Cistanche Tubulosasta peräisin olevan sakkaroosisyntaasin geenikloonaus, funktionaalinen tunnistus, rakenne- ja ilmentymisanalyysi Ⅲ

4 CtSus:n ilmentymisanalyysi Cistanche tubulosan eri osissa ja soluviljelyjärjestelmässä kuivuusstressissä

4.1 CtSus:n ekspressioanalyysi Cistanche tubulosan eri osissa

In vitro kokosolutransformaatiokokeet ja entsymaattiset katalyyttiset reaktiokokeet vahvistivat, että CtSus-geenin koodaamalla proteiinilla on kyky katalysoida UDP-glukoosin synteesiä. Tämän geenin ja Cistanche tubulosan glykosidiyhdisteiden biosynteesin välisen korrelaation tutkimiseksi tarkemmin tämän geenin ilmentymistasoa eri osissaCistanche tubulosaanalysoitiin.

MYYNNISSÄ LAADUKKAAT CISTANKAN RAAKA-AINEET

Wecistanchen tukipalvelu - Ota yhteyttä saadaksesi tietoa alennuksesta:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Puhelin:+86 15292862950

Ekinakosidion Cistanche tubulosan edustavin glykosidiyhdiste, ja sen pitoisuus voi olla yli 30 % Cistanche tubulosa -kasvien kuivapainosta [23]. Tutkimusryhmä mittasi aiemmin ekinakosidipitoisuutta eri osissa Cistanche tubulosa -kasveja, ja spesifinen suorituskyky oli:echinacoside in different tissues was haustorium>underground part>>ilmaosa; heistä haustoriumin ekinakosidipitoisuus oli korkein. Reaaliaikainen fluoresenssikvantitatiivinen PCR suoritettiin käyttämällä Cistanche tubulosan eri osista peräisin olevaa cDNA:ta templaatteina, ja tulokset analysoitiin 2:lla.–ΔΔCT-menetelmä ja differentiaalianalyysi suoritettiin. Tulokset on esitetty kuviossa 4A. CtSus-geenin ilmentymistaso haustoriumissa oli korkein, 1,5 kertaa maanpäällisen osan ilmentymistaso, ja maanalaisessa osassa ilmentymistaso oli merkittävästi korkeampi kuin maanpäällisessä osassa, mikä on yhdenmukainen fenyylietanoliglykosidien kertymismallin kanssa. jota edustaa ekinakosidi eri osissaCistanche tubulosa.

Kuva 4 CtSus:n suhteelliset ilmentymistasot C. tubulosan eri osissa ja PEG6000:lla käsitellyissä suspensiosoluissa. A: CtSus:n suhteellinen ilmentymistaso C. tubulosan eri osissa; B: CtSus:n suhteellinen ilmentymistaso C. tubulosa -suspensiosoluissa, jotka on käsitelty PEG6000:lla eri ajankohtina n=3, 𝑥̅± s.*P ＜ 0,05,***P ＜ 0,001

