Abstrakti

Esillä oleva keksintö ilmaisee aCistanche-uute parantaa luun mineraalitiheyttä (BMD). Otteessa,ekinakosidin ja akteosidin (verbaskosidin) kokonaispitoisuuson>25 painoprosenttia. Uute valmistetaan suorittamallatislatun veden uutto/raakajauheCistanche tubulosa, jota seuraasuodatus, sentrifugointisuodoksesta,keskittyminen, neste-neste-uutto, konsentraatio epäpuhtauksien poistamisella, laimennus, jälkihoito, ja sittenlopullinen väkevöinti ja kuivausCistanche-uutteen saamiseksi.

 

 

Cistanche-uuttoprosessi

Keksinnön mukaisessa Cistanche-uutteessa luun mineraalitiheyden parantamiseksiekinakosidin ja akteosidin kokonaispitoisuuson25–30 painoprosenttia(pois lukien 25 paino-%), ja uute sisältää myös runsaastishikimiinihapposamoin kuinfenyylipropionihappotyyppiset komponentitjaalkaloidityyppiset komponentit, mikä mahdollistaa senvakaasti luun tiheyttä parantava vaikutus.

 

Väitteet

1. Valmistusmenetelmä

1. Menetelmä Cistanche-uutteen valmistamiseksi luun mineraalitiheyden parantamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet:

murskaamallaCistanche tubulosaraakajauheen saamiseksiCistanche tubulosa;

lisäämällä tislattua vettä raakajauheeseenCistanche tubulosauuttamista, suodatusta, suodoksen sentrifugointia ja väkevöintiä varten väkevän liuoksen saamiseksiCistanche tubulosa;

uutetaan väkevöity liuosCistanche tubulosaväkevöimällä alempi uuttofaasi epäpuhtauksien poistamiseksi ja laimentamalla latausliuoksen saamiseksi;

latausliuoksen jälkikäsittely, jota seuraa väkevöinti ja kuivaus Cistanche-uutteen saamiseksi.

2. Materiaalin suhde veteen

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa raakajauheen massa-tilavuussuhdeCistanche tubulosatislattuun veteen on1 : (15–25).

3. Poistolämpötila

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa tislatun veden uuttolämpötila on60-100 astetta.

4. Neste-neste-uuton suhde

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa väkevöidyn liuoksen uuttamisen aikana väkevöidyn liuoksen tilavuussuhdeCistanche tubulosauuttoliuottimeen on1 : (1–5).

5. Uuttoliuotin

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, jossa uuttoliuotin käsittää ainakin yhden seuraavistapetrolieetteri, etyyliasetaatti, n-heksaani tai sykloheksaani.

6. Jälkihoitoprosessi

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, jossa latausliuoksen jälkikäsittely käsittää: lastausliuoksen ohjaamisenmakrohuokoinen hartsija eluoidaan sitten peräkkäin kanssatislattua vettäja anetanoliliuos.

7. Eluutiomäärät

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, jossa tislatun veden tilavuussuhde makrohuokoiseen hartsiin on(5–10) : 1, ja etanoliliuoksen tilavuussuhde makrohuokoiseen hartsiin on(3–9) : 1.

8. Ote

8. Cistanche-uute luun mineraalitiheyden parantamiseksi, tunnettu siitä, että se on valmistettu jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukaisesti.

9. Aktiivinen merkintäsisältö

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen Cistanche-uute, jossa ekinakosidin ja akteosidin kokonaispitoisuus on25–30 painoprosenttia, ilman 25 painoprosenttia.

10. Sovellus

10. Jonkin patenttivaatimuksen 8-9 mukaisen Cistanche-uutteen käyttö luun mineraalitiheyden parantamiseen tarkoitetun tuotteen valmistuksessa, jolloin Cistanche-uutteen pitoisuus tuotteessa on12,5-25 ug/ml.

 

Tekninen ala

[0001] Esillä oleva keksintö liittyy alaanlääketieteelliset formulaatiot, ja liittyy erityisesti aCistanche-uute parantaa luun mineraalitiheyttä, senvalmistusmenetelmä, jasovelluksia.

Tausta

Cistanche tarkoittaa Orobanchaceae-kasvien kuivattua mehevää vartta, jossa on suomulehtiäCistanche deserticola YC MataiCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanchella on useita aktiviteetteja, kutenimmuunijärjestelmän säätely, tulehdusta ehkäisevä, väsymystä vastaan, antioksidantti, hermoja suojaava, jalisääntymisjärjestelmän tuki.

