. In vitro -tulokset osoittivat, että NK-solut poistivat SNC:t vanhenemisen indusoijista ja solutyypeistä riippumatta.cistanche herbaIkääntyvän hiiren mallissa NK-soluterapia yhdessä Aceinin kanssa vähensi merkittävästi vanhenemiseen liittyvien -galaktosidaasi (SA- -gal) -positiivisten solujen määrää useissa kudoksissa, vähensi ikääntymiseen liittyvien geenien ilmentymistä tärkeimmissä elimissä. ja lievitettyjen vanhenemiseen liittyvien erittyvien fenotyyppien (SSP:t). Tämän tutkimuksen tulokset antavat näkemyksiä kroonisten SNC:iden immuunivalvonnan mahdollisesta palauttamisesta käyttämällä NK-soluterapiaa yhdessä Acen kanssa.

TULOKSET

NK-solujen adoptiivinen infuusio vähentää vanhenevia CD3- ja T-soluja ääreisveressä

Kaksikymmentäkuusi vapaaehtoista, jotka saivat NK-soluinfuusiota, värvättiin tutkimukseen. Vapaaehtoisten ominaisuudet ja NK-solujen ominaisuudet on esitetty taulukossa 1. Veren keräämisen aikaväli NK-solusiirron jälkeen oli noin 37 (25-57) päivää. NK-solujen osuus (kuvio 1A) ja absoluuttinen lukumäärä (kuvio 1B) ääreisveressä olivat kääntäen verrannollisia vapaaehtoisten ikään. Yllättäen jokaiseen yksilöön uudelleen infusoidun NK-solutuotteen puhtaus korreloi myös käänteisesti vapaaehtoisten iän kanssa (kuvio 1C).cistanche peniksen kasvuTämä voi johtua NK-solujen asteittaisesta vähenemisestä iän myötä. NK-solujen antamisen ikääntymistä estävän vaikutuksen heijastamiseksi useita vanhenevia markkereita perifeerisen veren CD3- ja T-soluista, jotka heijastavat suurelta osin kehon ikään liittyvää fenotyyppiä [27], havaittiin ennen ja jälkeen NK-soluinfuusion. Verrattuna CD3 plus T-solujen vanhenemismarkkereihin ja SASP-tekijään ääreisveressä ennen autologista NK-soluinfuusiota ja sen jälkeen, SA- -gal-positiivisten T-solujen osuus pieneni merkittävästi infuusion jälkeen (kuvio 1D). P16:n, P21:n ja plasminogeeniaktivaattori-inhibiittorin 1 (Pai1) mRNA-tasot laskivat merkittävästi, kun taas monosyyttien kemoattraktanttiproteiinin-1 (MCP-1) ja IL-6 mRNA-tasot laskivat merkittävästi. eivät olleet merkittäviä (kuvio 1E). Biokemiallisissa indekseissä (lisätaulukko 1) ei ollut merkittävää eroa perifeerisessä veressä.

Ihmisen NK-solut vähentävät rasvakudoksen vanhenemismarkkereita ja proinflammatoristen sytokiinien eritystä

Rasvakudosta kerättiin kolmelta liikalihavalta yksilöltä, koska liikalihavuudella on taipumus aiheuttaa SNC:iden kertymistä [28]. Lisäksi rasvakudosta viljeltiin käsitellyssä väliaineessa SNC:istä rasvakudoksen vanhenemisen lisäämiseksi. Kontrollina pidettiin rasvakudosta, jota viljeltiin käsitellyssä alustassa muista kuin SNC:istä. Perforiinin (kuvio 2A) ja CD69:n (kuvio 2B) ilmentyminen NK-soluissa säädeltyi merkittävästi korkeammalle ikääntyvän rasvakudoksen kanssa suoritetun yhteisinkuboinnin jälkeen verrattuna yhteisinkubaatioon kontrollirasvakudoksen kanssa. Vanhenevien markkerien p16 ja p21 ilmentyminen in

ikääntyvä rasvakudos väheni merkittävästi NK-soluhoidon jälkeen (kuva 2C, täydentävä kuva 1A, B). Havaitsimme myös, että SASP:n avainkomponentti säädetyssä alustassa ikääntyvän ryhmän NK-solujen kanssa yhteisinkuboinnin jälkeen väheni merkittävästi (kuvio 2D). Nämä tulokset viittasivat siihen, että NK-solut voisivat poistaa SNC:t rasvakudoksesta ja vähentää SASP-fenotyyppiä.

