Cistanche Herban sistanosidi parantaa hypoksian aiheuttamaa miesten lisääntymisvaurioita estämällä oksidatiivisen stressin -Ⅰ

Johdanto

Tällä hetkellä noin 48,5 miljoonaa (15 %) lisääntymisiässä olevaa paria maailmanlaajuisesti kärsii hedelmättömyydestä, joista 40-50 % tapauksista johtuu miesten hedelmättömyydestä, tilasta, joka liittyy vahvasti ympäristö- ja elämäntapatekijöihin. Todisteet viittaavat siihen, että nisäkkään kiveksen alttius alhaiselle hapenpaineelle on syytekijä joihinkin miesten hedelmättömyyden muotoihin. Kuten aikaisemmissa tutkimuksissa on osoitettu, spermatogeneesi heikkenee ja vähenee altistuessaan hypobariselle hypoksialle.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Taustalla olevan mekanismin tutkimiseksi tutkimukset ovat osoittaneet, että altistuminen hypobaariselle hypoksialle lisää reaktiivisten happilajien (ROS) tuotantoa. ROS:lla on tärkeä rooli miehen lisääntymisjärjestelmässä. Alhaisina määrinä niitä tarvitaan siittiöiden kapasitaatioon, akrosomireaktioon ja siittiöiden ja munasolujen fuusioon [10]. Liiallinen ROS voi kuitenkin aiheuttaa siittiöiden tuman/mitokondrion DNA-vaurioita ja plasmakalvon peroksidatiivisia vaurioita, jotka puolestaan ​​ovat merkittäviä etiologisia tekijöitälisääntynyt riski miesten hedelmättömyyteen. Siten hypoksian aiheuttaman ROS:n kertyminen voi olla yksi syy miesten hedelmättömyyteen.

Cistanches Herba, monivuotinen loislääkekasvi, on levinnyt laajalti kuiville alueille ja sitä käytetään laajalti sen farmakologisen toiminnan vuoksi. Kaiken tehokkaan sisällön joukossaCistanches Herba, PhG:t on pidetty pääasiallisena aktiivisena komponenttina. Tähän mennessä 34 PhG:tä on eristettyCistanches kasvit. Cistanosidi(Cis), aktiivinen PhG, joka on eristettyCistanches Herba, on saanut huomiota antioksidanttisista vaikutuksistaan.

Ottaen huomioon Cis:n antioksidanttiset vaikutukset ja ROS:n rooli hypoksian aiheuttamassa miesten hedelmättömyydessä, Cis:tä pidetään mahdollisena lääkekandidaattinahypoksian aiheuttama miehen hedelmättömyys. Harvat raportit ovat kuitenkin käsitelleet Cistanches Herbasta uutetun Cis:n antioksidanttisia vaikutuksia hypoksian aiheuttaman miesten hedelmättömyyden hoidossa tai asiaan liittyviä signalointireittejä. Tässä tutkimuksessa konstruoitiin in vitro ja in vivo hypoksiakokeellisia malleja ja arvioitiin eri Cis:n vaikutuskomponentteja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmä ja reagenssi

Hiiren spermatogoniasolulinja GC-1spg (GC-1) ostettiin American Type Culture Collectionista (ATCC) ja viljeltiin DMEM:ssä (Invitrogen, USA), johon oli lisätty 10 % naudan sikiön seerumia, 1 % L-glutamiini (100 mM), penisilliini (100 U/ml) ja streptomysiini (100 ug/ml) 37 asteessa kostutetussa inkubaattorissa 5 % C02:lla. Cis (Cis-A, B, C, H) ostettiin yhtiöltä Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Kiina).

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Solujen elinkelpoisuusmääritys

Solujen elinkelpoisuus testattiin solulaskentasarja{{0}}-määrityksellä (CCK-8). Lyhyesti sanottuna GC-1-solut kylvettiin 96-kuoppalevyille tiheydellä 1,5 × 103 kuoppaa kohti ja viljeltiin 37 asteessa 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla (20%, 15%, 10%, 5 %) happea tai eri pitoisuuksilla (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis- C, Cis-H) vaaditun ajan. Sitten supernatantti heitettiin pois ja solujen elinkelpoisuus havaittiin käyttämällä CCK-8-sarjaa (Dojindo Japan). Kunkin kuopan absorbanssi mitattiin 450 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa (BioRad USA). Lopuksi solujen elinkelpoisuudet laskettiin seuraavan kaavan mukaan: Solujen elinkelpoisuus=(OD-kokeellinen ryhmä - ODblank-ryhmä)/ (OD-kontrolliryhmä - ODblank-ryhmä) × 100%.