Fenyylietanoidiglykosidit (PhGs) - kanssaekinakosidijaakteosidi (verbaskosidi)tärkeimmät PhG:t Cistanchessa - ovat tärkeitä ainesosia.Ekinakosidion osoitettu vaikuttavanparantaa luun mineraalitiheyttä. Huomasimme kuitenkin, että Cistanche-uutteiden luun tiheyttä parantava vaikutus onei korreloi pelkästään ekinakosidipitoisuuden kanssa. Yksinkertaisesti säätelee ekinakosidipitoisuuttaei voi taataettä ote tuleevakaastijoilla on luutiheyttä parantava vaikutus. Siksi on ratkaisevan tärkeää kehittää Cistanche-uute ja valmistusmenetelmä, joka pystyyvakaastituottaa halutun luutiheyttä tukevan vaikutuksen.

[0003] Kiinalainen keksintöpatenttihakemusCN102441040Aesittää valmistusmenetelmän Cistanchesta peräisin olevien fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärälle jauhamisen, uuton, makrohuokoisen hartsin adsorption, eluoinnin, konsentroimisen jne. avulla. Heikosti happamissa olosuhteissa (pH 2-4) Cistanchen fenyylietanoliglykosidien stabiilisuus paranee merkittävästi, ja tuloksena saadut kokonaismääräiset aktekinosidit sisältävät 0 % ja osuus >9 %. Se ei kuitenkaan tarkista, voiko tuotevakaastiparantaa luun mineraalitiheyttä.

Kiinalaisen keksinnön patenttihakemusCN105111255Aesittää menetelmän ekinakosidin ja akteosidin uuttamiseksi ja erottamiseksi Cistanchesta, jossa käytetään 75 % etanolia uuttoliuottimena, AB-8 makrohuokoista hartsia pakkausmateriaalina ja 55 % etanolieluointia, jolloin saadaan Cistanche-uute, jossa ekinakosidi > 25 %, akteosidi > 8 % ja phG10 % ja 8 %. Se ei kuitenkaan välttämättä takaa avakaaluutiheyttä parantava vaikutus.

 

Yhteenveto keksinnöstä

[0004] Kehittää Cistanche-uute ja valmistusmenetelmä, joka voivakaastitukea parannettua luun mineraalitiheyttä, keksintö tarjoaa:

Ensimmäinen näkökohta: Valmistusmenetelmä

1. Cistanche-uutteen valmistusmenetelmä luun mineraalitiheyden parantamiseksi, joka menetelmä käsittää:

murskaamallaCistanche tubulosaraakajauheen saamiseksi;

uutetaan raakajauhe tislatulla vedellä, suodatetaan, sentrifugoidaan ja väkevöidään väkevän liuoksen saamiseksi;

louhinnan suorittaminen; alemman faasin konsentroiminen epäpuhtauksien poistamiseksi; laimennetaan latausliuoksen saamiseksi;

latausliuoksen jälkikäsittely, väkevöinti ja kuivaus Cistanche-uutteen saamiseksi.

[0005] Eräässä suoritusmuodossa raakajauhe johdetaan a40 meshseula.

Eräässä suoritusmuodossa raakajauheen massa-tilavuussuhde tislattuun veteen on1 : (15–25).

[0007] Eräässä suoritusmuodossa massa-tilavuussuhde on1 : 20.

[0008] Eräässä suoritusmuodossa uuttolämpötila on60-100 astetta.

[0009] Eräässä suoritusmuodossa uuttolämpötila on80 astetta.

[0010] Eräässä suoritusmuodossa uutto suoritetaan1-2 kertaa, 1 tunti joka kerta.

[0011] Eräässä suoritusmuodossa suodatus suoritetaan suodattimen läpi80 meshsuodattaa.

[0012] Eräässä suoritusmuodossa sentrifugointinopeus on3000-4000 r/minja aika on3-9 min.

[0013] Eräässä suoritusmuodossa sentrifugointinopeus on3500 r/minja aika on5 min.

[0014] Eräässä suoritusmuodossa suodos konsentroidaan sentrifugoinnin jälkeen lämpötilassa70 astettato18%–28%alkuperäisestä tilavuudesta.

[0015] Eräässä suoritusmuodossa väkevöidyn liuoksen uuttamisen aikana väkevöidyn liuoksen tilavuussuhde uuttoliuottimeen on1 : (1–5).

[0016] Eräässä suoritusmuodossa suhde on1 : 3.

[0017] Eräässä suoritusmuodossa uuttoliuotin käsittää ainakin yhden seuraavistapetrolieetteri, etyyliasetaatti, n-heksaani tai sykloheksaani.

[0018] Eräässä suoritusmuodossa uuttaminen suoritetaan peräkkäin käyttämälläpetrolieetteriseuraaetyyliasetaatti.