Hiiren NK-solut voidaan aktivoida SNC:itä vastaan ​​ja ne voivat aiheuttaa sytotoksisuutta

Indusoimme ensin hiiren rasvan kantasolujen vanhenemisen säteilytyksellä tai adriamysiinillä, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Sen määrittämiseksi, aktivoivatko SNC-solut spesifisesti NK-soluja, säteilyttämättömiä kontrollisoluja tai säteilytettyjä SNC-soluja inkuboitiin yhdessä NK-solujen kanssa 24 tunnin ajan. Virtaussytometria osoitti, että CD69:n (kuvio 3A) ja IFN-y:n (kuvio 3B) ilmentymistasot NK-soluissa olivat merkittävästi ylöspäin SNC-kohdesoluissa verrattuna kontrollikohdesoluihin. Sillä välin NK-solujen kanssa yhteisinkuboinnin jälkeen SNC:iden apoptoottinen taso oli merkittävästi korkeampi kuin kontrollisolujen (kuvio 3C). Seuraavaksi havaitsimme NK-soluja aktivoivien ja inhiboivien ligandien ilmentymisen SNC:issä. qPCR-tulokset osoittivat, että aktivoivien ligandien ilmentymistaso NK-soluissa oli merkittävästi korkeampi kuin kontrollisoluissa, ja joidenkin inhiboivien ligandien, kuten beeta 2 -mikroglobuliinin (2m), ilmentymistaso oli alentunut kontrollisoluihin verrattuna (kuva 1). .3D). Olemme myös tutkineet NK-solujen kykyä eliminoida SNC:itä in vivo.cistanche-salsan edutDiR-leimatut kontrollisolut ja DiR-leimatut SNC:t siirrettiin hiirten vatsaonteloon ja NK-soluja annettiin häntälaskimon kautta. In vivo -kuvaustulokset osoittivat, että fluoresenssin intensiteetti hiirillä, joille oli siirretty SNC:itä NK-soluhoidon jälkeen, oli merkittävästi heikompi kuin hiirillä, joille oli siirretty kontrollisoluja (kuvio 3E). Tämä osoitti, että NK-solujen kyky tappaa SNC:itä oli merkittävästi suurempi kuin SNC:iden in vivo. Seuraavaksi määritimme, oliko NK-solujen sytotoksisuus SNC:itä vastaan ​​annoksesta riippuvaista ja soluspesifistä. Samaan aikaan käytimme myös doksorubisiinin aiheuttamaa vanhenemista määrittääksemme, rajoittuiko NK-solujen sytotoksisuus SNC:itä vastaan ​​säteilyn induktioon. Tulokset osoittivat, että NK-soluilla oli merkittävää sytotoksista aktiivisuutta SNC:itä vastaan ​​annoksesta riippuvalla tavalla, mutta vähän sytotoksisuutta kontrollisoluja vastaan. Erilaisilla vanhenemisstimulaatiomenetelmillä ei ollut vaikutusta NK-solujen kykyyn tappaa SNC:itä (kuvio 3F). Nämä tulokset viittasivat siihen, että SNC:t voivat spesifisesti aktivoida NK-soluja ja ne voivat tuottaa merkittävää sytotoksisuutta SNC:itä vastaan ​​in vitro ja in vivo.

DA lisää hiiren NK-solujen sytotoksisuutta SNC:itä vastaan ​​D1-kaltaisten reseptorien kautta

Ottaen huomioon DA:n tärkeän neuroimmuuniviestintätoiminnon [30] arvioimme, voisiko DA lisätä hiiren NK-solujen sytotoksisuutta SNC:itä vastaan. NK-soluja inkuboitiin yhdessä säteilyn aiheuttamien SNC:iden kanssa, ja DA:n eri pitoisuudet lisättiin alustaan. Tulokset osoittivat, että DA voi lisätä NK-solujen sytotoksisuutta SNC:itä vastaan ​​(kuvio 4A, B). Sen signalointireitin karakterisoimiseksi, jolla DA tehosti NK-solujen tappavaa vaikutusta SNC-soluihin, arvioitiin muutokset DR-ilmentymisessä, cAMP-sisällössä ja cAMP-vasteelementtiä sitovan proteiinin (CREB) fosforylaatiossa NK-soluissa. NK-soluissa, joita inkuboitiin yhdessä SNC-solujen ja DA:n kanssa, cAMP-pitoisuus (kuvio 4C) ja CREB:n fosforylaatiotaso (kuva 4D, täydentävä kuva 2A) lisääntyivät merkittävästi verrattuna NK-soluihin ja SNC-yhteisinkubaatioon. ilman DA:ta. Selvittääksemme, miksi DA lisää NK-solujen tappavaa aktiivisuutta SNC-soluja vastaan, vertailimme DR-muutoksia NK-soluissa sen jälkeen, kun NK-soluja oli inkuboitu yhdessä SNC-solujen tai kontrollisolujen kanssa. Tulokset osoittivat, että D1- ja D5-DR-ilmentymistaso nousi merkittävästi sen jälkeen, kun NK-soluja oli inkuboitu yhdessä SNC:iden kanssa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 4E). Seuraavaksi DA ja D1-pitävät reseptoriantagonisteista tai D2-kuten

reseptoriantagonistit lisättiin yhteen NK-solujen ja SNC:iden yhteisinkubaatiojärjestelmässä. Pelkän DA:n lisäämiseen verrattuna SNC:iden apoptoositaso aleni, kun DA:ta ja SCH-23300(D1--kaltaista reseptorin antagonistia) lisättiin (kuvio 4F, G). Samaan aikaan cAMP-pitoisuus (kuvio 4H) ja CREB:n fosforylaatiotaso (kuvio 41, täydentävä kuva 2B) NK-soluissa säädeltiin alas. Sitä vastoin DA:n ja haloperidolin (D2-reseptorin antagonisti) lisääminen ei merkittävästi muuttanut SNC-solujen apoptoositasoa, cAMP-pitoisuutta ja CREB-fosforylaatiota NK-soluissa verrattuna pelkän DA:n lisäämiseen. Nämä tulokset osoittivat, että DA tehosti hiiren NK-solujen tappamisaktiivisuutta SNC:itä vastaan ​​D1-kaltaisten Drs.

Ace yhdistettynä hiiren NK-soluihin parantaa merkittävästi SNC:iden puhdistumaa in vivo