LAADUKKAAT CISTANKAN RAAKA-AINEET

4.2 CtSus:n ekspressioanalyysi Cistanche deserticola -suspensiosoluissa kuivuuden stressiolosuhteissa

Hankkeen alustava tutkimus osoitti senPEG6000:n aiheuttama kuivuusstressivoikasvaa merkittävästithefenyylietanoliglykosidien kertyminenCistanche-suspensiokennoissa. 3 - 9 päivää induktion jälkeen echinaceaside-pitoisuus kasvoi merkittävästi. 12.-15. päivä,echinaceasiden kasvunopeussisältö hidastui ja saavutti maksimiarvon 15. päivänä. Sitten kun viljelyaika piteni, echinaceaside-pitoisuus kasvoi merkittävästi. Fruktosidipitoisuus pieneni vähitellen [24]. Tämän tutkimuksen pohjalta tässä artikkelissa käytettiin käsittelemättömien Cistanche deserticola -suspensiosolujen ja PEG6000--indusoitujen Cistanche deserticola -suspensiosolujen cDNA:ta templaatteina reaaliaikaiseen kvantitatiiviseen fluoresenssi-PCR-detektioon CtSus-geenin tutkimiseksi Cistanche deserticola -suspensiossa. soluja kuivuuden stressiolosuhteissa. ilmentymistasojen muutokset. Tulokset on esitetty kuviossa 4B. PEG6000:n indusoimissa Cistanche deserticola -suspensiosoluissa CtSus:n ilmentyminen lisääntyi merkittävästi kuudentena päivänä induktion jälkeen ja saavutti korkeimman arvon 9. päivänä ja laski sitten takaisin samalle tasolle kuin kontrollissa. saman tason ryhmät. Yllä olevat tulokset osoittavat, että kuivuusstressi voi merkittävästi lisätä CtSus-geenin ilmentymistä Cistanche deserticola -suspensiosolulinjassa, mikä on yhdenmukainen echinaceasiden kertymismallin kanssa kuivuusstressissä. CtSus-geenin ilmentymishuippu ilmestyy kuitenkin aikaisemmin kuin echinaceaside-pitoisuuden huippu, koska CtSus-katalyysillä syntetisoitu aktiivinen glykosyyliluovuttaja on tärkeä prekursori, jota tarvitaan monivaiheiseen glykosylaatioreaktioon myöhemmässä echinaceasiden biosynteesireitissä. Siksi oletetaan, että kuivuusstressin jälkeen organismit mobilisoivat ensisijaisesti primaariseen aineenvaihduntaan liittyviä geenejä saavuttaakseen aktiivisten luovuttajien kerääntymisen ja saavuttaakseen sitten tärkeiden sekundaaristen metaboliittien kertymisen.

LAADUKKAAT CISTANKAN RAAKA-AINEET

5 CtSus-proteiinin kolmiulotteinen rakennetutkimus ja keskeisten aktiivisten kohtien analyysi

Perustuen CtSus:n toimintoon glykosyylidonorin UDP-glukoosin tuotannon katalysoinnissa, CtSus:n katalyyttisen aktiivisuuden rakenteellista perustaa tutkittiin edelleen. Proteiinin sekundaarirakenteen ennustamiseen käytettiin online-työkalua SOPMA. Tulokset osoittivat, että CtSus:n sekundäärirakenne sisälsi 55,28 % -kierteitä, 25,47 % satunnaisia ​​kierteitä, 12,80 % pitkiä juosteita ja 6,46 % -käänteitä (kuva 5A), mikä osoittaa, että -heliksit ovat CtSus-proteiinin tärkeimmät toissijaiset rakenneyksiköt. seuraa satunnaiset kierteet, jotka myös muodostavat suuren osan proteiinista. Laajennetut säikeet ja käännökset jakautuvat koko proteiiniin. Olemassa olevien tutkimusten mukaan sakkaroosisyntaasi esiintyy yleensä tetrameerin muodossa, jota pidetään sen aktiivisena muotona. Siksi tässä artikkelissa käytettiin edelleen AlphaFold2:ta ennustamaan CtSus-proteiinin rakennetta ja saatiin sen proteiinitetrameerien kolmiulotteinen rakenne. PDB (Protein Data Bank) -tietokannan vertailussa havaittiin, että Arabidopsis thaliana -sukroosisyntaasin AtSus1 (PDBID 3S28) ja CtSus:n sekvenssien samankaltaisuus voi olla 77,93 %. Ennustettua CtSus-rakennetta verrattiin AtSus1:n kolmiulotteiseen rakenteeseen, ja keskimääräinen neliöpoikkeama (RMSD) proteiinin superpositiota jälkeen oli 1,11 Å, mikä osoittaa, että näiden kahden tilarakenteet ovat erittäin yhdenmukaisia ​​(kuvio 5B).

Raportoitua Arabidopsis AtSus1:n proteiini-ligandikidekompleksirakennetta UDP:n ja fruktoosin kanssa (PDBID3S29) käytettiin templaattina [16] analysoimaan CtSus:n sitoutumismuotoa UDP:n ja fruktoosin kanssa. Molekyylitelakkatulokset on esitetty kuvassa 5C. Voidaan havaita, että AtSus1:n ja CtSus:n substraattia sitovat taskut ovat hyvin samankaltaisia ​​aminohappotyypin, tilajakauman ja konfiguraation suhteen, ja päällekkäisyys on suuri, mikä osoittaa, että sakkaroosisyntaasin sekvenssi on erittäin konservoitunut kasveissa. Kahden ligandin, UDP:n ja fruktoosin, konformaatiot proteiinisubstraattia sitovassa taskussa on esitetty kuviossa 5D. UDP:n ja CtSus:n molekyylitelakoinnin edullisimmalla konformaatiolla on hyvä päällekkäisyys AtSus1-UDP-kidekompleksissa olevan UDP:n konformaation kanssa, mikä todistaa molekyylitelakointitulosten tarkkuuden. UDP:n ja avainaminohappotähteiden välinen vuorovaikutus proteiinisubstraattia sitovassa taskussa on esitetty kuviossa 5E. UDP ja CtSus ovat pääasiassa sitoutuneet toisiinsa vetysidoksilla ja hydrofobisilla vuorovaikutuksilla. Avainaminohappotähteet substraattia sitovassa taskussa sisältävät: eu294, Gly301, Met576, Arg578, Lys583, Gln646, Asn652, Leu677, Thr678 ja Glu681.

Viitteet

[1] Kappale ZH, Lei L, Tu PF. Edistystä CistancheHoffingin kasvien farmakologisen aktiivisuuden tutkimuksessa. et Link [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2003, 34: 113-115.

[2] Liu WJ, Liu Y, Song QQ, et ai. Kemoomivertailu viljellyn ja villin Cistanchetubulosan välillä käyttäen1H-NMR-spektroskopiaa [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2018, 43:3506-3512.

[3] Song Y, Zeng K, Jiang Y ym. Cistanches Herba, uhanalaisesta lajista suureksi kiinalaiseksi lääkemerkiksi [J]. Med Res Rev, 2021, 41: 1539-1577.

[4] Liu Y, Wang H, Yang M, et ai. Cistanche deserticola -polysakkaridit suojaavat PC12-soluja OGD/RP:n aiheuttamalta vauriolta [J]. Biomed Pharmacother, 2018, 99: 671-680.

[5] Yin Y, Huang J, Gu X, et ai. Kasvien nukleotidi-sokeri interkonversioentsyymien evoluutio [J].PLoS One, 2011, 6: e27995.

[6] Bar-Peled M, O'Neill MA. Kasvien nukleotidisokerin muodostuminen, keskinäinen muuntaminen ja pelastaminen sokerin kierrätyksellä [J]. Annu Rev Plant Biol, 2011, 62: 127-155.

[7] Guo H, Li L, Wang PG. UDP-GlcNAc/Glc4-epimeraasin biokemiallinen karakterisointi Escherichia colista O86:B7 [J]. Biochemistry, 2006, 45: 13760-13768.

[8] Dong S, Chesnokova ON, Turnbough CL Jr, et ai. Exosporium-proteiinin glykosylaatioon osallistuvan UDP-N-asetyyliglukosamiini4-epimeraasin tunnistaminen Bacillus anthraciksessa [J]. J Bacteriol, 2009, 191: 7094-7101.

[9] Li LN, Kong JQ. Sakkaroosisyntaasigeenien transkription kattava tunnistus Ornithogalumcaudatumissa [J]. RSC Adv, 2016, 6: 18778-18792.

[10]Schmölzer K, Gutmann A, Diricks M, et ai. Sakkaroosisyntaasi: ainutlaatuinen glykosyylitransferaasi biokatalyyttisen glykosylaatioprosessin kehittämiseen [J]. Biotechnol Adv, 2016, 34: 88-111.

[11] Cardini CE, Leloir LF, Chiriboga J. Sakkaroosin biosynteesi [J]. J Biol Chem, 1955, 214: 149-155.[12]Stein O, Granot