Cistanche-polysakkaridit tehostavat ekinakosidin imeytymistä in vivo ja vaikuttavat suoliston mikrobiotaan

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Zhifei Fu et ai

Abstrakti

Polysakkaridit jafenyylietanoidiglykosiditalkaenCistanche deserticolaon osoitettu olevan erilaisia ​​terveyshyötyjä, mutta näiden kahden tyyppisten yhdisteiden vuorovaikutteista vaikutusta in vivo ei tunneta yksityiskohtaisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia tsistanche-polysakkaridien synergistisiä vaikutuksia fenyylietanoidiglykosidin kanssa ja polysakkaridien vaikutuksia suoliston mikrobiotaan. Sprague-Dawley-rottia ruokittiin erilaisilla cistanche-polysakkarideilla 20 päivän ajan, viimeisenä päivänä kaikille rotille annettiinekinakosidi100 mg/kg. Tuloksia verrattiin pääasiassa farmakokineettisten parametrien, suoliston mikrobiot koostumuksen ja lyhytketjuisten rasvahappojen pitoisuuksien erojen perusteella. Tulokset osoittivat, että kaikki kivipolysakkaridit, mukaan lukien raa'at polysakkaridit, ovat suurimolekyylisiäpainoisia polysakkarideja, ja pienimolekyylipainoiset polysakkaridit, voisivat säädellä suoliston mikrobiston monimuotoisuutta, lisätä hyödyllisiä bakteereja ja erityisesti edistää Prevotella spp. sekä parantaa lyhytketjuisten rasvahappojen tuotantoa ja ekinakosidin imeytymistä. Tutkimalla polysakkaridien synergistisiä vaikutuksia pienten molekyylien kanssa, nämä havainnot viittaavat siihen, että kiistanche-polysakkarideja, erityisesti alhaisen molekyylipainon polysakkarideja, voitaisiin käyttää suoliston mikrobiotan manipuloijana terveyden edistämiseen.

Avainsanat:CistanchedeserticolapolysakkaridiEkinakosidiSuoliston mikrobiota

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja cistanche-tuotteista

1. Esittely

Viime vuosina on käynyt selväksi, että polysakkaridit muokkaavat suoliston mikrobiston koostumusta ja että muutokset voivat välittää useita ravintoaineiden imeytymistä [1], mikä tuottaa fysiologisia toimintoja [2,3]. Perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) polysakkaridien on osoitettu olevan ihanteellisia ehdokkaita suoliston mikrobiotan säätelyyn ja niillä on prebioottisia vaikutuksia. Ruoansulatuksessa polysakkaridit ja jotkut pienmolekyyliset yhdisteet vaikuttavat väistämättä jonkin verran biologisiin aktiivisuuksiin [4]. Panax ginsengissä, jota on käytetty laajalti tuhansia vuosia, yhtenä tärkeimmistä aktiivisista ainesosista polysakkaridit olivat hyviä.parannusinsuolistonaineenvaihduntaajaimeytyminen/ginsenosiditin vivo [5]. Codonopsis pilosulan polysakkaridit osoittivat saponiinien imeytymistä edistävän vaikutuksen dekstraanisulfaatin natriumin aiheuttamissa koliittihiirissä [6]. Ganoderma lucidumin polysakkarideilla, erityisesti korkean molekyylipainon fraktiolla, havaittiin olevanprebioottitoimintojarasvaisen ruokavalion aiheuttamissa suoliston dysbioosihiirimalleissa [7]. Longan-polysakkaridit säätelevät suoliston mikrobiota ja suoliston metaboliitteja (lisäten pyruvaatin ja butanoaatin pitoisuutta) tuottaen immunomodulatorisia vaikutuksia [8].

Cistanche deserticolaa on perinteisenä kiinalaisena lääketieteenä käytetty laajalti ravintolisänä Kiinassa. Farmakologiset tutkimukset osoittivat, että se oli esillähermoja suojaava, immunomoduloiva, hormonaalinentasapainottaa, anti-väsymys, anti-tulehduksellinen, maksan suojaus,anti-hapettava, anti-bakteeri, anti-virus, jaanti-kasvainvaikutukset [9]. Kemiallinen analyysi osoitti, että fenyylietanoidiglykosidit ja polysakkaridit olivat tärkeimmät aktiiviset ainesosat. Ekinakosidilla, pääasiallisella fenyylietanoidiglykosidilla C. deserticolassa, on havaittu laajoja farmakologisia vaikutuksia, mutta sen lääkekelpoisuus on rajoitettu huonon biologisen hyötyosuuden, nopean ja laajan metabolian in vivo vuoksi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että suoliston mikrobiota voi metaboloida ekinakosidin in vitro [10,11]. In vivo -todisteita ei kuitenkaan ole tutkittu. Kuten tiedämme, suoliston mikrobiotalla oli tärkeä rooli rohdosvalmisteiden metaboloivan bioaktiivisuuden välittäjänä. Siksi tämän työn päätavoitteena oli tutkia vaikutustacistanche-polysakkariditsuoliston mikrobiotaan ja vaikutuksiin ekinakosidin metaboliaan.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit ja kemikaalit

Cistanche deserticola YC Ma hankittiin Alashanista, Sisä-Mongoliasta Mandela hiekkateollisuuden kehitys Co., LTD, Kiina. Professori Lijuan Zhang (Tianjinin perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopisto) vahvisti ne. Lahjakorttinäyte talletettiin laboratorioimme. Standardiaine, kuten ekinakosidi, akteosidi ja klorogeenihappo, saatiin National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products -instituutista (Peking, Kiina). Kunkin standardin puhtaus oli suurempi tai yhtä suuri kuin 98 prosenttia. Asetonitriili ja kromatografialaatuinen metanoli ostettiin Fisher Scientificilta (Pitts burgh, PA). Muurahaishappo ostettiin yhtiöltä Anaqua Chemical Supply Inc. (Wilmington, USA). Muut kemialliset reagenssit olivat analyyttistä laatua ja ostettu yhtiöltä Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Kiina).