Aiempi tutkimus on osoittanut, että dopamiini vähenee iän myötä ihmisillä [22]. Mittasimme ensin perifeerisen dopamiinitason nuorilla ja vanhoilla hiirillä. Tulokset osoittivat, että vanhojen hiirten plasman dopamiinitasot olivat alhaisemmat kuin nuorten hiirten (kuvio 5A). Seuraavaksi tutkittiin perifeeristä dopamiinin vapautumista Aceinin intraperitoneaalisen injektion jälkeen vanhoilla hiirillä. Havaitsimme, että plasman dopamiinitasot nousivat merkittävästi 10 mg/kg Acein-injektion jälkeen (kuva 5B, täydentävä kuva 3). Tätä silmällä pitäen suoritimme hiiren NK-soluja yhdessä Aceinin kanssa ikääntyneiden hiirten hoitamiseksi. Havaitsimme NK-solujen tilan hiirten ääreisverestä hoidon jälkeen ja havaitsimme, että NK-solujen määrä perifeerisessä veressä infuusiona NK-soluja yksinään tai NK-soluja yhdistettynä aceiiniin oli merkittävästi suurempi kuin Ace-käsitellyssä ryhmässä ja PBS-ryhmä, kun taas NK-solujen lukumäärä ei ollut merkitsevästi erilainen NK-soluilla käsitellyn ryhmän ja NK-solujen välillä yhdistettynä aceiinilla käsiteltyyn ryhmään (kuvio 5C, D).cistanche tubulosa annostus redditNK-solujen aktivaatiotason lisähavaitseminen osoitti, että CD69:n ilmentymistaso perifeerisen veren NK-soluissa yhdistetyssä käsitellyssä ryhmässä oli merkittävästi korkeampi kuin NK-soluilla käsitelty ryhmä (kuvio 5E). Seuraavaksi arvioimme kudoksen SNC:t. Havaitsimme, että NK-solujen infuusio yksinään vähensi joidenkin vanhenevien markkerien ilmentymistä verrattuna PBS-ryhmään ja Aceinilla käsiteltyyn ryhmään, kun taas NK-solujen infuusio yhdistettynä aceiiniin vähensi merkittävästi SA- -gal-positiivisia soluja (kuvio 5F). ) sekä P16:n ja P21:n ilmentymistasot (kuvio 5G, täydentävä kuva 4A, B) rasvakudoksessa verrattuna pelkän NK-solujen hoitoon. Ki67BrdU-solujen määrä rasvakudoksessa lisääntyi myös merkittävästi (kuvio 5H), mikä osoittaa edelleen, että SNC-solujen pitoisuus rasvakudoksessa oli pienempi yhdistetyssä hoidetussa ryhmässä. Maksa-, keuhko-, munuais- ja rasvaosien SA- -gal-värjäys osoitti myös alhaisimman SNC-tason yhdistetyssä hoidetussa ryhmässä (lisäkuvat 5A-D). Nämä tulokset osoittivat, että NK-solut yhdistettynä Acein-terapiaan paransivat NK-solujen aktivaatiotasoa hiirissä ja aiheuttivat merkittävää SNC-solujen eliminaatiota in vivo.

Ace yhdistettynä NK-soluihin vähentää ikään liittyviä fenotyyppejä iäkkäillä hiirillä

Ikään liittyvien fenotyyppien vahvistamiseksi hiirillä kerättiin maksa-, keuhko-, munuais-, rasva- ja silmäkudoksia erilaisten vanhenevien merkkiaineiden havaitsemiseksi, mukaan lukien P16-, P21- ja SASP-tekijät. Nämä näytteet valittiin, koska nämä kudokset vanhenevat todennäköisemmin iän myötä [31]. Pelkän NK-soluinfuusion jälkeen kussakin kudoksessa P16-, P21- ja SASP-tekijöiden mRNA-tasot olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrolliryhmässä, kun taas ikääntymismarkkerien tasot maksassa, rasvassa ja eve-kudoksissa yhdistetyissä hoidetuissa kudoksissa. Ryhmän määrä väheni edelleen verrattuna ryhmään, jota käsiteltiin pelkällä NK-soluinfuusiolla (kuvio 6A). Samalla tavalla olemme havainneet myös pääasiallisen SASP-tekijän hiirten seerumista, ja tulokset olivat yhdenmukaisia ​​kudoksissa saatujen tulosten kanssa (kuvio 6B). Lisäksi olemme tutkineet myös maksan ja rasvakudoksen NAD-tasoja, jotka liittyvät ikääntymiseen [32]. Havaitsimme, että NK-solujen infuusio yksinään tai yhdistelmähoidossa lisäsi merkitsevästi NAD-pitoisuutta maksassa ja rasvakudoksessa, parannuksen tason ollessa merkittävästi korkeampi yhdistelmähoitoryhmässä (kuvio 6C). Jotkut seerumin biokemialliset indeksit, mukaan lukien ALT, AST, CREA, UA, CHOL ja BUN, liittyvät ikääntymistasoihin [33]. Olemme havainneet, että vain UA väheni merkittävästi hiirten seerumissa yhdistelmähoitoa saaneessa ryhmässä, kun taas muut keskeiset biokemialliset indeksit eivät

