Abstrakti

Tavoite:Cistanche-pohjainen hypoglykeemis-lipidi-säätelykaava (HLF) on osoittanut merkittävää tehoa glukoosi- ja lipidiaineenvaihdunnan häiriöiden parantamisessa. Sen erityiset toimintamekanismit ovat kuitenkin epäselviä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia HLF:n mahdollisia kohteita ja mekanismeja glukolipidiaineenvaihduntahäiriöiden parantamisessa verkkofarmakologian, molekyylitelakoinnin, molekyylidynamiikan (MD) simulaatioiden ja kokeellisen validoinnin avulla.

Menetelmät:
Glukolipidiaineenvaihduntahäiriöihin liittyvät kohteet haettiin GeneCards-tietokannasta. HLF:n tärkeimpien aktiivisten komponenttien toimintakohteet saatiin CTD- ja SwissTargetPrediction-tietokannoista. STRING-tietokantaa ja Cytoscape-ohjelmistoa käytettiin proteiini-proteiini-vuorovaikutusverkkojen (PPI) rakentamiseen. Mahdollisten avainkohteiden tunnistamisen jälkeen geeniontologian (GO) ja Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) -rikastusanalyysit suoritettiin Metascape-tietokannan kautta ja "yhdiste-kohde-polku" -verkko rakennettiin. Molekylaarinen telakointi suoritettiin AutoDockin ja PyMOLin avulla pääkomponenttien ja ydinkohteiden välisten vuorovaikutusten tarkistamiseksi. MD-simulaatiot suoritettiin sitten parhaille telakoinnin perusteella tunnistetuille proteiini-ligandikomplekseille. Glukolipidiaineenvaihduntahäiriön hiirimalli perustettiinin vivoverkoston farmakologisten löydösten validointi.

Tulokset:
PPI-verkon topologinen analyysi tunnisti 10 ydinkohdetta: TNF, CTNNB1, AKT1, NF-κB1, ESR1, FN1, TP53, IL-1, IL-6 ja EGFR. GO-rikastus osoitti, että nämä kohteet osallistuivat pääasiassa signaalinsiirtoon ja transkription säätelyyn. KEGG-reittianalyysi paljasti merkittävän yhteyden lipidi- ja ateroskleroosireitteihin. Molekyylitelakka vahvisti suotuisat sitoutumisaffiniteetit HLF:n ydinkomponenttien (esim. lovastatiini, koptisiini, salvianolihappo B) ja kohteiden, kuten AKT1, FN1 ja IL-6, välillä. MD-simulaatiot osoittivat edelleen stabiileja vuorovaikutuksia, erityisesti AKT1:n ja yhdisteiden, kuten lovastatiinin, koptisiinin ja salvianolihappo B:n välillä. Eläinkokeet osoittivat, että HLF:llä voi olla terapeuttisia vaikutuksia alentamalla AKT1:n, TP53:n, FN1:n ja EGFR:n ilmentymistä ja tukahduttamalla tulehdustekijöitä, kuten IL-1NNCT}, ja {{4R1R1:tä ja {{. Nämä muutokset johtivat verensokeri- ja lipiditasojen paranemiseen mallihiirissä.

Johtopäätös:
HLF voi säädellä glukoosi- ja lipidiaineenvaihduntaa ja parantaa ateroskleroottisia vaurioita kohdistamalla lipideihin ja ateroskleroosiin liittyviin reitteihin. Se tarjoaa kattavan terapeuttisen strategian aineenvaihduntahäiriöiden ja niihin liittyvien komplikaatioiden ehkäisyyn ja hoitoon.

Avainsanat:
Cistanche-pohjainen kaava; Glukolipidiaineenvaihduntahäiriö; Verkko-farmakologia; Molekyylinen telakointi; Molekyylidynamiikan simulointi;Lipidi- ja ateroskleroosireitti

 

 

 

cistanche-uutteen akteosidiainesosa glukolipidiaineenvaihduntahäiriöiden hoitoon

Ota meihin yhteyttä saadaksesi lisätietoja cistanchen eduista

Ota yhteyttä nyt

 

 

 

1. Johdanto

Glukolipidiaineenvaihduntahäiriöistä on tullut merkittävä kansanterveysongelma maailmanlaajuisesti. Vuonna 2021 diabeteksen maailmanlaajuinen esiintyvyys oli noin 529 miljoonaa, ja ennusteiden mukaan yli 1,31 miljardia tapausta vuoteen 2050 mennessä. Kiinassa viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että diabeteksen esiintyvyys oli 12,4 % vuonna 2018, kun se vuonna 2013 oli 10,9 %. Dyslipidemia lisää merkittävästi sydän- ja verisuonisairauksien riskiä. kuolleisuus ja vammaisuus.