Eräässä suoritusmuodossa "väkevöinti epäpuhtauksien poistamisella" tarkoittaa alemman uuttofaasin väkevöimistä tahnaksi ja sen liuottamista300 ml 50-painoprosenttista vesipitoista etanoliaepäpuhtauksien poistamiseen ja säätämiseen1,0–1,5 g raakayrttiä/mllatausratkaisuna.

Yhdessä suoritusmuodossa latausliuoksen pitoisuus on1,0-1,5 g raakayrttiä/ml vettä.

[0021] Eräässä suoritusmuodossa jälkikäsittely käsittää täyttöliuoksen johtamisenmakrohuokoinen hartsija eluoidaan sitten peräkkäin kanssatislattua vettäja anetanoliliuos.

Eräässä suoritusmuodossa kuormitusvirtaus makrohuokoisen hartsin läpi on1-5 ml/min.

[0023] Eräässä suoritusmuodossa hartsi onAB-8 makrohuokoinen hartsihartsitilavuudella0.93 L.

[0024] Eräässä suoritusmuodossa tislatun veden tilavuussuhde hartsiin on(5–10) : 1, ja etanoliliuoksen tilavuussuhde hartsiin on(3–9) : 1.

[0025] Eräässä suoritusmuodossa tislatun veden tilavuussuhde hartsiin on7 : 1, ja etanoliliuoksen suhde hartsiin on6 : 1.

Eräässä suoritusmuodossa etanoliliuos on80 % (w/w) vesipitoista etanolia.

Toinen näkökohta: Ote

Keksintö tarjoaa lisäksi Cistanche-uutteen, joka on valmistettu edellä esitetyllä menetelmällä.

Eräässä suoritusmuodossa ekinakosidin ja akteosidin kokonaispitoisuus on25–30 painoprosenttia, pois lukien 25 paino-%.

Kolmas näkökohta: Käytä

Keksintö tarjoaa lisäksi käyttöön Cistanche-uutteen käytön luun mineraalitiheyden parantamiseksi tarkoitettujen tuotteiden valmistuksessa, jolloin tuotteen uutepitoisuus on12,5-25 ug/ml.

 

Edut / Hyödylliset vaikutukset

Keksinnöllä on tunnettuun tekniikkaan verrattuna seuraavat edulliset vaikutukset:

Cistanche-uute sisältää25–30 painoprosenttiayhteensä ekinakosidia ja akteosidia, ja se on runsaastishikimiinihappo, fenyylipropionihappotyyppiset komponentit, alkaloidit, jarasvahapot, mikä mahdollistaa senvakaastitukee luun mineraalitiheyden paranemista.

Sisällä12,5-25 ug/mlpitoisuusalueella, uute edistää lisääntymistäMC3T3-E1soluja, joilla on erinomaiset proliferatiiviset vaikutukset.

Uute osoittaa samaa annokseen liittyvää suuntausta solujen lisääntymisen edistämisessä jaALP-toimintaja voi vakaasti edistää lisääntymistä ja erilaistumista. Osteoblastien mineralisaation edistämisessä sillä on parempi vaikutus kuin positiivisella kontrollilla17 -estradioli.

Uute stimuloi osteoblastispesifisiä transkriptiotekijöitäRunx2jaOsx, tehostaa osteoblastien erilaistumista ja edistää osteogeenisten markkerien ilmentymistäOPNjaOCNedistäen siten luun muodostumista. Se myös lisääntyyBmp2 mRNAilmentyminen osteoblastien erilaistumisen ja uuden luun muodostumisen tehostamiseksi aktivoimallaBMP/Smad-reitti; lisäksi säätelemälläLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, jaWnt3 mRNA, se aktivoituuWnt/ -catenin signalointi, vaikuttaa alavirran transkriptiotekijän ilmentymiseen ja edistää osteoblastien erilaistumista ja luun muodostumista.

Valmistusmenetelmällä saadaan uute, joka sisältää fenyylietanoidiglykosideja (ekinakosidi ja akteosidi), sikimihappoa ja fenyylipropionihappoja, alkaloideja ja rasvahappoja. Nämä komponentit yhdessä mahdollistavat uutteen jatkuvan annosriippuvuuden proliferaatiossa, erilaistumisessa ja mineralisaatiossa, mikä mahdollistaa vakaat luun tiheyttä tukevat vaikutukset.