MATERIAALIT JA MENETELMÄT Ihmisen NK-solujen infuusio

Autologisen NK-soluinfuusion suoritti Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Kiina), ja kaikki protokollat ​​hyväksyttiin sen eettisessä komiteassa (nro 05,2020, Shanghai Mengchao Cancer Hospitalin lääketieteen eettinen komitea). Kaikki vapaaehtoiset antoivat allekirjoitetun tietoon perustuvan suostumuksen perifeerisen veren hankkimiseen. Lyhyesti sanottuna jokaisesta yksilöstä uutettiin 50 ml perifeeristä verta, minkä jälkeen perifeerisen veren mononukleaariset solut (PBMC:t) eristettiin ja siirrettiin T75-pulloon ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) kanssa, joka sisälsi 1 × Cloudz CD2/NKp46:ta. , Rekombinantti ihmisen IL-2 (27 ng/ml), rekombinantti ihmisen L-12 (10 ng/ml), rekombinantti ihmisen IL-18 (10 ng/ml, ja rekombinantti ihmisen L{{ 13}}(10 ng/ml) (R&D Systems, USA) 48 tunnin ajan ja korvattiin sitten aktivoidulla väliaineella (270 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-2, 20 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-12 , 20 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-18 ja 20 ng/ml rekombinantti ihmisen IL-21) lisäviljelyä varten. Solutiheys pidettiin arvossa 1 × 10 astetta solua/ml. Viljelypäivänä 28 , pieni määrä autologisia NK-soluja kerättiin laadunvalvontaa varten ja injektoitiin suonensisäisesti uudelleen autologisten NK-solujen kanssa tiheydellä 4,15 × 10 astetta (3.{31}},87 × 10) solua infuusioajalla 30 minuuttia. Kokeellinen prosessi suoritettiin sopusoinnussa nce hyvän kliinisen käytännön kanssa. Toisen verenoton aikaväli oli noin 37 (25-57) päivää.

Ihmisen ääreisveren T-solujen ja NK-solujen eristäminen Tuoretta verta otettiin terveiltä vapaaehtoisilta tietoisen suostumuksen antamisen jälkeen, ja Kiinan lääkeyliopiston (lupanumero: SYXK2016-0011) laitosten arviointilautakunta hyväksyi protokollan. Lymphoprepia (STEMCELL Technologies, Kanada) käytettiin ihmisen PBMC:iden eristämiseen. Ihmisen CD3 plus T-solut saatiin PBMC:istä käyttämällä ihmisen CD3-T-solulajittelumagneettihelmiä (Miltenyi Biotec, Saksa) valmistajan protokollan mukaisesti. NK-solut eristettiin ääreisverestä käyttämällä RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktailia (STEMCELL Technologies) valmistajan protokollan mukaisesti.

Hiiren NK-solujen erottaminen ja laajentaminen in vitro

Hiiren pernan NK-solut eristettiin käyttämällä NK Cell Isolation Kit -pakkausta (Miltenyi Biotec) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna saatiin hiiren pernat, pernasolut suodatettiin käyttämällä 70 μm:n solusuodatinta, ja pernan lymfosyytit saatiin tiheysgradienttisentrifugoinnilla käyttämällä hiiren pernan lymfosyyttien erotuspakkausta (Solarbio, Kiina). Pernan lymfosyytit kerättiin erittäin puhtaiden NK-solujen saamiseksi käyttämällä magneettihelmiä hiiren NK-solujen erottamiseen. Eristettyjä pernan NK-soluja viljeltiin ylläpito-RPMI-1640-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS), 1 prosentilla L-glutamiinia, 1 prosentilla penisilliiniä/streptomysiiniä, 1 prosentilla minimaalisella välttämättömällä elatusaineella (MEM). välttämätön aminohappo, 1 prosentti natriumpyruvaattihappoa ja 50 uM merkaptoetanoli (kaikki Life Technologiesilta, USA). Lisäksi 200 IU/ml rekombinantti-interleukiini 2:ta (RL-2) (PeproTech, USA) ja 10 ng/ml hiiren I-15(ml-15)(PeproTech) keskikokoinen. Sitten kerättiin 10 asteen NK-solut ja 10 asteen säteilytetyt pernan lymfosyytit ja 5 ml amplifikaatioelatusainetta (ylläpitoväliainetta täydennettynä 1000 IU/ml rlL-2, 10 ng/ml ml-15 ja 30 ng/ml anti-aineella -NKp46-vasta-aine (PA5-46986, Invitrogen, USA)) oli