Urospuoliset Sprague-Dawley-rotat (200–220 g) toimitti Beijing HFK Bioscience CO., LTD (Peking, Kiina, lisenssinumero SCXK (Jing) 2014- 0004). Kaikki eläimet kasvatettiin ja pidettiin SPF-olosuhteissa eläintilassa. Koe suoritettiin eläintenhoidon ohjeiden mukaisesti ja siinä käytettiin TJUTCM:n komiteaa ja noudatettiin Yhdysvaltain kansallisten terveysinstituuttien julkaisemaa koe-eläinten hoito- ja käyttöopasta (NIH:n julkaisunumero 85–23, tarkistettu 1996). ). Yhden viikon sopeutumisjakson jälkeen rotat jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: kontrolliryhmä, kokonaispolysakkaridiryhmä, suurimolekyylinen polysakkaridiryhmä ja pienimolekyylinen polysakkaridiryhmä. Kukin ryhmä käsitti 6 rottaa, jotka kasvatettiin samassa häkissä.

2.2. Cistanche-polysakkaridien valmistus

3.0 kg Cistanche deserticola YC Ma:ta puhdistettiin ja kuivattiin 40 asteessa ilmakuivausuunissa ja murskattiin sitten karkeaksi jauheeksi. Kuiva karkea jauhe uutettiin 85-prosenttisella vesipitoisella etanolilla (v/v) 60 asteessa kaksi kertaa ja 2 tuntia kullakin kerralla. Kiintoaine-neste-suhteet olivat 1:12 ja 1:10, vastaavasti. Yrttijäännökset uutettiin 100-asteisella vedellä vielä kaksi kertaa, uuttoaika ja kiintoaine-neste-suhde olivat samat 85-prosenttisella etanolilla. Vesiliuos yhdistettiin ja konsentroitiin alennetussa paineessa ja saostettiin sitten 80-prosenttisessa etanolissa, seisoen alle 4 asteessa 24 tuntia. Sakka eristettiin sentrifugoimalla nopeudella 8000 rpm 10 minuuttia 4 asteessa ja sitten lyofilisoitiin kokonaispolysakkaridien (ZT) saamiseksi. Sitten ZT liuotettiin deionisoituun veteen ja suodatettiin 100 kDa:n onttokuitu-ultrasuodatuskalvolla, retentiiviset infiltraatin korkeamolekyyliset polysakkaridit (HM) kerättiin. Läpäisty suodos suodatettiin 6 kDa:n ultrasuodatuskalvolla. Saatiin retentiiviset suodoksen keskimolekulaariset polysakkaridit (MM) ja permeatoidut suodoksen pienimolekyyliset polysakkaridit (LM).

2.3. Cistanche-polysakkaridien ensisijainen karakterisointi

Polysakkaridin pitoisuus määritettiin rikkihappofenolimenetelmällä käyttäen glukoosia standardina [12]. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin BCA-menetelmällä [13]. Monosakkaridikoostumusanalyysi suoritettiin HPLC:llä (UltiMate 3000-järjestelmä), joka oli varustettu SinoPak C18 -kolonnilla (5 μm, 150 mm × 4,6 mm) ja diodirividetektorilla (VWD-3000). PMP (1-fenyyli-3- metyyli-5-pyratsoloni) esikolonnijohdannaisten kromatografinen erotus suoritettiin käyttämällä 100 mM fosfaattipuskuria ja asetonitriiliä suhteessa 82:18 (tilavuus/tilavuus). , prosenttia) liikkuvana faasina virtausnopeudella 1,0 ml/min. 10 µl kutakin näytettä injektoitiin ja analyysin ajoaikaa käytettiin 30 minuuttia havaitsemalla aallonpituudella 245 nm. Tiedonkeruu ja käsittely suoritettiin käyttämällä Chromeleon Software 7.1:tä (Dionex, Sunnyvale, CA, USA).

Molekyylipaino (Mw) määritettiin korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografialla (HPSEC, UltiMate 30{{10}}0 -järjestelmä), joka oli varustettu TSK-geelillä G3000 PWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japani) ja TSK-geeli GMPWXL (7,8 × 300,0 mm, Tosoh, Japani) -kolonni ja RefractoMax521-taitekerroindetektori (RID). Näytteet eluoitiin 0,1 mol/l Na2S04:lla virtausnopeudella 0,5 ml/min. Kolonnin lämpötila pidettiin 35 asteessa. Dekstraani standardeina ja standardikäyrä piirrettiin eluutioajan mukaan, joka on esitetty molekyylipainon logaritmia vastaan.

2.4. Farmakokineettinen tutkimus

Verinäytteet otettiin sisäkantuksesta klo {{0}} h, 0.083 h, 0.167 h, 0.25 h, 0,5 h, 0,75 h, 1.0 h, 2.0 h, 3.{{20}} h, 4.0 h, 6.0 h, 8.0 h, 10 h, 12 h ja 24 h ekinakosidin (100 mg/kg) annon jälkeen. Plasmanäytteet saatiin sentrifugoimalla 10 minuuttia nopeudella 7500 pm. 100 µl:aan plasmanäytettä lisättiin 10 µl IS (klorogeenihappo) liuosta ja 500 µl metanolia. Sitten seosta vorteksoitiin 3 minuuttia ja sentrifugoitiin 14, 000 rpm 10 minuuttia. Supernatantti kerättiin ja kuivattiin typessä huoneenlämpötilassa. Sen jälkeen jäännös liuotettiin 100 µl:aan 50-prosenttista vesipitoista metanolia, sentrifugoitiin jälleen 14, 000 rpm 10 minuuttia. Lopuksi 3 µl supernatanttia injektoitiin LC-MS/MS-järjestelmään analyysiä varten. Näytteet analysoitiin aiemmin raportoidulla menetelmällä. Liikkuva faasi koostui CH3CN:stä (liuotin A) ja H2O:sta (sisältää 0,1 % HCOOH; liuotin B) käyttäen seuraavaa gradienttia: 0-1 min, 10 % A; 1–8 min, 10–90 prosenttia A; 8–9 min, 90–10 prosenttia A; 9–11 min: 10 prosenttia A. Näyte erotettiin ACQUITY HSS T3 -kolonnissa (1,8 μm, 100 mm × 2,1 mm id). Virtausnopeus oli 0,3 ml/min ja kolonnin lämpötila asetettiin 35 asteeseen. MS-analyysissä käytettiin negatiivista ionisaatiomoodia seuraavilla optimoiduilla parametreilla: kapillaarijännite, 2,5 kV; desolvataatiolämpötila, 450 astetta. Desolvatointina käytettiin typpeä ja kartiokaasua virtausnopeudella 900 l/h ja 150 l/h. Kvantitointi suoritettiin siten käyttämällä MRM:ää siirtymäkohdista m/z 785,29 → 623,26 ekinakosidille, m/z 353,06 → 191,07 klorogeenihapolle (IS), m/z 623,24 → 161,09 akteosidille. Ekinakosidin, IS:n ja akteosidin kartiojännite olivat 100 V, 32 V ja 74 V; törmäysenergia, 32 V, 14 V ja 30 V.

2.5. Lyhytketjuisten rasvahappojen (SCFA) tutkimus

Urospuolisille Sprague-Dawley-rotille annettiin suun kautta ZT, HM ja LM 3 viikon ajan. SCFA:iden (etikkahappo, propionihappo, isovoihappo, voihappo, isovalerihappo, valeriaanahappo ja heksaanihappo) määrittäminen kaasukromatografialla (GC) tehtiin kuten aiemmin on kuvattu muutamalla modifikaatiolla [14]. Lyhyesti sanottuna 0,5 g ulostenäytettä dispergoitiin 2,5 ml:aan Milli-Q-vettä, vorteksoitiin 10 min ja 7,5 ml:aan 1-prosenttista HCl/etanoli-liuosta, joka sisälsi sisäisiä standardeja (voihappoa 24,0 ug /ml ja 2- etyyliheksaanihappo 1,32 ug/ml sisäisinä standardeina). Seoksia homogenisoitiin 5 minuuttia ja sentrifugoitiin 14, 000 rpm 10 minuuttia 4 asteessa. Viisi mikrolitraa supernatanttia injektoitiin split-tilassa suhteessa 30:1. Kantajakaasu oli N2 (99,999 prosenttia) nopeudella 1 ml/min. Lisäkaasun (N2) nopeus oli 25 ml/min. H2:n ja ilman virtausnopeus oli vastaavasti 30 ml/min ja 300 ml/min. Ulostenäytteet kerättiin tämän tutkimuksen 20. päivänä ja säilytettiin välittömästi -80 asteessa.

2.6. Ulosteiden kerääminen, DNA:n uutto ja 16S rRNA-geenin sekvensointi

Noin 200 mg tuoretta ulostenäytettä kerättiin 1,5 ml:n steriiliin Eppendorf-putkeen per rotta ja säilytettiin -80 asteessa myöhempää DNA:n valmistusta varten. DNA uutettiin ulosteesta käyttämällä QIAamp DNA Stool Mini Kit -sarjaa (QIAGEN). DNA:n määrä määritettiin käyttämällä NanoDrop-spektrofotometriä (Thermo Electron Corporation); eheys ja koko tarkistettiin 1,0-prosenttisella agaroosigeelielektroforeesilla. Konsentraation mukaan DNA laimennettiin 1 ng/μL steriilillä vedellä.

16S rRNA monistettiin käyttämällä spesifistä aluketta (V4: 515F-806R) viivakoodin kanssa. Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin Phusion® High Fidelity PCR Master Mixillä (New England Biolabs). Sekoita yhtä suuri määrä 1 x latauspuskuria (sisältää SYB vihreää) PCR-tuotteiden kanssa ja suorita elektroforeesi 2-prosenttisella agaroosigeelillä havaitsemista varten. Lisäkokeita varten valittiin kirkkaat päänauhat välillä 400 - 450 bp. PCR-tuotteet sekoitettiin EU:n tiheyssuhteissa. Sitten PCR-tuotteiden seos puhdistettiin Qiagen Gel Extraction Kitillä (Qiagen, Saksa).

Sekvensointikirjastot rakennettiin käyttämällä TruSeq® DNA PCR Free Sample Preparation Kit -pakkausta (Illumina, USA) noudattaen valmistajan suosituksia ja indeksikoodit lisättiin. Kirjaston laatu arvioitiin Qubit® 2.{1}} Fluorometer (Thermo Scientific) ja Agilent Bioanalyzer 2100 -järjestelmällä. Kirjasto sekvensoitiin Illumina HiSeq 2500 -alustalla ja luotiin 250 bp:n parillisen pään lukuja.

2.7. Bioinformatiikan analyysi

Viivakoodi- ja alukesekvenssin katkaisu, sekvenssin kokoaminen ja tietojen suodatus QIIME:n (V 1.7.0) mukaisesti. Sekvenssejä, joiden samankaltaisuus oli suurempi tai yhtä suuri kuin 97 prosenttia, määritettiin samoille OTU:ille. OTU:t on merkitty SILVA-tunnisteiksi. Alfa-diversiteettiindeksit, jotka arvioivat suoliston mikrobiyhteisön rikkautta (ACE- ja Chao1-mittarit) ja yhteisön monimuotoisuutta (Shannon- ja Simpson-mittarit) laskettiin käyttämällä Qiimea (versio 1.9.1). Beta-diversiteettianalyysiä käytettiin mikrobiyhteisöjen rakenteellisten vaihteluiden tutkimiseen UniFrac-etäisyyttä käyttäen. Kaikkien ryhmien väliset erot testattiin Tukey-testillä ja Wilcox-testillä. Pääkoordinaattianalyysiä (PCoA) käytettiin selittämään koostumuksen erot neljän ryhmän välillä käyttämällä R-paketteja. Lineaarisen erotteluanalyysin vaikutuskoko (LEfSe) -menetelmä on suunniteltu erityisesti biomarkkerien etsintä- ja selityssekvensointitietoihin. Ja lineaarista erotteluanalyysiä (LDA) käytettiin laskemaan kunkin erilailla suoliston mikrobien vaikutuskoko ja kuhunkin rottaryhmään liittyvät ominaisuudet. Korrelaatioanalyysi toteutettiin käyttämällä R-paketteja gcorrplot (versio 1.1.463).

SCFA-tiedot analysoitiin käyttämällä SPSS 22:n ANOVAa.0.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Cistanche-polysakkaridien valmistus ja kemiallinen analyysi

Cistanches Herbaa käytetään Kiinassa sekä ruoana että lääkkeenä. Siitä eristetyt polysakkaridit ovat herättäneet suurta huomiota merkittävän aktiivisuutensa ansiosta. Tässä tutkimuksessa neljä osaa cistanche-polysakkarideja (ZT, HM, MM ja LM) saatiin vesiuutto-, alkoholisaostus- ja ultrasuodatusmenetelmällä. Neljän osan polysakkaridien kemialliset koostumukset on esitetty taulukossa 1.

Näytteiden kokonaissokeripitoisuudet käyttämällä glukoosin standardikäyrää. Tulos osoitti, että HM:n ja LM:n saannot olivat korkeammat kuin MM:n. Polysakkarideilla oli erilaisia ​​farmakologisia ominaisuuksia, erityisesti immuuniaktiivisuutta. Tutkimukset ovat osoittaneet, että monosakkaridipitoisuudella ja -tyypillä, molekyylipainolla, substituenttiryhmän tyypillä on tärkeä rooli polysakkaridien aktiivisuuksissa [15]. Cistanche-polysakkaridien monosakkaridikoostumuksen eri osat olivat samanlaisia, ja mannoosi (Man), galakturonihappo (GalUA), glukoosi (Glc), galaktoosi (Gal) ja arabinoosi (Ara) olivat tärkeimmät monosakkaridit.

Sisältö oli kuitenkin erilainen neljän osan välillä. Glukoosi ja arabinoosi olivat ZT:n ja HM:n pääkomponentteja, kun taas glukoosi oli LM:n pääsokeriyksikkö, lisäksi näissä fraktioissa havaittiin myös vähän ramnoosia ja glukuronihappoa (GlcUA).

Näytteiden suhteelliset molekyylipainot tutkittiin korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografialla (HPSEC). Dekstraanien ja pylväiden retentioajan standardikäyrän mukaan päähuippujen molekyylipainot ZT:ssä havaittiin arvoilla 1,68 × 106 Da ja 1,70 × 104 Da, HM:ssä määritettiin 1,54 × 106, 2,06 × 105 ja 4,81 × 104 MM:ssä ja LM:ssä määritettiin vastaavasti 1,09 × 104 ja 2,05 × 104. Niiden saannot lueteltiin taulukossa 1 ja MM:n saanto oli alhainen eikä riittänyt eläinkokeeseen. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että kistankkipolysakkaridien rakenteesta riippuvat vaikutukset erilaisiin bioaktiivisuuksiin [16]. Lisäkokeita tarvitaan vielä, erityisesti puhdistusta. Rakenne-aktiivisuustutkimukseen tulisi soveltaa Fifine-rakenneanalyysiä

3.2. Farmakokinetiikkatutkimus

Ekinakosidin farmakokinetiikkaa tutkittiin ultrakorkean suorituskyvyn nestekromatografialla kolminkertaisella kvadrupolimassaspektrometrialla (UPLC ja Xevo TQ-S) ekinakosidin oraalisen annon jälkeen. Ekinakosidin keskimääräiset plasmakonsentraatio-aikaprofiilit on esitetty kuvassa 1. Lääke- ja tilastoohjelmiston (DAS, versio 2.0) mukaan ekinakosidin farmakokinetiikka sopii yhden osaston malliin ja toinen ZT-, HM- ja LM-ryhmien parametrit on koottu taulukkoon 2, mukaan lukien aika maksimipitoisuuden saavuttamiseen (Tmax), maksimipitoisuus (Cmax), pitoisuus-aikakäyrän alla oleva pinta-ala (AUC) ja keskimääräinen viipymäaika (MTR). ). Farmakokineettinen tutkimus osoitti, että ekinakosidin keskimääräinen Cmax ZT-, HM- ja LM-ryhmissä oli 646,4 ng/ml, 732{13}} ng/ml ja 898,4 ng/ml, jotka olivat 1,6, 1,8 ja 2,2. kertaa verrattuna kontrolliryhmään (406,8 ng/ml), vastaavasti. Polysakkarideilla esikäsittelyllä ekinakosidin AUC(0-24 h) nousi vastaavasti 6,6 prosenttia, 36,7 prosenttia ja 63,6 prosenttia ZT-, HM- ja LM-ryhmissä verrattuna kontrolliryhmään, joka osoitti, että polysakkarideilla oli pienen molekyylin imeytymistä edistävä aktiivisuus. Nämä tulokset olivat melko samanlaisia ​​kuin kitioligosakkaridit paransivat Fructus Forsythia -uutteen fenyylietanoliglykosidien biologista hyötyosuutta [17] ja Polygonum multiflorumin polysakkaridit paransivat 2, 3, 5, 4'-tetrahydroksi- 2-beneenin biofarmaseuttisia ominaisuuksia. O- -D-glukosidi normaaleissa Sprague-Dawley-rotissa [18]. Suoliston mikrobiota sisältää erilaisia ​​lääkeaineenvaihduntaan liittyviä entsyymejä, ja mikrobiomin mekanismit lääkkeen farmakokinetiikkaa ja farmakodynamiikkaa muokkaavat ovat edelleen tuntemattomia [19]. Polysakkaridit voivat ruokkia suoliston mikrobiota lisäämällä immuunijärjestelmää, imemällä ravintoaineita ja vähentämällä patogeenien kasvua [20,21]. Vaikka kirjallisuudessa kerrottiin, että kiistanche-polysakkaridit voisivat lisätä ekinakosidin metaboliitteja (kuten akteosidia) in vitro, emme havainneet, että rinnakkaiset polysakkaridit olisivat hyötyneet ekinakosidin muuttumisesta akteosidiksi in vivo [10,11].

3.3. SCFA-pitoisuus rotan ulosteissa

Suoliston mikrobiota fermentoi polysakkarideja, jotka tuottavat erilaisia ​​bioaktiivisia polymeerejä ja metaboliitteja, kuten SCFA:ita [3]. SCFA:t analysoitiin polysakkaridien päämetaboliitteina ulosteessa. SCFA:illa, mukaan lukien etikkahappo, propionihappo ja butyraatti, on raportoitu olevan edullisia vaikutuksia glukoosin, kolesterolin ja lipidien aineenvaihduntaan. Asetaatti on pääasiallinen SCFA:t paksusuolessa ja tärkeä substraatti kolesterolisynteesille, propionaatti on substraatti glukoneogeneesille maksassa ja butyraatti on koolonosyyttien ensisijainen energiasubstraatti ja sillä on tulehdusta estävä vaikutus suolistossa [22,23].

Tuloksemme osoittivat, että asetaatti oli pääasiallinen ulosteeseen muodostunut SCFA kaikissa ryhmissä, sen jälkeen butyraatti ja propionaatti, kun taas valeraattien ja haarautuneiden SCFA-yhdisteiden (isovoihappo ja isovaleriinihappo) pitoisuus oli pienempi. Asetaatin on osoitettu lisäävän entsyymiaktiivisuutta maksakudoksessa, mikä johtaa parempaan verensokerin hallintaan [24]. 20päivänä (kuva 2) LM-ryhmässä asetaattitaso oli huomattavasti korkeampi (pb 0,05), propionaatin osuus oli taipumus pienentyä ja butyraatin osuus kasvaa, vaikka muutos ulosteessa oli merkityksetön verrattuna kontrolliryhmään.

HM-ryhmässä butyraatin osuus oli kuitenkin merkittävästi pienempi kuin kontrolliryhmässä (pb 0.05). Kokonais-SCFA-pitoisuudet LM:n ja HM:n välillä olivat päinvastaisia ​​verrattuna kontrolliryhmään ja vain LM-ryhmässä oli merkitsevä ero.

Monet tekijät vaikuttavat ulosteen SCFA-tasoon, mukaan lukien suoliston mikrobiston koostumus ja määrä, ravintolähde ja aika, joka kuluu ruoan kulkeutumiseen ruoansulatuskanavan läpi [22]. Kertyvät tutkimukset osoittavat, että polysakkaridien rakenne, mukaan lukien monosakkariditähteiden koostumus, polymeroitumisaste, voivat molemmat vaikuttaa käymisominaisuuksiin ja SCFA:iden tuotantoon [25]. Tuloksistamme voimme päätellä, että cistanche-polysakkaridit moduloivat SCFA:iden tuotantoa ja eri rakennepolysakkarideilla on erilaisia ​​vaikutuksia.

3.4. Cistanche-polysakkaridit aiheuttivat ydinmuutoksia suoliston mikrobiotan koostumuksessa ja monimuotoisuudessa

Ulostenäytteiden (n=4) bakteerikoostumus tutkittiin käyttämällä Illumina high-throughput -sekvensointitekniikkaa. Kirjasto sekvensoitiin Illumina HiSeq2500 -alustalla ja tuotettiin 250 bp:n paritetun pään lukuja. Ne käsiteltiin taksonomista tunnistamista ja monimuotoisuusanalyysiä varten. Harvinaisuuksien käyrät (kuvio 3a) osoittivat, että kunkin näytteen kohdalla bakteerilajirikkaus tasoittui näytteenottosyvyyden kasvaessa, mikä osoitti, että sekvensointiponnistus oli riittävä ja että näytteen kokonaisdiversiteetti saatiin talteen. Shannon-käyrä (kuvio 3b) osoitti, että ainutlaatuisten bakteerilajien määrä kasvoi, kun tunnistettujen sekvenssien määrä kasvoi. Shannon-käyrien kylläisyys tarkoittaa, että sekvensointitiedot riittivät kattamaan kaikki bakteerilajit.

Alfa-diversiteettianalyysiä käytetään näytteen monimuotoisuuden mittaamiseen. Chao1-, ACE-, Shannon- ja Simpson-diversiteettiindeksit laskettiin Tukeyn testillä kuvaamaan alfadiversiteettiä. ACE- ja Chao 1 -indekseihin perustuva monimuotoisuusanalyysi paljasti suoliston mikrobiotan yhteisön rikkauden OTU-tasolla. ACE- ja Chao 1 -indeksit olivat merkittävästi alhaisemmat LM-ryhmän ulostenäytteissä verrattuna kontrolliryhmään (pb 0.05) (kuvat 4a, b), mikä viittaa siihen, että suoliston mikrobiotan lajirikkaus oli vähentynyt. LM-syöttämällä. Shannonin ja Simpsonin indekseihin perustuva monimuotoisuusanalyysi paljasti suoliston mikrobiotan monimuotoisuuden yhteisössä. Shannonin ja Simpsonin monimuotoisuusindekseissä ei tapahtunut selvää muutosta, kun niitä käsiteltiin cistanche-polysakkarideilla verrattuna kontrolliryhmään.

Cistanche-polysakkaridit aiheuttivat suuria muutoksia taksoneissa. Lisäksi neljässä ryhmässä N98 prosenttia OTU:ista liittyi phyla Bacteroidetes-, Firmicutes- ja Proteobacteria-bakteeriin. Vallitsevin suku oli Bacteroidetes, joka vaikutti 55.09 prosenttia, 57,89 prosenttia, 52,72 prosenttia ja 69.{{20}}4 prosenttia ulosteen mikrobiotosta kontrollissa, ZT, HM ja LM-ryhmät, vastaavasti, Firmicutes, joiden osuus oli 41,39 prosenttia, 38.{26}}3 prosenttia, 42,15 prosenttia ja 28,15 prosenttia (kuvat 5a, b). Verrattuna kontrolliryhmään ZT-ryhmän osoitettiin aiheuttavan heikkoja vaikutuksia pääfylan suhteelliseen määrään, paitsi että Actinobacteria-bakteerien alhainen määrä lisääntyi merkittävästi (MetaStat, pb 0,05). HM-ryhmässä proteobakteerit lisääntyivät merkittävästi (pb 0,01). Tämä osoitti, että HM Cistanche -polysakkaridi voisi edistää proteobakteerien rikastumista vaikuttamaan aineiden aineenvaihduntaan rotissa. LM-ryhmässä Bacteroidetesen, joiden päätekijät olivat Prevotellaceae ja Prevotellaceae_UCG-001, runsaus lisääntyi merkittävästi (pb 0,05) ja Firmicutien, mukaan lukien Peptococcaceae, runsaus väheni merkittävästi. (01p)b . Prevotellan ja Bacteroidesin jäseniä kuvattiin aiemmin ravintokuitua hajottaviksi [26], jotka tuottavat aineenvaihdunnan lopputuotteita, kuten sukkinaattia ja asetaattia [27]. Tällaiset löydökset vahvistivat aiemmat tutkimukset, jotka osoittivat, että jotkut Prevotella spp. voivat hajottaa monimutkaisia ​​kasvipolysakkarideja. Aiemmat raportit osoittivat myös, että kaksi hallitsevaa bakteerijakoa, lisääntynyt fyla Firmicutes/Bacteroidetes -suhde liittyy liikalihavuuteen [28]. Ensin mainitun pienempi ja jälkimmäisen suurempi määrä LM-ryhmässä ehdotti, että LM voisi auttaa pudottamaan kiloa.

72 havaitusta perheestä taksonit top1 0 eristettiin ja analysoitiin (kuvat 5c, d). Lachnospiraceae ja Ruminococcaceae ovat kaksi nisäkkäiden suolistossa esiintyvistä runsaimmista perheistä, ja ne on yhdistetty suoliston terveyden ylläpitämiseen [29]. Tässä tutkimuksessa perheet Bacteroidales_S24-7_-ryhmä (39,11 ± 6,04 prosenttia, 36,88 ± 4,44 prosenttia, 28,37 ± 4,01 prosenttia, 35,81 ± 7,91 prosenttia), Prevotellaceae (10,3,5 ± 5,5 prosenttia). Prosenttiosuus, 19,65 ± 8,97 prosenttia, 21,05 ± 8,39 prosenttia), Lachnospiraceae (18,21 ± 5,20 prosenttia, 15,09 ± 3,29 prosenttia, 12,13 ± 7,14 prosenttia, 13,12 ± 6,82 prosenttia) ja Ruminococcaceae (9,64 ± 0,88 prosenttia, 10,44 ± 2,45 prosenttia, 11,27 ± 4,70 prosenttia , 8,19 ± 1,72 prosenttia ) olivat hallitsevia kussakin ryhmässä. S24-7-perheen on raportoitu sisältävän runsaasti hiilihydraatteja hajottavia entsyymejä [30]. Prevotellaceae esitti nousun ja Lachnospiraceae esitti laskevan taipumuksen polysakkaridiryhmässä verrattuna kontrolliryhmään [31]. Oletettiin, että Bacteroidales_S24-7_-ryhmässä ja Lachnospiraceae-lajissa ei ollut vastaavia aktiivisia aktiivisia entsyymejä polysakkarideissa tai bakteerien hiilihydraattia sitovia moduuleja polysakkarideissa. Prevotella-sukujen on raportoitu liittyvän polysakkaridien hyödyntämislokuksiin ja hiilihydraattiaktiivisiin entsyymeihin [32]. Bakteerien ja SCFA:iden välisen suhteen löytämiseksi käytettiin Spearman-korrelaatioanalyysiä. Joillakin suvuilla, kuten Bacteroides, Prevotella ja Lactobacillus suoliston mikrobiotassa, on tärkeä rooli polysakkaridien hydrolysoinnissa SCFA:iksi [33]. Tuloksemme osoittivat myös, että Bacteroidaceae korreloi positiivisesti ja hallitseva mikrobiota tuotti enemmän butyraattia [34], kun taas Prevotellaceae korreloi positiivisesti ja hallitseva mikrobiota tuotti enemmän asetaattia. Lactobacillaceae ja Ruminococcaceae hallitseva mikrobiota tuotti enemmän propionaattia (kuva 6).

Beta-diversiteettianalyysiä käytettiin suoliston mikrobiotan rakenteellisten vaihtelujen tutkimiseen näytteiden välillä käyttämällä UniFrac-etäisyysmittauksia. Erot Unifrac-etäisyyksissä analysoitiin Tukeyn ja Wilcoxin testillä (kuva 7). Käyttämällä uniFrac-painottamatonta analyysiä havaitsimme, että LM-syöttäjähiiret ryhmittyvät pois muista ryhmistä. Näennäinen klusterointikuvio tunnistettiin kontrolli-, ZT-, HM- ja LM-ryhmille.

Näiden mikrobien runsautta moduloitiin eri tavalla polysakkaridikäsittelyillä. Spesifisten bakteeritaksonien tunnistamiseksi kussakin ryhmässä verrattiin kontrolli-, ZT-, HM- ja LM-ryhmien mikrobiotan koostumusta lineaarisen erotteluanalyysin vaikutuskoon (LEfSe) menetelmällä. Lineaarista erotteluanalyysiä (LDA) käytetään laskemaan kunkin vaihtelevasti runsaan ominaisuuden vaikutuskoko. LDA-pisteiden kynnys on korkeampi kuin luettelo 4 oli, mikä osoittaa korkeampaa suhteellista yhteisön runsautta vastaavassa ryhmässä kuin muissa ryhmissä. Tällä menetelmällä havaitsimme, että 19 OTU:ta oli merkitsevästi erilaisia ​​kaikissa ryhmissä, eli 6 OTU:ta kontrolliryhmässä oli korkeampi, vain 1 OTU ZT-ryhmässä oli korkeampi, 10 OTU:ta HM-ryhmässä korkeampi. ja 2 OTUS LM-ryhmässä olivat korkeammat kuin muissa ryhmissä (kuvio 8). g_Prevotellaceae_ UCG_001 LM:ssä lisääntyi merkittävästi (8,47 ± 1,9 prosenttia LM:ssä, 0.40 ± {{21 }}.09 prosenttia vertailuryhmässä, pb 0,01). Tulos oli yhdenmukainen raportin kanssa, jonka mukaan Porphyra haitanensis ja Ulva prolifera polysakkaridit voisivat ilmeisesti edistää Prevotellaceae UGC-001 (pb 0,05) ja Rikenellaceae RC9 (pb 0,01) [35].

4. Johtopäätökset

On selvää, että TCM:n kemiallisten ainesosien, suoliston mikrobiotan ja tiettyjen suoliston mikrobien aiheuttamien metaboliittien välillä on yhteys. Nykyiset löydöksemme tarjosivat menetelmän tutkia ekinakosidiaineenvaihdunnan synergioita erilaisten polysakkaridien kanssa suoliston mikrobiotaan perustuen. Suolen mikrobiota voi metaboloida TCM:ää ja TCM voi vaikuttaa suoliston mikrobiotan kasvuun. Toisaalta, kun polysakkaridit on annettu suun kautta suolistossa, monet suoliston mikrobistot koodaavat metabolisia entsyymejä, joilla on tärkeä rooli polysakkaridien hajoamisessa ja bioaktiivisten metaboliittien tuottamisessa. Toisaalta polysakkaridien osuudella on jonkin verran vaikutusta suoliston mikroympäristön tasapainoon prosessissa. Vertaamalla polysakkaridien kanssa tai ilman polysakkarideja havaitsimme, että vaikka isäntä oli ruoansulatuskanavan suolistossa, polysakkaridit toimivat mahdollisesti prebiootteina, mikä johti suotuisiin muutoksiin suoliston mikrobiotassa edistämällä probioottien kasvua. Cistanche-polysakkaridit säätelevät suoliston mikrobiston monimuotoisuutta, lisäsivät hyödyllisiä bakteereja ja erityisesti pienimolekyyliset polysakkaridit lisäsivät Prevotella spp. Lisäksi parantunut suoliston mikrobiota lisäsi sitten ekinakosidin imeytymistä Cistanche deserticolassa. Mutta syy ei ole täysin selvä, se voi johtua suoliston mikrobiotan, SCFA-yhdisteiden ja immuniteetin yhdistetyistä puutteista, ja lisätutkimus on tarpeen sairauden mallille. Prebioottien vaikutuksia on vaikea todistaa terveillä eläinmalleilla, joiden mikrobioottiyhteisö on vakaa ja kestävä. Cistanche deserticola -polysakkarideja voidaan kehittää probioottisina tuotteina säätelemään suoliston mikrobiota, ja niitä voidaan soveltaa pienten molekyylien synergistiseen aineenvaihduntaan tulevaisuudessa. Nämä tiedot auttavat meitä suunnittelemaan toimia, joilla estetään haavoittuvia ihmisryhmiä parantamasta terveyttään.

Ilmoitus kilpailevasta intressistä

Kirjoittajat vakuuttavat, että tämän artikkelin julkaisemisessa ei ole eturistiriitaa.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittävät Kiinan kansallista luonnontieteiden säätiötä (apurahanumerot 81830112 ja 81904058)

Viitteet
[1] I. Khangwal, P. Shukla, Mahdolliset prebiootit ja niiden leviämismekanismit: viimeaikaiset lähestymistavat, J. Food Drug Anal. 27 (3) (2019) 649–656.
[2] XF Xu, PP Xu, CW Ma, J. Tang, XW Zhang, suoliston mikrobisto, isäntäterveys ja polysakkaridit, Biotechnol. Adv. 31 (2) (2013) 318–337.
[3] NT Porter, EC Martens, Polysakkaridien kriittiset roolit suoliston mikrobiekologiassa ja fysiologiassa, Annu. Rev. Microbiol. 71 (2017) 349–369.
[4] QW Guo, QQ Ma, ZH Xue, XD Gao, HX Chen, tutkimukset kolmen eri molekyylipainon omaavan polysakkaridin sitoutumisominaisuuksista ja maissisilkin flavonoideista (Maydis stigma), Carbohyd. Polym. 198 (2018) 581–588.
[5] SS Zhou, J. Xu, H. Zhu, J. Wu, JD Xu, R. Yan, XY Li, HH Liu, SM Duan, Z. Wang, HB Chen, H. Shen, SL Li, suolen mikrobisto - osallistui mekanismeihin, jotka lisäävät systeemistä ginsenosideille altistumista ginseng-keittimessä olevien polysakkarideilla, Sci. Rep. 6 (2016), 22474.
[6] YP Jing, AP Li, ZR Liu, PR Yang, JS Wei, XJ Chen, T. Zhao, YR Bai, LJ Zha, CJ Zhang, Codonopsis pilosula -saponiinien imeytyminen samanaikaisesti esiintyvien polysakkaridejen avulla lievittää suoliston mikrobien dysbioosia natriumdekstraanilla -indusoitu paksusuolitulehdus mallihiirillä, Biomed. Res. Int. 2018 (2018), 1781036 (18 sivua).
[7] CJ Chang, CS Lin, CC Lu, J. Martel, YF Ko, DM Ojcius, SF Tseng, TR Wu, YYM
Chen, JD Young, HC Lai, Ganoderma Lucidum vähentää liikalihavuutta hiirillä moduloimalla suoliston mikrobiston koostumusta, Nat. Commun. 6 (2015) 7489.
[8] JC Zhang, GM Yang, YZ Wen, SX Liu, CF Li, RL Yang, W. Li, Suoliston mikrobiota osallistuvat longaanipolysakkaridin, Mol. Nutr. Food Res. 61 (11) (2017), 1700466.
[9] T. Wang, XY Zhang, WY Xie, Cistanche deserticola YC Ma, "Desert Ginseng": arvostelu, Am. J. Chin. Med. 40 (6) (2012) 1123–1141.
[10] Y. Li, GS Zhou, SH Xing, PF Tu, XB Li, Ihmisen suolistobakteerien tuottamien ekinakosidi-metaboliittien tunnistaminen ultraperformance-nesteellä
kromatografia-kvadrupoli lentoaikamassaspektrometria, J. Agr. Food Chem. 63 (30) (2015) 6764–6771.
[11] Y. Li, Y. Peng, MY Wang, PF Tu, XB Li, Cistanches Herba vesiuutteen ihmisen maha-suolikanavan metabolia in vitro: aineenvaihduntaprofiilin selvitys, joka perustuu kattavaan aineenvaihduntatuotteiden tunnistamiseen mahanesteessä, suolistomehussa, ihmisen suolistossa bakteerit ja suoliston mikrosomi, J. Agric. Food Chem. 65 (34)
(2017) 7447–7456.
[12] M. Dubois, K. Gilles, JK Hamilton, PA Rebers, F. Smith, Kolorimetrinen menetelmä sokereiden ja vastaavien aineiden määrittämiseksi, Anal. Chem. 168 (4265) (1956) 167.
[13] NH Cho, SY Seong, KH Chun, YH Kim, IC Kwon, BY Ahn, SY Jeong, Uusi limakalvon immunisointi polysakkaridi-proteiinikonjugaateilla, jotka on vangittu alginaattimikropalloihin, J. Control. Julkaisu 53 (1–3) (1998) 215–224.
[14] XY Zhao, ZZ Jiang, F. Yang, Y. Wang, XM Gao, YF Wang, X. Chai, GX Pan, Y. Zhu, Herkkä ja yksinkertaistettu antibioottien vaikutuksen havaitseminen ulosteen lyhyiden dynaamisissa ja monipuolisissa muutoksissa -ketjuiset rasvahapot, PLoS One 11 (12) (2016), e167032.
[15] SJ Li, QP Xiong, XP Lai, X. Li, MJ Wan, JN Zhang, YJ Yan, M. Cao, L. Lu, JM Guan, DY Zhang, Y. Lin, Polysakkaridien molekyylimuunnos ja niistä johtuvat bioaktiivisuudet , Compr. Rev. Food. Sci. F. 15 (2) (2016) 237–250.
[16] ZF Fu, X. Fan, XY Wang, XM Gao, Cistanches Herba: katsaus sen kemiaan, farmakologiaan ja farmakokinetiikkaan, J. Ethnopharmacol. 219 (2018) 233–247.
[17] W. Zhou, XB Tan, JJ Shan, T. Liu, BC Cai, LQ Di, Kito-oligosakkaridien vaikutus
Fructus Forsythia -uutteen fenyylietanoidiglykosidien imeytyminen suolistosta, Phytomedicine 21 (12) (2014) 1549–1558.
[18] LL Sun, M. Wang, HJ Zhang, GJ You, YN Liu, XL Ren, YR Deng, Ophiopogon japonicuksen polysakkaridien vaikutus 2,3,5,4′-tetrahydroksi-stilbeeniin-2- Z. Fu et ai. / International Journal of Biological Macromolecules 149 (2020) 732–740 739 O- -d-glukosidi biofarmaseuttisista ominaisuuksista in vitro ja farmakokinetiikasta in vivo, Int. J. Biol. Macromol. 119 (2018) 677–682.
[19] KN Lam, M. Alexander, PJ Turnbaugh, Tarkkuuslääketiede menee mikroskooppisesti: mikrobiomin suunnittelu parantamaan lääketuloksia, Cell Host Microbe 26 (1) (2019), 22–34.
[20] I. Khangwal, P. Shukla, Probioottien etsiminen, innovatiiviset arviointimenetelmät ja niiden terveyssovellukset: katsaus, 3 Biotech. 9 (5) (2019) 187.
[21] GR Gibson, R. Hutkins, ME Sanders, SL Prescott, RA Reimer, SJ Salminen, K. Scott, C. Stanton, KS Swanson, PD Cani, K. Verbeke, G. Reid, Kansainvälinen probioottien tieteellinen yhdistys ja prebioottien (ISAPP) konsensuslausunto prebioottien määritelmästä ja laajuudesta, Nat. Pastori Gastro. Hepat. 14 (8) (2017) 491–502.
[22] JMW Wong, R. de Souza, CWC Kendall, A. Emam, DJA Jenkins, Colonic health: fermentation and short-chain fatty acids, J. Clin. Gastroenteroli. 40 (3) (2006) 235–243.
[23] SI Cook, JH Sellin, Katsausartikkeli: lyhytketjuiset rasvahapot terveydessä ja sairauksissa, Aliment. Pharm. Siellä. 12 (6) (1998) 499–507.
[24] H. Yamashita, K. Fujisawa, E. Ito, S. Idei, N. Kawaguchi, M. Kimoto, M. Hinamori, H. Tsuji, Lihavuuden ja glukoosin sietokyvyn parantaminen asetaatilla tyypin 2 diabeetikoissa Otsuka Long- Evans Tokushima Fatty (OLETF) -rotat, Biosci. Biotechnol. Biochem. 71 (5) (2007) 1236–1243.
[25] AL Ho, O. Kosik, A. Lovegrove, D. Charalampopoulos, RA Rastall, Ksylo-oligosakkaridien ja eri molekyylipainoisten ksylopolysakkaridifraktioiden in vitro fermentoitavuus ihmisen ulostebakteerien toimesta, Carbohyd. Polym. 179 (2018) 50–58.
[26] TT Chen, WM Long, CH Zhang, S. Liu, LP Zhao, BR Hamaker, Kuidun käyttökapasiteetti vaihtelee Prevotella- versus Bacteroides-dominated suoliston mikrobiot, Sci. Rep. 7 (1) (2017) 2594.
[27] M. Sakamoto, M. Ohkuma, Bacteroides sartorii on Bacteroides chinchillan aikaisempi heterotyyppinen synonyymi ja sillä on etusija, Int. J. Syst. Evol. Mikr. 62 (6) (2012) 1241–1244.
[28] PJ Turnbaugh, RE Ley, MA Mahowald, V. Magrini, ER Mardis, JI Gordon, Liikalihavuuteen liittyvä suoliston mikrobiomi, jolla on lisääntynyt kapasiteetti energian talteenottoon, Nature 444 (7122) (2006) 1027–1131.
[29] LF Gomez-Arango, HL Barrett, HD McIntyre, LK Callaway, M. Morrison, NM Dekker, Suoliston mikrobiomin ja metabolisten hormonien väliset yhteydet raskauden alkuvaiheessa ylipainoisilla ja lihavilla naisilla, Diabetes 65 (8) (2016) 2214 –2223.
[30] KL Ormerod, DL Wood, N. Lachner, SL Gellatly, JN Daly, JD Parsons, CG Dal Molin, RW Palfreyman, LK Nielsen, MA Cooper, M. Morrison, PM Hansbro, P. Hugenholtz, Genomic characterization of the viljelemätön Bacteroidales-perhe S24-7, joka asuu homeotermisten eläinten suolistossa, Microbiome. 4 (1) (2016) 36.
[31] JD Zhang, LJ Song, YJ Wang, C. Liu, L. Zhang, SW Zhu, SJ Liu, LP Duan, Butyraattia tuottavien Lachnospiraceae:n hyödyllinen vaikutus stressin aiheuttamaan viskeraaliseen yliherkkyyteen rotilla, J. Gastro. Hepatol. 34 (8) (2019) 1368–1376.
[32] T. Accetto, G. Avguštin, Pötsin ja takasuolen monimuotoiset ja laajat kasvipolysakkaridien hajoamislaitteet. Prevotella-lajit: tekijä niiden yleisyydessä? Syst. Appl. Microbiol. 42 (2) (2019) 107–116.
[33] KE Bach Knudsen, MS Hedemann, HN Lærke, Hiilihydraattien rooli sikojen suoliston terveydessä, Anim. Syötä. Sci. Tech. 173 (1–2) (2012) 41–53.
[34] SA Parker, A. Geirnaert, L. Berchtold, A. Greppi, L. Krych, RE Steinert, T. de Wouters, C. Lacroix, Eri ravintokuitujen prebioottisen potentiaalin ymmärtäminen in vitro jatkuvan aikuisen käymismallin avulla (PolyFermS), Sci. Rep. 8 (1) (2018) 4318.
[35] ZS Zhang, XM Wang, SW Han, CD Liu, F. Liu, Kahden merilevän polysakkaridin vaikutus suoliston mikrobiotaan hiirissä arvioituna Illumina PE250 -sekvensoinnilla, Int. J. Biol. Macromol. 112 (2018) 796–802.