 

Piirustusten lyhyt kuvaus

[0035] Kuva. 1: Uutteen (esimerkki 1) vaikutus MC3T3-E1-solujen lisääntymiseen
Kuva. 2: Uutteen (esimerkki 2) vaikutus MC3T3-E1-solujen lisääntymiseen
Kuva. 3: Uutteen (esimerkki 3) vaikutus MC3T3-E1-solujen lisääntymiseen
Kuva. 4: Uutteen (esimerkki 1) vaikutus ALP-aktiivisuuteen
Kuva. 5: Uutteen (esimerkki 2) vaikutus ALP-aktiivisuuteen
Kuva. 6: Uutteen (esimerkki 3) vaikutus ALP-aktiivisuuteen
Kuva. 7: Valokuvia osteoblastien mineralisaation alizariinipunavärjäytymisestä (esimerkki 2)
Kuva. 8: Osteoblastien mineralisaation kvantitatiiviset tulokset (esimerkki 2)
Kuva. 9–12: Esimerkin 2 vaikutukset Runx2-, Osx-, Opn-, Ocn-mRNA-ilmentymiseen
Kuva. 13: Esimerkin 2 vaikutus Bmp2-mRNA-ilmentymiseen (BMP/Smad)
Kuva. 14–16: Esimerkin 2 vaikutukset Lrp5-, Wnt3-, Lrp6-mRNA-ilmentymiseen (Wnt/-kateniini)
Kuva. 17–18: Esimerkin 2 vaikutukset Osx- ja RUNX2-proteiinin ilmentymiseen

 

Yksityiskohtainen kuvaus / suoritusmuodot

Esimerkki 1

Valmistusmenetelmä käsittää:

murskaamallaCistanche tubulosa40 meshin seulan läpi saadakseen200 graakajauhe;

purkaminen kanssatislattua vettä 5-kertaisella massalla(kuten on kuvattu), uuttamalla klo75 astettavarten2 kertaa, 1h kukin, keskittyen70 astettapitoisuussuhteeseen1 : 2.2väkevän liuoksen saamiseksi;

Absoluuttisen etanolin lisääminen väkevöityyn liuokseen etanolisaostusta varten etanolin lopullisilla massapitoisuuksilla20%, 40%, 60%, 80%, sataa klo5 astetta 24 tuntia, kerää supernatantti sen jälkeen80 painoprosenttiaetanolisaostus;

tiivistäminen ja kuivaus klo70 astettaCistanche-uutteen saamiseksi saannolla20.75%.

Esimerkki 2

Valmistusmenetelmä käsittää:

murskaamallaCistanche tubulosasaada240 graakajauhe;

uuttaminen tislatulla vedellä, suodatus, sentrifugointi ja väkevöinti väkevän liuoksen saamiseksi;

väkevän liuoksen uuttaminen; alemman faasin konsentroiminen epäpuhtauksien poistamiseksi; laimennetaan latausliuoksen saamiseksi;

latausliuoksen jälkikäsittely; tiivistäminen ja kuivaus klo70 astettauutteen saamiseksi saannolla19.69%.

Raakajauhe kulkee 40 meshin seulan läpi.
Raakajauheen massa-tilavuussuhde tislattuun veteen on1 : 20.
Uuttolämpötila on80 astetta.
[0041] Uutto suoritetaan1-2 kertaa, 1h kukin.
Suodatus tapahtuu an80 meshsuodattaa.
Sentrifugointi on3500 r/min 5 min.
Konsentrointi sentrifugoinnin jälkeen: väkevöi ns70 astettato20%alkuperäisestä tilavuudesta.
Uuton aikana väkevöidyn liuoksen tilavuussuhde liuottimeen on1 : 3.
Uutto suoritetaan peräkkäin kanssapetrolieetterijaetyyliasetaatti.
Alempi faasi väkevöidään tahnaksi ja liuotetaan siihen300 ml 50-painoprosenttista vesipitoista etanoliaepäpuhtauksien poistamiseksi.
Täyttöliuoksen pitoisuus:1,0 g raakayrttiä/ml vettä.
Jälkikäsittely: vie makrohuokoisen hartsin läpi, eluoi tislatulla vedellä ja sitten etanoliliuoksella.
Virtausnopeus hartsin läpi:3 ml/min.
Hartsi:AB-8, hartsin tilavuus0.93 L.
Tislatun veden ja hartsin tilavuussuhde:7 : 1. Etanoli-liuos-hartsi-suhde:6 : 1.
Etanoliliuos:80% (w/w)vesipitoista etanolia.

 

Napsauta saadaksesi lisätietoja vesisäiliötehtaasta

Esimerkki 3

Valmistusmenetelmä käsittää:

murskaamallaCistanche tubulosa40 meshin seulan läpi saadakseen120 graakajauhe;

purkaminen kanssa12× massa/50 paino-% vesipitoista etanolia, poiminta klo70 astetta, 2 kertaa, 1h kukin, keskittyen70 astettasuhteessa1 : 2.5väkevän liuoksen saamiseksi;

lisäämällä vettä pitoisuuden säätämiseksi0,2 g raakayrttiä/ml vettä, sentrifugointi klo3500 r/min 5 minottamalla supernatantti latausliuoksena;

kulkee makrohuokoisen hartsin läpi; eluoidaan peräkkäin tislatulla vedellä ja etanoliliuoksella; etanolieluointi kerätään talteen ja konsentroidaan/kuivataan lämpötilassa70 astettasaada uutetta saannolla24.30%.

Hartsi:HPD750, hartsin tilavuus0.93 L.
Tislatun veden ja hartsin suhde:3 : 1. Etanoli-liuos-hartsi-suhde:4 : 1.
Etanoliliuos:30% (w/w)vesipitoista etanolia.

 

Suorituskykytestaus

1.1 Solujen lisääntymismääritys

Osteoblastit ovat pääasiallisia toiminnallisia soluja, jotka ovat vastuussa luun muodostumisesta, johon liittyy pre-osteoblastien proliferaatio, luumatriisin tuotanto ja lopullinen erilaistuminen. TheMC3T3-E1solulinjaa käytetään yleisesti osteogeenisen aktiivisuuden tutkimiseen. Osteoblastien erilaistumiseen liittyy lisääntyminen, erilaistuminen ja mineralisaatio, joka ilmenee lisääntyneenä pre-osteoblastien lukumääränä, kypsymisenä osteoblasteiksi ja uuden luumatriisin muodostumisena.

Alkalinen fosfataasi (ALP)on osteoblastien fenotyyppiin liittyvä proteiini, joka on havaittavissa solujen lisääntymisen ja matriisin kypsymisen aikana, ja se on yleisesti käytetty osteoblastien erilaistumisen varhainen markkeri.

Sen vuoksi vertailtiin esimerkeissä 1-3 valmistettujen uutteiden osteogeneesiä edistävää aktiivisuutta arvioimalla MC3T3-E1-proliferaatiota ja ALP-aktiivisuutta.

MC3T3-E1-solut herätettiin henkiin ja siirrostettiin. Stabiloinnin jälkeen solut digestoitiin, sentrifugoitiin ja kerättiin. Solutiheys säädettiin siten, että jokainen 100 µl sisälsi 5 x 1035 x 10 ^ 35 x 103 solua ja siirrostettiin 96-kuoppaiselle levylle. Yön yli viljelyn jälkeen elatusaine korvattiin täydellisellä alustalla, joka sisälsi esimerkkien 1-3 uutteita pitoisuuksina6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/mltai sisältävät0,1 M estradioli(positiivinen kontrolli) tai pelkkä väliaine (nollakontrolli) ja viljelty48 h. Valolta suojatuissa olosuhteissa lisättiin MTT-varastoliuosta (10–20 % kuopan tilavuudesta), jota inkuboitiin4 hCO₂-inkubaattorissa, väliaine poistetaan ja200 µl DMSO:talisätään formazaanin liuottamiseksi. OD-arvot mitattiin klo490 nm.

Tulokset: Fig. 1 (Esimerkki 1), Fig. 2 (Esimerkki 2), Fig. 3 (Esimerkki 3).

[0058] Solujen lisääntymisnopeus (%)=OD(Esimerkki 1-3)-OD(Tyhjä)OD(Tyhjä)×100%\\frac{OD(\\teksti{Esimerkki 1-3}) - OD(\\teksti{Tyhjä})}{OD(\\teksti{Tyhjä})} \\times OD10. 1–3) − OD (tyhjä) × 100 %

[0059] Kuten kuvioista . 1-3 esitetään, positiivinen kontrolli edisti MC3T3-E1:n lisääntymistä. Esimerkki 1 edisti proliferaatiota pitoisuuksilla 6,25, 12,5 ja 25 ug/ml; proliferaationopeus pitoisuudella 12,5 ug/ml oli 1,4 x positiivisen kontrollin, mutta ilman merkittävää eroa (P > 0,05). Esimerkki 2 edisti proliferaatiota pitoisuuksilla 6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/ml; pitoisuuksilla 12,5, 25 ja 50 ug/ml sen vaikutukset olivat parempia kuin positiivisen kontrollin (P < 0,01 tai P < 0,001), proliferaationopeuden ollessa 2,55x, 3,46x ja 2,59x positiivisella kontrollilla. Esimerkki 3 edisti proliferaatiota pitoisuuksilla 6,25, 12,5, 25 ja 50 ug/ml; pitoisuuksilla 12,5, 25 ja 50 ug/ml se oli parempi kuin positiivinen kontrolli (P < 0,01 tai P < 0,001), proliferaationopeuden ollessa 1,40x, 1,76x ja 0,93x positiivisesta kontrollista. Tämä osoittaa, että esimerkillä 2 oli paras vaikutus MC3T3-E1-proliferaation edistämiseen.

1.2 ALP-aktiivisuusmääritys

ALP-aktiivisuus mitattiin käyttämällä ALP-määrityspakkausta. P-nitrofenolin varastopitoisuus oli 10 mM ja standardikäyrän pitoisuudet olivat 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 ja 0,25 mM, valmistettu gradienttilaimennuksella detektiopuskurilla.

Jokaiseen 96-kuoppaisen levyn näytekaivoon lisättiin 49 µl havaitsemispuskuria, 1 µl käsitellyistä MC3T3-E1-soluista uutettua proteiinia (osasta 1.1) ja 50 µl kromogeenistä substraattia (lisätty viimeisenä). Reaktio eteni 30 minuuttia valolta suojatussa inkubaattorissa, lopetettiin lisäämällä 100 µl pysäytysliuosta ja absorbanssi mitattiin405 nm. ALP-aktiivisuus laskettiin standardikäyrästä.

Tulokset: Fig. 4 (Esimerkki 1), Fig. 5 (Esimerkki 2), Fig. 6 (Esimerkki 3).

[0061] ALP-aktiivisuus (U/L)=(proteiinin suhteellinen molaarinen pitoisuus) × 1000 × 100 / 30
(1000 mooliyksikön muunnokselle; 100 kokonaisreaktiotilavuudelle; 30 30 minuutin reaktioajalle)

ALP on MC3T3-E1-erilaistumisen varhainen merkki. Kuvat. 4–6 osoittavat, että positiivinen kontrolli lisäsi ALP-aktiivisuutta. Esimerkki 1 ei edistänyt ALP-aktiivisuutta. Esimerkki 2 lisäsi ALP-aktiivisuutta arvoilla 12,5, 25 ja 50 ug/ml; 25 ja 50 ug/ml erot nollakokeeseen verrattuna olivat merkitseviä (P < 0,01). Esimerkki 3 lisäsi ALP-aktiivisuutta pitoisuuksilla 12,5 ja 25 ug/ml (P < 0,001), mutta pitoisuuden kasvaessa tehostuminen väheni. Tämä osoittaa, että vain esimerkit 2 ja 3 lisäsivät ALP-aktiivisuutta ja tukivat erilaistumista.

Kaiken kaikkiaan vain esimerkki 2 osoitti annospositiivista korrelaatiota sekä MC3T3-E1-proliferaatiossa että ALP-aktiivisuudessa pitoisuuksilla 12,5 ja 25 ug/ml. Esimerkki 3 osoitti annospositiivista korrelaatiota proliferaatiolle, mutta annosnegatiivista korrelaatiota ALP:lle. Vertailun vuoksi esimerkki 2 soveltuu paremmin luun mineraalitiheyden parantamiseen.

1.3 Esimerkin 2 mineralisointi (alizariininpunainen värjäys).

Koska esimerkki 2 osoitti parhaan aktiivisuuden ja annoskorrelaation esimerkkeihin 1 ja 3 verrattuna, suoritettiin mineralisaatiokokeita sen vaikutuksen arvioimiseksi edelleen.

MC3T3-E1-soluja käsiteltiin 72 tunnin viljelyn jälkeen esimerkin 2 uutteella klo.12,5, 25 ja 50 ug/ml, inkuboitu 37 asteessa14 days(perustuu kalsiumkyhmyjen muodostumiseen), väliaineen vaihdolla 2 päivän välein. Alizarin Red -värjäys suoritettiin: elatusaine poistettiin, soluja kiinnitettiin 10 % neutraalilla formaliinilla (300 µl/kuoppa) 30 minuutin ajan, huuhdeltiin, värjättiin 0,1 % Alizarin Redillä (300 µl/kuoppa) 30 minuutin ajan (huoneenlämpötila, valolta suojattu) ja pestiin, kunnes punaista väriä ei enää jäljellä. Kuvia otettiin. Sitten lisättiin 10 % setyylipyridiniumkloridiliuosta (400 µl/kuoppa) ja ravisteltiin 1 tunti kalkkiutuneiden kyhmyjen liuottamiseksi. Liuennut liuos siirrettiin 96-kuoppaiselle levylle (100 µl/kuoppa) ja OD mitattiin562 nmmineralisaationopeuden laskemiseen. Valokuvat: kuva. 7; kvantitatiiviset tulokset: kuva. 8.

[0065] Mineralisaationopeus (%)=OD(Esimerkki 2)−OD(Tyhjä)OD(Tyhjä)×100%\\frac{OD(\\teksti{Esimerkki 2}) - OD(\\teksti{Tyhjä})}{OD(\\teksti{Tyhjä})} \\ kertaa 100\\teksti(Blank)%OD(Blank) 2) − OD (tyhjä) × 100 %

[0066] Kuvio. 7 osoittaa, että kalsiumkyhmyjen määrä kasvoi peräkkäin konsentraation ja nollanäytteen kanssa. Kuvio . 8 osoittaa, että esimerkki 2 edisti mineralisaatiota konsentraatiosta riippuvalla tavalla pitoisuuksilla 12,5, 25 ja 50 ug/ml, voimakkain vaikutuksella pitoisuudella 50 ug/ml, merkittävästi paremmin kuin positiivinen kontrolli (P < 0,001). Koska mineralisoituneet kyhmyt edustavat osteoblastien erilaistumisen viimeistä vaihetta, nämä tulokset vahvistavat edelleen esimerkin 2 luun tiheyttä tukevan vaikutuksen ja osoittavat sen stabiilin aktiivisuuden. Esimerkki 2 oli parempi kuin estradioli, mikä osoitti luuston terveyteen liittyvien tuotteiden mahdollisen arvon.

Geenien ilmentyminen ja polkumekanismi (esimerkki 2)

Esimerkin 2 uutetta (12,5, 25, 50 ug/ml) levitettiin MC3T3-E1-soluille 3 päivän ajan. RNA:n uuttaminen, kvantifiointi, käänteistranskriptio (20 µl järjestelmä; 800 ng RNA:n syöttö) ja qRT-PCR suoritettiin suhteellisten ilmentymistasojen kvantifioimiseksi.Runx2-mRNA, Osx-mRNA, Opn-mRNA ja Ocn-mRNA. Tulokset: kuva. 9–12.

Runx2 ja Osx ovat keskeisiä alavirran säätelijöitä BMP-signalointissa, mikä indusoi osteoblastien erilaistumista. Runx2 on tärkeä varhaisessa sitoutumisvaiheessa, kun taas Osx toimii terminaalien eriyttämisessä. OPN ja OCN ovat tärkeitä indikaattoreita osteoblastien aktiivisuudelle ja kudosten mineralisaatiolle. Kuvat. 9–12 osoittavat, että esimerkki 2 lisäsi näiden markkerien suhteellista ilmentymistä, mikä tuki tehostunutta osteoblastien erilaistumista ja luun muodostumista.

Esimerkki 2 on säädelty ylöspäinBmp2 mRNA(Kuva. 13), joka osoittaa, ettäBMP/Smad-reitti, joka tukee osteoblastien erilaistumista ja uuden luun muodostumista.

Esimerkki 2 lisäsi suhteellista ekspressiotaLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA ja Wnt3 mRNA(Kuva. 14–16), tukee sovelluksen aktivointiaWnt/ -catenin signalointi, joka liittyy läheisesti osteoblastien lisääntymiseen, erilaistumiseen ja luun muodostumiseen.

Proteiinin ilmentyminen (esimerkki 2)

Western blot -analyysi osoitti, että esimerkki 2 lisääntyiOsxjaRUNX2proteiinin ilmentyminen (kuva. 17–18), mikä osoittaa säätelyn sekä transkription että translaation tasolla osteoblastien erilaistumisen edistämiseksi.

Nämä aktiivisuustestit osoittavat, että esimerkki 2 sai aikaan parhaan proliferaatiota edistävän vaikutuksen ja oli ainoa, jolla oli johdonmukainen annoskorrelaatio sekä proliferaatiolle että ALP:lle. Esimerkki 2 oli myös parempi kuin estradioli edistäessään MC3T3-E1:n proliferaatiota ja mineralisaatiota vertailukelpoisilla erilaistumisvaikutuksilla, mikä viittaa optimaaliseen luutiheyttä tukevaan potentiaaliin.

 

Kemiallisen koostumuksen testaus

6.1 Fenyylietanoli-glykosidipitoisuus

[0076] Viitaten Kiinan farmakopean "Cistanche"-määritysmenetelmään, mitattiin ekinakosidi- ja akteosidipitoisuudet esimerkeissä 1-3 (tulokset esitetään taulukossa 1). Ekinakosidin, akteosidin ja kokonais-PhG:iden perusteella suuntaus oli johdonmukainen: Esimerkki 3 > Esimerkki 1 > Esimerkki 2, ja akteosidi esimerkissä 3 oli 3,85x ja 4,27x esimerkkien 1 ja 2 vastaavasti. Aktiivisuuden ja sisällön tulosten yhdistäminen osoittaa, että ekinakosidi ja akteosidi eivät yksin määritä osteogeenisia vaikutuksia.

 

Taulukko 1. Ekinakosidin ja akteosidin pitoisuus sistanche-uutteissa (%)

Näyte (esimerkki)	ekinakosidi (%)	Akteosidi / verbaskosidi (%)	Yhteensä (%)
Esimerkki 1	28.68	1.63	30.31
Esimerkki 2	26.27	1.47	27.74
Esimerkki 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Muut komponentit (UPLC/Q-TOF/MS)

UPLC/Q-TOF/MS käytettiin vertaamaan kemiallisia komponentteja esimerkkien 1-3 välillä. Vastearvot on esitetty taulukossa 2.

Esimerkki 2 sisälsi ekinakosidin ja akteosidin lisäksi muitasikimiinihappo ja fenyylipropionihappotyyppiset komponentit, ja myösalkaloidit. Verrattuna esimerkkeihin 1 ja 3, esimerkissä 2 oli 11 fenyylipropioni/shikimiinihappoon liittyvää komponenttia, joilla oli korkeimmat vasteet, mukaan lukien:

Taulukko 2. Cistanche-uutteiden avainkomponenttien UPLC/Q-TOF/MS-vastearvot (esimerkit 1–3)

注:原表为"响应值(vastearvo)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内分为2.Shikimiinihappo ja fenyylipropionihappojohdannaiset(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloidit(生物碱).

A. Shikimiinihappo ja fenyylipropionihappojohdannaiset

Yhdiste	Esimerkki 1	Esimerkki 2	Esimerkki 3
Isodanfenolihappo B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-hydroksifenyylipropionihappo (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikimiinihappo (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihydroksifenyyli)etoksi]karbonyyli-2-(3,4-dihydroksifenyyli)-7-hydroksi-2,3-dihydrobentsofuran-4-yyli]prop-2-enoyyli-4-propyyli-3-propaanihappo	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Bentsoyyliasetoni (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinoli 4′-O- -D-glukosidi (表丁香树脂酚 4′-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshanin glykosidi* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimetyylibentsoehappo (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroksitetrahydropyran-2-yyli]oksimetyyli]tetrahydropyran-2-yyli]oksikromen-2-oni	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloidit

Yhdiste	Esimerkki 1	Esimerkki 2	Esimerkki 3
Vertikiini (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrokoptisiini (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Tymiini (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemiini (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

isodanfenolihappo B,

p-hydroksifenyylipropionihappo,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-karboksi-2-(3,4-dihydroksifenyyli)etoksi]karbonyyli-2-(3,4-dihydroksifenyyli)-7-hydroksi-2,3-dihydrobentsofuran-4-yyli]prop-2-enoyyli,4-propaanihappo-3-(hydroksi,4-oksi)-3

bentsoyyliasetoni,

epipinoresinoli 4'-O- -D-glukosidi,

myrisetiiniin liittyvä glykosidi (luettelossa),

jionoside A1,

3,4-dimetyylibentsoehappo,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroksi-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroksitetrahydropyran-2-yyli]oksimetyyli]tetrahydropyran-2-yyli]oksikromen-2-oni.

Se sisälsi myös 5 alkaloidia, mukaan lukien:

vertikiini,

dihydrokoptisiini (kuten luettelossa),

tymiini,

gelsemiiniin liittyvä alkaloidi (luettelossa),

johimbiini.

Proliferaatio/ALP-aktiivisuuden, fenyylietanoidiglykosidimääritysten ja kemiallisen profiloinnin vertailutulosten perusteella voidaan päätellä, että fenyylietanoidiglykosidit (ekinakosidi ja akteosidi), shikimic/fenyylipropionihapot, alkaloidit ja terpenoidit yhdessä muodostavat esimerkin 2:n johdonmukaisen annos-uutteen spesifisen koostumuksen. (12,5–25 ug/ml) proliferaation, erilaistumisen ja mineralisaation kautta, mikä mahdollistaa vakaat luun tiheyttä tukevat vaikutukset.

Taulukko 2: Komponenttien vastearvot.
Keksintö tarjoaa esimerkin 2 menetelmällä Cistanche-uutteen, jossa on yhteensä ekinakosidia + akteosidia > 25 % ja rikastettuja shikimic/fenyylipropionihappoja ja alkaloideja, mikä mahdollistaa vakaat luun tiheyttä tukevat vaikutukset. 12,5–25 ug/ml:n sisällä se edistää MC3T3-E1:n proliferaatiota, erilaistumista ja mineralisaatiota annosta lisäävällä tavalla johdonmukaisella annoskorrelaatiolla, tukee parempia ja vakaampia luun terveyteen liittyviä tuloksia ja mahdollistaa käytön luun mineraalitiheyden parantamiseen liittyvissä tuotteissa.