Kuvio 3 SNC:t aktivoivat NK-soluja ja NK-solut tappoivat ne. Virtaussytometria (A) CD69:n ja (B) IFN-y:n ilmentymisen havaitsemiseksi suoritettiin 24 tunnin rinnakkaisinkuboinnin jälkeen hiiren NK-solujen ja preadiposyyttien tai säteilytyksen aiheuttamien preadiposyyttien kanssa. n =3. Tiedot esitetään keskiarvoina±SD. Erot arvioitiin kaksisuuntaisella parittomalla ei-parametrisella t-testillä. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Preadiposyyttien ja lihassatelliittisolujen uuttaminen

Preadiposyytit uutettiin aiemmin kuvatulla tavalla [11]. Lyhyesti sanottuna ihmisen tai hiiren rasva poistettiin steriileissä olosuhteissa ja leikattiin 1-2 mm:n paloiksi, pestiin kahdesti PBS:llä ja digestoitiin kollagenaasi ll:lla (Solarbio) 37 asteessa 1 tunnin ajan. Sitten solut suodatettiin 100 μm:n solusuodattimella, sentrifugoitiin 300 g:llä 5 minuuttia ja kerättiin. Kiinnittyviä soluja viljeltiin a-MEM:ssä, johon oli lisätty 20 % FBS:ää, 12 tuntia ja digestoitiin trypsiinillä kiinnittyneiden solujen keräämiseksi. Lihassatelliittisolut eristettiin aiemmin kuvatulla tavalla [34]. Nelipäälihas leikattiin 1-2 mm:n paloiksi ja lisättiin 5 ml kollagenaasi ll:a sulatusta varten 37 asteessa 12 minuutin ajan. Seos sekoitettiin pipetillä ja lisättiin 5 ml täydellistä elatusainetta 12 minuutin lisähajottamisen jälkeen. Solut suodatettiin käyttämällä 70 μm:n solusuodatinta ja sentrifugoitiin 300 g:ssä 5 minuuttia. Sitten solut olivat

viljeltiin 5 ml:lla elatusainetta, jota lisättiin päivittäin 4 päivän ajan. Kiinnittyneet solut puhallettiin pois pipetillä ja sentrifugoitiin 2000 x g 5 minuuttia. Sen jälkeen, kun trypsiiniä oli digestoitu 37 asteessa 5 minuutin ajan, soluja sentrifugoitiin 2000 x g:ssä 5 minuuttia ja kerättiin. Sitten lisättiin 5 ml F-10 Hamin alustaa, johon oli lisätty 20 prosenttia FBS:ää ja 4 ng/ml emäksistä fibroblastikasvutekijää (PeproTech).

Hiiren pernan NK-solujen sytotoksisuus SNC-soluihin havaittiin laktaattidehydrogenaasimäärityksellä

SNC:t indusoitiin 0,2 μM Adriamycinilla (MedChemExpress, USA) 24 tunnin ajan tai viljelyn jatkumisella 20 päivän ajan 10 Gy:n röntgensäteilyn jälkeen. Sitten 5 000 SNC:tä asetettiin levylle ja pernan NK-soluja (solujen elinkelpoisuus: 93.5-97,1 prosenttia) lisättiin efektorin ja kohteen välisissä suhteissa 50:1, 25:1, 12,5:1, 6,25: 1,3,125:1 ja 1,563:1. Supernatantit kerättiin 37 °C:ssa 24 tunnin yhteisviljelyn jälkeen, ja havaitsemiseen käytettiin laktaattidehydrogenaasin (LDH) sytotoksisuuden havaitsemispakkausta (Cayman Chemical, USA). Sytotoksisuus laskettiin seuraavalla kaavalla: sytotoksisuus ( prosenttia )=(seossolukoe-kohdesolu spontaani-efektorisolu spontaani)/(kohdesolujen maksimi- kohdesolu spontaani) × 100.