Western blot -analyysi

Kerätyt solut tai kudokset homogenisoitiin RIPA-puskurissa proteiinien uuttamiseksi (RIPA Beyotime China; Cocktail Roche Switzerland). Supernatantit kerättiin ja proteiinien pitoisuus testattiin BCA-menetelmällä (Beyotime). Noin 40 ug kustakin näytteestä uutettuja proteiineja erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin sähköisesti nitroselluloosasuodatinkalvolle (NC) (Beyotime China). NC-suodatinkalvot estettiin 5 % rasvattomalla maidolla 1,5 tunnin ajan ja inkuboitiin spesifisten vasta-aineiden kanssa (anti-PARP 1:1000, antiCaspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax 1 :1000, anti-GAPDH 1:1000, kaikki vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technologylta, USA) yön yli 4 °C:ssa. Sitten kaikkia NC-kalvoja inkuboitiin vastaavan piparjuuriperoksidaasilla konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja kuvattiin kuvantamisjärjestelmällä (Tannon, Kiina).

Solusyklin tunnistus

Virtaussytometrinen määritys (FCM) suoritettiin solusyklin analysoimiseksi. Soluja käsiteltiin eri olosuhteissa 72 tuntia ja kerättiin. Sitten solut pestiin PBS:llä, kiinnitettiin 75-prosenttisessa etanolissa ja värjättiin propidiumjodidilla (PI). Jokaisesta näytteestä kerättiin 1 x 104 solua ja analysoitiin virtaussytometrisesti (FACS Calibur, BD Biosciences). Sitten laskettiin G1/S/G2-vaiheen solujen osuus ja proliferaatioindeksi [vaihe(S+G2)/vaihe(G1+S+G2) × 100 %].

Ki-67-värjäys

Soluja viljeltiin konfokaalimaljalla ja käsiteltiin hypoksialla tai eri Cis-alatyypeillä 72 tunnin ajan. Kun kaikki solut oli kiinnitetty 4-prosenttisella paraformaldehydillä, niitä inkuboitiin anti-Ki-67-vasta-aineen kanssa (1:200, Cell Signaling Technology). Sitten kaikkia soluja inkuboitiin vastaavan CY-3-konjugoidun kanin vastaisen IgG-vasta-aineen (1:200, Boster, Kiina) ja DAPI-liuoksen (1,0 ug/ml, Beyotime) kanssa. Fluoresenssi havaittiin Fluoview FV1000 konfokaalimikroskoopilla (Olympus, Japani).

YLIOPAS CISTANCHE TUBULOSA-UUTE TESTOSTERONIN KOOSTAMISTA PHGS75 % ECH 30 % ACT 12 %

ROS:n havaitseminen

FCM otettiin käyttöön mittaamaan solunsisäisiä ROS-tasoja käyttämällä DCFH-DA:ta. Suspendoidut solut kylvettiin 6-kuoppalevyille ja niille tehtiin erilaisia ​​käsittelyjä. 72 tunnin käsittelyn jälkeen solut suspendoitiin seerumittomaan DMEM:ään, jossa oli 10 µM DCFH-DA:ta (Beyotime). ROS-pitoisuudet määritettiin sitten fluoresenssiaktivoitujen solujen lajittelulla Beckman Coulter Flow Cytometry System -järjestelmässä, jonka viritysaallonpituus oli 488 nm ja emissioaallonpituus 525 nm [18].

Lipidiperoksidaation (LPO) määritys

Tiobarbituurihapporeaktiivisten aineiden (TBARS) määritys suoritettiin LPO:n havaitsemiseksi. Kaikki käyttövaiheet suoritettiin ohjeiden mukaisesti (Sigma USA). Konsentraatiot laskettiin käyttämällä molaarista ekstinktiokerrointa 1,56 × 105/(M·cm), joka saatiin käyttämällä malondialdehydiä standardina. Tulokset ilmaistaan ​​nmolina MDA-ekvivalenttia/mg proteiinia.

Entsyymiaktiivisuuden määrittäminen

Entsyymiaktiivisuudet testattiin käyttämällä määrityssarjoja, jotka sisälsivät glutationireduktaasin (GR), glutationiperoksidaasin (GPx) ja superoksididismutaasin (SOD). Kaikki käyttövaiheet suoritettiin toimitettujen ohjeiden mukaisesti (Nan Jing Jian Cheng Bioengineering Institute China).

Eläimet ja koepöytäkirja

Aikuiset urospuoliset Wistar-rotat (180-220 g, 8 w vanhat) hankittiin Fourth Military Medical Universityn eläinkeskuksesta Xi'anista Kiinasta. Lupa eläinten käyttöön saatiin yliopiston eettiseltä toimikunnalta (viitenumero: 20190506). Eläinkoe ​​suoritettiin yliopiston koe-eläinten hoitoa ja käyttöä koskevien ohjeiden mukaisesti.

Kaikkien rottien annettiin sopeutua noin 1 viikko ennen kokeen aloittamista. Sopeutumisen jälkeen rotat jaettiin satunnaisesti 6 ryhmään, joissa kussakin ryhmässä oli 5 eläintä. Kontrolliryhmän rotat kasvatettiin normaalipaineessa (PO2: 20 %; ilmanpaine: 101,3 kPa), kun taas mallin ja Cis-käsiteltyjen ryhmien rotat kasvatettiin matalapaineisessa happikammiossa (sisäinen paine 61,6 kPa). , joka vastaa 4000 metrin korkeutta merenpinnan yläpuolella, PO2: 14,55 %) korkean merenpinnan hypoksisen ympäristön simuloimiseksi. Kaikilla rotilla oli vapaa pääsy ruokaan ja veteen muovihäkeissä 22 ± 2 asteen lämpötilassa ja kosteusolosuhteissa automaattisella 12-h valo/pimeä-jaksolla. Rotat mallissa ja Cis-käsitellyissä ryhmissä pysyivät hypobarisissa olosuhteissa, mutta siirrettiin normobarisiin olosuhteisiin 96 tunnin välein, jolloin niille annettiin ruokaa ja vettä ja häkit puhdistettiin. Siirtymä hypobarisesta hypobariseen oli noin 2 tuntia. Kaikkia hoitoryhmiä käsiteltiin vastaavalla Cis:llä (8 mg/kg/d) suun kautta letkuruokinnalla 8 viikon ajan, kun taas kontrolli- ja mallirottia käsiteltiin yhtä suurella määrällä vettä.

8 viikon kuluttua rotat tapettiin nukutuksessa. Kivekset, lisäkives ja siemenrakkulat erotettiin ja punnittiin, ja elinindeksi laskettiin seuraavan kaavan mukaan: (elimen/eläimen paino) × 100 %. Myöhemmin lisäkiveksestä kerättiin siittiöitä, ja niiden liikkuvuus ja akrosomientsyymiaktiivisuus testattiin. Samalla tavalla kerättiin kivesten kudoksia histopatologisia tutkimuksia ja ROS-, LPO- ja antioksidanttientsyymiaktiivisuuden havaitsemista varten.

CISTANCHE TUBULOSA Uute CISTANCHE YRTTI LISÄÄ SEKSIVOIMAA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Elävien siittiöiden määrän arviointi

Lisäkives viillettiin kirurgisilla saksilla ja siittiösuspensio valmistettiin normaaliin suolaliuokseen. Elävien siittiöiden määrän arvioimiseksi 5 µl siittiösuspensiota sekoitettiin varovasti yhtä suureen tilavuuteen eosiini-Y-värjäystä. Sen jälkeen siittiöt laskettiin valomikroskoopilla. Elävien siittiöiden määrä arvioitiin laskemalla sekä värjätty (kuollut siittiö) että värjäytymätön siittiö (elävä siittiö).

Siittiöiden akrosomientsyymiaktiivisuuden määrittäminen

Siittiöiden akrosomientsyymien aktiivisuusmääritystä käytettiin siittiöiden akrosomientsyymien arvioimiseen [19]. Tulokset kussakin ryhmässä laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa: Akrosomientsyymiaktiivisuus (μIU)=(ODExperiment group - ODBlank group)/(247,5×10) × 106.

Tulokset

Hypoksian vaikutukset GC{0}}-soluihin

Määrittääksemme hypoksian vaikutukset sukusoluihin tutkimme ensin muutoksia solujen elinkyvyssä eri happipitoisuuksilla (20%, 15%, 10% ja 5%) tehdyn hypoksiahoidon jälkeen 1, 3, 5 , ja 7 päivää. CCK-8-määrityksen tulokset osoittivat, että verrattuna kontrolliryhmään (20 % happipitoisuus) hypoksialle altistuneiden solujen elinkelpoisuus väheni merkittävästi (P ​​< 0,01; kuvio 1A). Lisäksi niiden eloonjäämisaste oli kääntäen verrannollinen happipitoisuuteen ja väheni edelleen induktioajan myötä. Liiallisen sytotoksisen vaikutuksen välttämiseksi 10 % happipitoisuus ja 3-päivän induktioaika valittiin hypoksisen mallin kriteereiksi myöhempiä in vitro -kokeita varten.

Sen jälkeen suoritettiin FCM- ja immunofluoresenssivärjäys GC{{0}}-solujen proliferaatiomuutosten arvioimiseksi edelleen hypoksiahoidon aikana. Tulokset osoittivat, että hypoksia voi aiheuttaa GC-1-solupysähdyksen G1-vaiheessa, mikä vähentää solun pääsyä S-vaiheeseen ja estää DNA:n replikaatiota. Siten hypoksia vähensi merkittävästi GC-1-solujen proliferaatioindeksiä (P < 0,01; kuvio 1B). Positiivinen Ki-67-värjäys on toinen proliferoituvien solujen spesifinen biomarkkeri. Siksi tutkimme myös Ki-67-positiivisten solujen suhdetta hypoksiahoidon kanssa tai ilman. Verrattuna kontrolliryhmään, hypoksiahoito vähensi Ki-67-positiivisia soluja huomattavasti, kuten kuvassa 1C esitetään.

Seuraavaksi pyrimme tutkimaan hypoksian aiheuttaman GC{{0}} solujen elinkelpoisuuden eston tapaa. Kuten kirjallisuudessa on raportoitu, ROS-taso nousi, kun rotat altistettiin hypobaariselle hypoksiselle ympäristölle [8, 20]. Siksi endogeeniset ROS-tasot GC-1-soluissa mitattiin käyttämällä FCM-määritystä. Tulokset osoittivat korkeampia ROS-tasoja hypoksiassa verrattuna normaaliin happiryhmään (P < 0,01; kuva 1D). Kertynyt ROS aiheuttaa huomattavaa DNA:n heikkenemistä, mikä puolestaan ​​aiheuttaa solujen apoptoosireittien aktivaatiota ja saattaa olla tärkein etiologinen tekijä lisääntyvälle miesten hedelmättömyyden riskille [21, 22]. Seuraavaksi havaitsimme TUNEL-värjäyksellä hypoksian apoptoottisen aktivointivaikutuksen GC-1-soluissa. Kuten kuvassa 1E esitetään, hoito hypoksialla johti TUNEL-fluoresenssin lisääntymiseen verrattuna kontrolliryhmään, mikä osoittaa apoptoosin lisääntymistä malliryhmässä.

Koska ROS-indusoitu soluvaurio johtuu yleensä käyttöjärjestelmästä, testasimme edelleen GC-1-solujen käyttöjärjestelmää. Kuten kuvassa 1F esitetään, GC-1-solujen LPO-tasot malliryhmässä olivat huomattavasti kohonneet verrattuna GC-1-solujen LPO-tasoihin kontrolliryhmässä. Nämä havainnot viittasivat siihen, että hypoksian aiheuttama GC{6}}-soluvaurio saattaa liittyä käyttöjärjestelmään, jonka aiheuttaa ROS:n kertyminen.