Epidemiologiset tutkimukset 20 korkea-asteen sairaalasta Kiinassa osoittavat, että 67,1 %:lla tyypin 2 diabetespotilaista (T2DM) on dyslipidemia. Tutkimus CCMR-3B raportoi, että 72 prosentilla T2DM-potilaista oli myös dyslipidemiaa ja/tai verenpainetautia, mikä kaksinkertaisti heidän riskinsä saada makro- ja mikrovaskulaarisia komplikaatioita verrattuna potilaisiin, joilla oli pelkkä diabetes.

Glukolipidiaineenvaihduntahäiriöiden monimutkaisen patogeneesin ja kattavan aineenvaihdunnan hallinnan alhaisen nopeuden vuoksi tehokkaat hoidot ovat rajallisia. Cistanche-pohjainen hypoglykeemis-lipidi-säätelykaava (HLF), joka on kehitetty "liman sameus" -teorian mukaisesti, pyrkii poistamaan lämpöä, poistamaan sameutta ja palauttamaan tasapainon. Koostuu kahdeksasta yrtistä, mukaan lukienCistanche, Momordica charantia, Aloe vera, Scutellaria baicalensis, Schisandra chinensis, Zingiber officinale, Salvia miltiorrhiza, jaAtractylodes macrocephalaHLF kohdistuu aineenvaihduntahäiriöiden ydinmekanismeihin.

Sormenjälkianalyysi HPLC:llä tunnisti tärkeimmät yhdisteet:mangiferiini, koptisiini, jatrorritsiini, salvianolihappo B, aloiiini, berberiini, palmatiini,jalovastatiini. Aiemmat tutkimukset vahvistivat HLF:n tehokkuuden alentamaan glukoosi- ja lipiditasoja, vähentämään kardiovaskulaarista riskiä ja parantamaan insuliiniresistenssiä. Monikeskustutkimuksessa, satunnaistetussa, avoimessa kliinisessä tutkimuksessa, johon osallistui 450 liikalihavuuteen liittyvää T2DM- ja dyslipidemiaa sairastavaa potilasta, havaittiin, että HLF alensi tehokkaasti verensokeria, sääteli lipidejä, alensi ruumiinpainoa ja paransi insuliiniherkkyyttä.

Lisätutkimukset ehdottivat, että HLF voi moduloida suoliston mikrobiota (esim.Fecalibacterium, Blautia) ja vaikuttavat aineenvaihduntareitteihin, kuten rasvahappojen hajoamiseen ja glykolyysiin/glukoneogeneesiin. Huolimatta sen todistetusta kliinisestä tehokkuudesta, tarkat mekanismit ovat edelleen epäselviä, mikä rajoittaa laajempaa käyttöä.

Verkkofarmakologia tarjoaa järjestelmätason lähestymistavan sairauksien mekanismien ja lääkevaikutusten selvittämiseen yhdistämällä bioinformatiikan ja tehokkaan seulonnan. Tässä tutkimuksessa hyödynnetään verkkofarmakologiaa, molekyylitelakointia, molekyylidynamiikkaa ja eläinkokeita paljastaakseen HLF:n monikohdemekanismit glukolipidiaineenvaihduntahäiriöiden hoidossa.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1 Instrumentit

D3024R Nopea jäähdytetty sentrifugi (SCILOGEX)

Y300C-elektroforeesilaite ja JY300C-elektroforeesisäiliö (Junyi Oriental, Peking)

ChampGel 5000 -kuvausjärjestelmä (Saizhi Innovation, Peking)

SMA-1000 spektrofotometri (Meilin Hengtong, Peking)

StepOne Plus qRT-PCR-järjestelmä (ABI)

PowerPac-yleiselektroforeesiyksikkö (Bio-Rad)

PB-10 pH-mittari (Sartorius)

Tanon 5200 kemiluminesenssianalysaattori (Tanon, Shanghai)

2.2 Kasviperäiset lääkkeet

HLF-kaava sisältää:

Cistanche (Cistanches Herba)

Momordica charantia

Scutellaria baicalensis

Aloe vera

Schisandra chinensis

Zingiber officinale

Salvia miltiorrhiza

Atractylodes macrocephala
Kaikki yrtit olivat rakeisia kaavauutteita (Tianjiang Pharmaceutical, Jiangyin).

Kontrollilääke:Metformiinihydrokloriditabletit (0,5 g per tabletti, Bristol-Myers Squibb, Shanghai).