Live-kuvaus

Kaksitoista 10-viikon ikäistä C57BL/6-hiirtä ostettiin Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd:ltä (Jiangsu, Kiina). Sitten 1×10 asteen 1,1'-oktadekyyli-3,3,3',3'-tetrametyyli-indokarbosyaniinijodidi (DiR) (Invitrogen) -leimattu kontrolli

preadiposyytit tai säteilyn aiheuttamat vanhenevat preadiposyytit suspendoitiin uudelleen 200 ul:aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) ja injektoitiin hiirten vatsaonteloon 22 gaugen neulalla. Kolmen päivän kuluttua injektoitiin häntälaskimon kautta 5 x 10 asteen allogeenisia NK-soluja (solujen elinkelpoisuus: 93.{7}},2 prosenttia) 100 ul:ssa PBS:ää. 10. päivänä hiiret nukutettiin isofluraanilla. Fluoresenssi havaittiin käyttämällä MS 100 Series In Vivo Imaging System -järjestelmää (PerkinElmer, MA, USA).

Virtaussytometria

DiR-leimattujen pernan NK-solujen (solujen elinkelpoisuus: 91.8-93,2 prosenttia) kanssa yhdessä inkuboitujen SNC-solujen apoptoosin havaitsemiseksi 1 × 10 asteen SNC:t digestoitiin tarkkuudella 37 asteessa 10 minuutin ajan ja värjättiin sitten anneksiinillä V ja propidiumjodidi (PI) Apoptosis Staining Kit (Multisciences Biotech Co, Ltd., Kiina) valmistajan protokollan mukaisesti. SNC:t avainnoitiin DiR-negatiiviseen kohtaan. NK-solujen aktivoitumisen testaamiseksi hiiren NK-solut kerättiin ja värjättiin mNK1.{11}}allofykosyaniinilla (APC) (S17016D) ja hiiriklusterilla 69-R-fykoerytriini-syaniini7 (mCD{{) 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) 4 asteessa 30 minuutin ajan. Sitten solut käsiteltiin CytodexCytoperm Plus Kitillä (BD Biosciences, USA) ja värjättiin hiiren interferonilla gamma-brilliant violetti 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) 4 asteessa 30 minuutin ajan. Ihmisen NK-solujen perforiini-APC(S16009A)-värjäys suoritettiin käyttäen samaa protokollaa kuin solunulkoiseen värjäykseen (CD56-fluoreseiini-isotiosyanaatti [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) ja solunsisäinen värjäys (perforiini-APC) (Biolegend).

Perifeerisen veren NK-solujen havaitsemiseksi kerättiin 100 ui antikoagulanttia verta. Hiiren perifeeriselle verelle lisättiin CD3-FITC, NK11-APC ja CD69-PE-Cy7. Ihmisen ääreisverestä lisättiin CD3-BV421 (OKT3) ja CD56-FITC, ja niitä inkuboitiin 20 minuuttia huoneenlämmössä.

Sitten lisättiin 400 µl 1 × erytrosyyttilysaattia (BD Biosciences) ja inkuboitiin 3 minuuttia, mitä seurasi kolme pesua PBS:llä. Solujen lisääntymisen havaitsemiseksi rasvakudoksessa hiirille injektoitiin intraperitoneaalisesti 200 µl 10 mg/ml bromideoksiuridiinia (BrdU) 24 ja 72 tuntia ennen eutanasiaa. Eutanasian jälkeen nivusrasvavarastot poistettiin ja leikattiin fragmenteiksi, digestoitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia kollagenaasi ll:lla ja DNaasilla ja suodatettiin käyttämällä 100 um:n solusuodatinta. Solut käsiteltiin Cytofix/Cytoperm Plus Kitillä ja värjättiin BrdU-FITC:llä (3D4) ja Ki67-PE:llä (16A8). Virtaussytometria suoritettiin CytoFLEX-virtaussytometrillä. LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain -pakkausta (Thermo Fisher Scientific, USA) käytettiin kuolleiden solujen sulkemiseen pois kaikissa kokeissa. Tiedot analysoitiin käyttämällä FlowJo-ohjelmistoa (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

Käänteistranskriptio-kvantitatiivinen PCR

RNA uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia ja käännettiin ja transkriptoitiin cDNA:ksi käyttämällä Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit -sarjaa (Yepsen Biotechnology, Kiina). Kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin käyttämällä SYBR Greenin (Yepsen Biotechnology) reaktioseosta ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR Systemissä (Applied Biosystems, USA), GAPDH:n toimiessa sisäisenä kontrollina. Tiedot analysoitiin käyttämällä 2-△ACt-menetelmää. Alukesekvenssiluettelo on raportoitu lisämateriaalissa (taulukko 2-3).

Vanhenemiseen liittyvä -galaktosidaasivärjäys

Soluvärjäystä varten solut pestiin kerran PBS:llä, kiinnitettiin vanhenemiseen liittyvässä -galaktosidaasi(SA- -gal) -liuoksessa (Cell Signaling Technology, USA) huoneenlämpötilassa 15 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa PBS:llä ja inkuboitiin. yön yli SA- -gal-värjäysliuoksessa 37 °C:ssa. Levy suljettiin parafilmillä värjäysväliaineen haihtumisen estämiseksi. Solut

pestiin PBS:llä ja tarkkailtiin mikroskoopilla. Pakasteleikkeen värjäystä varten leikkeitä kuivattiin 37 asteessa 30minuuttia ja kiinnitettiin huoneenlämpötilassa SA- -gal-fiksaatioliuoksessa 15 minuutin ajan. Leikkeet pestiin kolme kertaa PBS:llä ja inkuboitiin yön yli SA- -gal-värjäysliuoksessa 37 °C:ssa. Sitten niitä värjättiin eosiinilla 1 minuutin ajan ja huuhdeltiin vedellä 2 minuutin ajan. SA- -gal-värjäystiedot analysoitiin Image-Pro Plus 6.0 -ohjelmistolla.

Ihmisen rasvakudoksen eksplantaatit

Kolmen yksilön rasvakudos saatiin rasvaimulla. Yksi koehenkilöistä oli mies ja kaksi naisia. Tutkittavien keski-ikä oli 57.{1}}±7,6 vuotta (keskiarvo ±SD: vaihteluväli, 50-65). Keskimääräinen BMI oli 40,5±5,1 kg/m² (keskiarvo ± SD); alue, 36.{10}}.2). Shanghai Mengchaon syöpäsairaalan eettinen komitea (nro 05, 2020, Shanghai Mengchaon syöpäsairaalan lääketieteellinen etiikkakomitea) hyväksyi koesuunnitelman. Tietoinen suostumus saatiin kaikilta vapaaehtoisilta. Rasvakudos leikattiin pieniksi paloiksi, joiden halkaisija oli noin 2 mm. Viisi kudospalaa asetettiin 96-kuoppalevyn kuhunkin kuoppaan ja 200 ul joko preadiposyyttejä tai säteilyn aiheuttamista vanhenevista preadiposyyteistä valmistettua kasvatusalustaa, jota oli täydennetty 10 prosentilla ihmisen AB-seerumilla, 1 prosentilla L-glutamiinilla, 1 prosentti penisilliini/streptomysiiniä, 1 prosentti ei-välttämättömiä MEM-aminohappoja ja 1 prosentti natriumpyruvaattihappoa lisättiin yhteisviljelmään 24 tunnin ajaksi. Sitten elatusaine korvattiin tuoreella elatusaineella, joka sisälsi 5 x 10 asteen autologisia NK-soluja (solujen elinkelpoisuus: 92.3-95,7 prosenttia 6) ja viljeltiin vielä 48 tuntia, minkä jälkeen NK-solut kerättiin virtaussytometriaa varten. Rasvakudos pestiin viisi kertaa PBS:llä ja sama väliaine lisättiin lisäviljelyä varten 48 tunnin ajan; supernatanttia (100 ui) käytettiin monitekijähavainnointiin. Preadiposyytit tai säteilyn aiheuttamat vanhenevat preadiposyytit johdettiin saman yksilön rasvakudoksesta.

Tämä artikkeli on poimittu julkaisusta Cell Death and Disease (2022) 13:305