2.3 Reagenssit ja vasta-aineet

TRIzol-reagenssi (Invitrogen)

HiFiScript cDNA Synthesis Kit (CW2569)

UltraSYBR-sekoitus (High ROX, CW2602)

BCA Protein Assay Kit

Primääriset vasta-aineet, jotka kohdistuvat p-AKT:hen, p-NF-κB p65, AKT, NF-κB p65, FN1, p53, IL-1, IL-6, EGFR, TNF-, -kateniini, ESR1, -aktiini

Sekundaariset vasta-aineet (HRP-konjugoitu vuohen anti-kani/hiiri IgG)

2.4 Eläinmallit

Urospuoliset C57BL/6J-hiiret (7 viikkoa vanhoja) ostettiin ja pidettiin normaaleissa SPF-olosuhteissa. Kaikki eläintoimenpiteet hyväksyttiin Guang'anmenin sairaalan eettisen komitean toimesta (hyväksyntänumero IACUC-GAMH-2019-002).

2.5 Tavoitteen ennuste

HLF:n aktiivisia yhdisteitä tiedusteltiinCTDjaSwissTargetPrediction(todennäköisyys > 0,1). T2DM:n ja dyslipidemian sairauteen liittyvät kohteet haettiin osoitteestaGeneCards(relevanssipisteet > 1). Venn-kaaviot tunnistivat päällekkäiset kohteet PPI-analyysiä varten.

2.6 PPI-verkon rakentaminen

Päällekkäisiä tavoitteita syötettiinSTRING(https://www.string-db.org), keskitasolla (pisteet Suurempi tai yhtä suuri kuin 0,4). Verkko visualisoitiin ja analysoitiinCytoscape, ja ydintavoitteet, jotka tunnistetaan astekeskeisyyden perusteella.

2.7 GO ja KEGG Enrichment

Tärkeimmät tavoitteet lähetettiinMetascapeGO (BP, MF, CC) ja KEGG-reittianalyysille (P < 0,01). Visualisointi tehtiin käyttämällä kuplakaavioita.

2.8 Yhdistelmäkohde-polkuverkosto

Cytoscapea käytettiin yrttejä, yhdisteitä, kohteita ja reittejä yhdistävän verkoston rakentamiseen, joka havainnollistaa usean kohteen ja usean reitin välisiä vuorovaikutuksia.

2.9 Molekyylitelakka

Yhdisteiden 2D-rakenteet saatiinPubChem, muunnetaan ATE:ksi käyttäen. Proteiinirakenteet ladattiin osoitteesta, valmistettu vuonnaAutoDockTools, ja telakoitu käyttäenSailVina. Sitoutumisaffiniteetti Vähemmän tai yhtä suuri kuin -4,25 kcal/mol pidettiin merkittävänä. Telakointitulokset visualisoitiin käyttämälläPyMOL.

2.10 Molekyylidynamiikan simulointi

MD-simulaatiot suoritettiin käyttämälläAmber18valituille huippukomplekseille. Proteiini: meripihka14SB; ligandi: gaff; vesi: OPC-malli. RMSD ja RMSF laskettiin 20 ns NPT-simulaatioista.

2.11 Eläinten ryhmittely ja interventio

Hiiret satunnaistettiin 4 ryhmään: normaali (N), malli (M), metformiini (MET) ja HLF. Ryhmää N lukuun ottamatta kaikille hiirille annettiin runsaasti rasvaa sisältävää ruokavaliota (HFD) 6 viikon ajan. HLF:ää annettiin 14 g/kg (raakayrttiekvivalentti), MET:ää 250 mg/kg. 8 viikon toimenpiteen jälkeen veri- ja maksakudokset kerättiin analysointia varten.

2,12 qRT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä TRIzolia. cDNA syntetisoitiin HiFiScriptillä. qPCR suoritettiin käyttämällä UltraSYBR:ää ja StepOne Plusia. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin 2^-ΔΔCt:n avulla.

2.13 Western Blot

Proteiinit uutettiin maksakudoksesta, kvantitoitiin, erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille. Eston ja primääristen ja sekundaaristen vasta-aineiden kanssa inkuboinnin jälkeen signaalit visualisoitiin ECL:llä ja kvantitoitiin käyttämällä ImageJ. --aktiinia, jota käytettiin normalisointiin.

2.14 Tilastollinen analyysi

Tiedot analysoitiin käyttämälläSPSS 23.0jaGraphPad Prism 10.1.2. Käytettiin yksisuuntaisia ​​ANOVA- ja t-testejä, jolloin P < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitseväksi.