Cistanche Deserticola -polysakkaridi heikentää osteoklastogeneesiä ja luun resorptiota estämällä RANKL-signalointia ja reaktiivisten happilajien tuotantoa

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dezhi Song et ai

Osteoporoosi on aineenvaihduntasairaus, jolle on ominaista osteopenia ja luun mikrorakenteen rappeutuminen. Osteoklastit ovat ensisijaisia ​​efektorisoluja, jotka hajottavat luumatriisia, ja niiden epänormaali toiminta johtaa osteoporoosin kehittymiseen. Reaktiivisten happilajien (ROS) kerääntyminen solujen aineenvaihdunnan aikana edistää osteoklastien proliferaatiota ja erilaistumista, joten sillä on tärkeä rooli osteoporoosissa.Cistanchedeserticolapolysakkaridi(CDP) on kasvaimia estävä, anti-inflammatorinen ja antioksidanttivaikutus. CDP:n vaikutus osteoklasteihin on kuitenkin epäselvä. Tässä tutkimuksessa käytettiin tartraattiresistenttiä hapan fosfataasivärjäystä, immunofluoresenssia, käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiota ja Western blot -analyysiä osoittamaan, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)esti osteoklastogeneesiä ja hydroksiapatiitin resorptiota. Lisäksi CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)esti myös osteoklastimarkkerigeenien, mukaan lukien Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ilmentymistä, eikä sillä ollut vaikutusta ydintekijä KB:n (RANK) ilmentymisen reseptoriaktivaattoriin. Mekanistiset analyysit paljastivat, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)lisää antioksidanttientsyymien ilmentymistä heikentääkseen RANKL-välitteistä ROS-tuotantoa osteoklasteissa ja inhiboi aktivoituneiden T-solujen ydintekijää ja mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin aktivaatiota. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CDP voi edustaa kandidaattilääkettä liiallisen osteoklastiaktiivisuuden aiheuttaman osteoporoosin hoitoon.

AVAINSANATluun resorptio,Cistanchedeserticolapolysakkaridi, MAPK, osteoklasti, reaktiiviset happilajit

cistanche-kehonrakennus

1|JOHDANTO

Osteoblastien välittämän luun muodostumisen ja osteoklastien välittämän luun resorption välisellä tasapainolla on tärkeä rooli luun metabolisen homeostaasin ylläpitämisessä (Manolagas, 2000; Zhu et al., 2018). Kun luun resorptio ylittää luun muodostumisen, esiintyy osteoporoosia, jolle on ominaista luumassan väheneminen ja luun mikrorakennevauriot (Ikeda, 2008). Osteoporoosi on yleinen sairaus iäkkäillä henkilöillä ja postmenopausaalisilla naisilla, eikä sen patogeneesiä ole täysin selvitetty (Cooper & Melton, 1992). Estrogeenin puute on osteoporoosin ensisijainen syy (Manolagas, O'Brien ja Almeida, 2013). Lisäksi reaktiivisia happilajeja (ROS) voi indusoida ydintekijä KB-ligandin (RANKL) reseptoriaktivaattorilla, ja ne liittyvät osteoklastien muodostumiseen (Yip et al., 2005), ja ne voivat siten edistää osteoporoosin kehittymistä (Manolagas, 2010). Jotkut tutkimukset ovat osoittaneet, että Nrf2-antioksidanttipuutos lisää ROS-tasoja ja edistää RANKL:n aiheuttamaa osteoklastien erilaistumista (Hyeon, Lee, Yang ja Jeong, 2013). Siksi ROS-tuotannon vähentäminen osteoklastien erilaistumisen aikana tulisi arvioida terapeuttisena strategiana osteoporoosin hoidossa.

Osteoklastit ovat peräisin monosyytti- tai makrofagihematopoieettisesta linjasta ja ovat ainoat monitumaiset solut, jotka suorittavat luun resorptiota (Teitelbaum, 2000). Siksi osteoklastien muodostumiseen liittyvällä tutkimuksella on suuri merkitys tehokkaiden hoitojen kehittämisessä luuaineenvaihduntasairauksiin (Lorenzo, 2017). Osteoblastien ja aktivoituneiden T-solujen tuottamat makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M‐CSF) ja RANKL ovat tärkeitä sytokiinejä, jotka säätelevät osteoklastogeneesiä (Kim & Kim, 2016; Teitelbaum & Ross, 2003). RANKL indusoi aktivoitujen T-solujen tumatekijän (NFATc1) ilmentymistä, joka on osteoklastien muodostumisen aikana aktiivinen kriittinen transkriptiotekijä (Ishida et ai., 2002). Aktivoitu NFATc1 edistää osteoklastimarkkerigeenien, kuten tartraattiresistentin hapan fosfataasin (TRAcP) ja katepsiini K:n (CTSK), ekspressiota, jotka säätelevät osteoklastogeneesiä ja osteoklastien toimintaa (Balkan et al., 2009; Crotti et al., 2008).

Cistanchedeserticolapolysakkaridi(CDP) on eristetty lihavista varrestaCistancheja sillä on immuunisäätelyä, kasvaimia estäviä, ikääntymistä estäviä ja muita farmakologisia vaikutuksia (Guo et al., 2016; Jia, Guan, Guo ja Du, 2012). CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)sillä oli estävä vaikutus lipopolysakkaridien aiheuttamaan typpioksidin (NO) tuotantoon hiiren mikrogliasoluissa (BV-2-solut; Nan et al., 2013). Lisäksi runsaasti fenyylietanoideja sisältävä uute (ECD).Cistancheparansi hiirten uintikykyä vähentämällä lihasvaurioita, hidastamalla maitohapon kertymistä ja parantamalla energian varastointia (Cai et al., 2010). CDP:n vaikutukset osteoklastien toimintaan ja aktiivisuuteen jäävät kuitenkin tuntemattomiksi.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)estää RANKL:n aiheuttamaa osteoklastien erilaistumista ja luun resorptiota. Taustalla oleva mekanismi oli CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tehostaa antioksidanttientsyymien ilmentymistä heikentääkseen ROS-tuotantoa ja sitten tukahduttaa RANKL-aktivoiman NFAT:n ja mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK) signaalikaskadit. Nämä tulokset viittaavat siihen, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)voidaan käyttää osteoporoosin hoitoon, joka johtuu liiallisesta osteoklastien luun resorptiosta.

maca ginseng cistanche

2|MATERIAALIT JA MENETELMÄT

2.1|Materiaalit

CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)(puhtaus > 98 prosenttia) ostettiin Solarbiolta (Peking, Kiina) ja valmistettiin varastopitoisuudella 1 mM fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS). Vasta-aineet ovat spesifisiä c‐Fosille, CTSK:lle, GSR:lle, TRX1:lle, NOS2:lle, TRAF6:lle, RANK:lle, NFATc1:lle, ERK:lle, JNK:lle, p38:lle, fosforyloidulle (p)‐ERK:lle, p‐p38:lle, p‐JNK:lle ja ‐actinille saatiin Santalta. Cruz Biotechnology (San Jose, CA). Vasta-aineita V-ATPaasi d2:ta vastaan ​​tuotettiin aiemmin kuvatulla tavalla (H. Feng et al., 2009). 3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-5-(3-karboksimetoksifenyyli)-2-(4-sulfofenyyli)-2H-tetratsolium (MTS) ja lusiferaasimääritysjärjestelmä hankittiin yhtiöstä Promega (Sydney, Australia) . Rekombinantti M-CSF ostettiin R&D Systemsiltä (Minneapolis, MN). Rekombinantti GST-rRANKL-proteiini ekspressoitiin ja puhdistettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Xu et ai., 2000).

2.2|Soluviljely

RAW264.7-solut (hiiren makrofagisolut) saatiin American Type Culture Collectionista (ATCC, Manassas, VA) ja niitä viljeltiin modifioidussa välttämättömässä minimaalisessa alustassa (Thermo Fisher Scientific, Scoresby, Australia), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla, 2 mM L-glutamiinia, 100 U/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomysiiniä (täydellinen alusta). Luuytimestä peräisin olevat monosyytit (BMM) eristettiin 6 viikon ikäisistä C57BL/6J-hiiristä, jotka lopetettiin Länsi-Australian yliopiston eläineettisen komitean (RA/3/100/1244) hyväksymien menetelmien mukaisesti. Pitkät luut leikattiin pois pehmytkudoksesta ja luuydin huuhdeltiin reisiluusta ja sääriluusta, jota viljeltiin sitten täydellisessä alustassa M-CSF:n (50 ng/ml) läsnä ollessa.

2.3|Osteoklastogeneesimääritys

BMM:t maljattiin 96-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä 6 × 103 solua kuoppaa kohti ja käsiteltiin täydellisellä alustalla, joka sisälsi M-CSF:ää (50 ng/ml) ja GST-rRANKL:ää (100 ng/ml) tai läsnäollessa tai CDP:n vaihtelevien pitoisuuksien puuttuminen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). The cell culture medium was changed every 2 days. After 5 days, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 10 min, washed three times with PBS, and then stained for TRAcP‐enzymatic activity using the leukocyte acid phosphatase staining kit (Sigma‐Aldrich, Sydney, Australia), following the manufacturer's procedures. TRAcP‐positive multinucleated cells (>kolme ydintä) tunnistettiin osteoklasteiksi.

2.4|Sytotoksisuusmääritykset

BMM:t kylvettiin 96-kuoppaisille levyille 6 × 103 solua per kuoppa ja jätettiin yön yli kiinnittymään. Seuraavana päivänä soluja inkuboitiin CDP:n vaihtelevilla pitoisuuksilla(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). Vielä 48 tunnin kuluttua lisättiin MTS-liuos (20 ui/kuoppa) ja inkuboitiin solujen kanssa 2 tuntia. Absorbanssi 490 nm:ssä määritettiin mikrolevylukijalla (Multiscan Spectrum; Thermo Labsystems, Chantilly, VA.

2,5|Immunofluoresoiva värjäys

BMM-soluja kylvettiin tiheydellä 6 x 103 solua kuoppaa kohti M-CSF:n (50 ng/ml) läsnä ollessa yön yli. Soluja stimuloitiin sitten M-CSF:llä ja GST-rRANKL:llä (100 ng/ml), kunnes kypsät osteoklastit muodostuivat. Osteoklasteja käsiteltiin sitten vaihtelevilla CDP-pitoisuuksilla(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)48 tuntia ennen kiinnittämistä 4-prosenttisella paraformaldehydillä, läpäisevyyttä 0,1-prosenttisella Triton X‐100-PBS:llä ja estämistä 3-prosenttisella naudan seerumialbumiinilla PBS:ssä. Valmistettuja soluja inkuboitiin rodamiinikonjugoidun falloidiinin kanssa 45 minuuttia pimeässä F-aktiinin värjäytymiseksi. Sitten solut pestiin PBS:llä, ytimet vastavärjättiin 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (DAPI) ja kiinnitettiin peitinlasiilla konfokaalista mikroskopiaa varten.

cistanche kokemus

2,6|Hydroksiapatiitin resorptiomääritys

Osteoklastiaktiivisuuden mittaamiseksi kuusikuoppaisilla kollageenilla päällystetyillä levyillä (BD Biocoat; Thermo Fisher Scientific) viljeltyjä BMM-soluja (1 × 105 solua per kuoppa) stimuloitiin GST-rRANKL:llä (100 ng/ml) ja M-CSF:llä (50 ng/ml). ml), kunnes kypsät osteoklastit muodostuivat (Zhou et al., 2016). Solut irrotettiin sitten varovasti levyltä käyttämällä soludissosiaatioliuosta (Sigma-Aldrich) ja yhtä suuri määrä kypsiä osteoklasteja ympättiin yksittäisiin kuoppiin hydroksiapatiitilla päällystetyillä 96-kuoppalevyillä (Corning Osteoassay, Corning, NY). Kypsiä osteoklasteja inkuboitiin alustassa, joka sisälsi GST-rRANKL:ää ja M-CSF:ää CDP:n kanssa tai ilman(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)ilmoitetuilla pitoisuuksilla. 48 tunnin kuluttua puolet kuopista värjättiin immunohistokemiallisesti TRAcP-aktiivisuuden suhteen, kuten edellä on kuvattu, monitumaisten solujen lukumäärän arvioimiseksi kuoppaa kohti. Jäljellä olevia kuoppia valkaistiin 10 minuuttia solujen poistamiseksi ja resorboituneiden alueiden mittaamisen mahdollistamiseksi. Resorboituneet alueet valokuvattiin tavallisella valomikroskopialla ja Image J -ohjelmistoa (National Institutes of Health, Bethesda, MD) käytettiin osteoklastien resorboiman hydroksiapatiittipinnan prosentuaalisen pinta-alan kvantifiointiin.

2,7|Lusiferaasireportterimääritykset

NFATc1:n transkription aktivaation tutkimiseksi RAW264.7-solut transfektoitiin stabiilisti NFATc1-responsiivisella lusiferaasireportterikonstruktilla (Cheng et ai., 2018; van der Kraan et al., 2013). Transfektoituja soluja viljeltiin 48-kuoppaisilla levyillä tiheydellä 1,5 × 105 solua per kuoppa ja esikäsiteltiin erilaisilla CDP-pitoisuuksilla.(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)1 tunnin ajan. Esikäsittelyn jälkeen soluja stimuloitiin GST-rRANKL:llä (100 ng/ml) 24 tunnin ajan ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä lusiferaasireportterimääritysjärjestelmää valmistajan ohjeiden mukaisesti (Promega).

2,8|Kvantitatiivinen käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktio (RT-PCR) -analyysi

Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä Trizol-reagenssia valmistajan protokollan mukaisesti (Thermo Fisher Scientific). Täydentävä DNA syntetisoitiin käyttämällä Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteiskopioijaentsyymiä 1 ug:lla RNA-templaattia ja oligo-dT-alukkeita. Spesifisten sekvenssien polymeraasiketjureaktion monistus suoritettiin käyttämällä seuraavaa ohjelmaa: 94 astetta 5 minuuttia, jota seurasi 30 sykliä 94 astetta 40 sekuntia, 60 astetta 40 sekuntia ja 72 astetta 40 sekuntia, ja viimeinen pidennysvaihe 5 minuuttia 72 asteessa. Yksityiskohtaiset tiedot spesifisistä alukkeista on esitetty taulukossa 1. Suhteelliset lähetti-RNA-tasot laskettiin normalisoimalla taloudenpitogeenin Hmbs ilmentymiseen.

2,9|Western blot -analyysi

BMM-soluja viljeltiin täydellisessä alustassa M-CSF:n kanssa kuuden kuopan levyillä ja stimuloitiin GST-rRANKL:llä (100 ng/ml) ilmoitettujen aikojen ajan. Solut hajotettiin radioimmunosaostuslyysipuskurissa ja proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin poly(vinylideenifluoridi)kalvoille (GE Healthcare, Silverwater, Australia). Kalvot estettiin 5-prosenttisessa rasvattomassa maidossa 1 tunnin ajan ja sitten tutkittiin erilaisilla spesifisillä primäärisillä vasta-aineilla ravistaen kevyesti yön yli 4 asteessa. Kalvot pestiin ja inkuboitiin sen jälkeen piparjuuriperoksidaasilla konjugoitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa. Vasta-ainereaktiivisuus havaittiin sitten tehostetulla kemiluminesenssireagenssilla (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) ja visualisoitiin Image‐quant LAS 4000:lla (GE Healthcare).

2.10|Solunsisäinen ROS-tunnistus

Solunsisäiset ROS-tasot havaittiin käyttämällä 2′,7′-dikloorifluoreseiinidiasetaattia sisältävää solujen ROS-detektiomäärityssarjaa (Abcam, Melbourne, Australia). BMM-soluja (5 x 103 solua per kuoppa) viljeltiin 96-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin RANKL:llä (100 ng/ml), M-CSF:llä (50 ng/ml) ja CDP:llä 72 tunnin ajan. Solunsisäiset ROS-tasot mitattiin käyttämällä 2′,7′-dikloorifluoreseiinidiasetaattia, joka hapettuu fluoresoivaksi DCF:ksi ROS:n läsnä ollessa. Solut pestiin Hankin puskurissa ja inkuboitiin pimeässä 30 minuuttia 10 uM DCFH-DA:n kanssa. Kuvat saatiin konfokaalimikroskopialla.

2.11|Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot edustavat vähintään kolmea kolmena kappaleena suoritettua koetta, ellei toisin mainita. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tulosten välisten erojen merkittävyyden määrittämiseen käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Student–Newman–Keuls post hoc -testejä, ja p < 0,05="" katsottiin="">

3|TULOKSET

3.1|CDP estää RANKL:n aiheuttamaa osteoklastogeneesiä ja osteoklastien fuusiota

Sen määrittämiseksi, onko CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)voi tukahduttaa RANKL:n aiheuttaman osteoklastien muodostumisen, suoritimme ensin osteoklastogeneesimäärityksen hiiren BMM:illä (Liu et al., 2013; Song et al., 2016). BMM-soluja käsiteltiin RANKL:llä ja M-CSF:llä 5 päivän ajan CDP-pitoisuuksien kasvaessa. CDP vähensi TRAcP-positiivisten monitumaisten solujen määrää, kun CDP:n pitoisuus(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)saavutti 5 uM tai enemmän (kuvio 1a, b). CDP:n arvioimiseksi(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)myrkyllisyyteen ja vahvistamaan, että nämä tulokset eivät heijastaneet solukuolemaa tai -määrää, suoritimme MTS-määrityksen. BMM-soluja käsiteltiin RANKL:llä ja M-CSF:llä 48 tunnin ajan vaihtelevilla CDP-annoksilla(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). CDP:llä ei ollut vaikutusta BMM:n proliferaatioon pitoisuudella 15 uM tai vähemmän (kuvio 1c).

CDP:n vaikutusten testaamiseen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)osteoklastien fuusiossa osteoklasteja indusoitiin RANKL- ja M-CSF-hoidolla, vaihtelevilla CDP-annoksilla tai ilman(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). Osteoklastit värjättiin rodamiini-falloidiinilla ja DAPI:lla ytimien lukumäärän arvioimiseksi osteoklastia kohti (kuva 2a). Sekä osteoklastien lukumäärä että keskimääräinen ytimien lukumäärä osteoklastia kohti vähenivät CDP:n jälkeen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)käsittely (5–10 µM; kuva 2b, c). Siksi CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)sillä oli estäviä vaikutuksia RANKL:n aiheuttamaan osteoklastogeneesiin ja osteoklastien fuusioon annosriippuvaisella tavalla.

3.2|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)heikentää RANKL:n aiheuttamaa osteoklastisen hydroksiapatiitin resorptioaktiivisuutta

CDP:n vaikutuksen havaitsemiseksi suoritettiin hydroksiapatiitin resorptiomääritys(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)osteoklastien toimintaan (kuva 3a). 24 tunnin inkubaation jälkeen osteoklastien määrä kuoppaa kohti ei muuttunut, kun taas hydroksiapatiitin resorptioalue pieneni merkittävästi 5 ja 10 µM CDP:llä käsittelyllä verrattuna kontrolliryhmiin (kuvio 3b, c). Nämä tulokset osoittavat, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)sillä on voimakkaita estäviä vaikutuksia sekä osteoklastien muodostumiseen että osteoklastien resorptioaktiivisuuteen ilman sytotoksisia vaikutuksia.

3.3|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)estää osteoklastimarkkerigeenin ilmentymisen

CDP:n inhiboivien vaikutusten tutkimiseksi edelleen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)osteoklastogeneesissä ja osteoklastisessa luun resorptiossa BMM:itä käsiteltiin RANKL:llä ja M-CSF:llä 5 päivän ajan vaihtelevilla CDP-pitoisuuksilla(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). Tämän jälkeen suoritettiin RT-PCR osteoklastimarkkerigeenien ilmentymisen havaitsemiseksi. CDP esti Nfatc1:n, osteoklastogeneesin aikana ratkaisevan transkriptiotekijän, ilmentymisen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)annoksesta riippuvalla tavalla (kuva 4a). Lisäksi CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)(5 ja 10 µM) vähensi luun resorptioon liittyvien geenien, mukaan lukien Mmp9, Ctsk ja Acp5, ekspressiota (kuvio 4b–d).

3.4|CDP suppressoi NFATc1-aktiivisuutta ja alavirran proteiiniekspressiota

CDP:n vaikutuksen tutkiminen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)RANKL-indusoidulle NFATc1-aktiivisuudelle suoritettiin lusiferaasireportterimääritys. Hoito CDP:llä(Cistanchedeserticolapolysakkaridi), pitoisuuksilla 5 µM tai korkeammilla, esti merkittävästi RANKL:n indusoimaa NFATc1-aktiivisuutta (kuva 5a). Lisäksi Western blot -analyysi osoitti, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tukahdutti merkittävästi NFATc1:n ja c-Fosin proteiiniekspressiota BMM:issä, joita oli käsitelty RANKL:llä ja M-CSF:llä 3 ja 5 päivän ajan (kuva 5b). Lisäksi osteoklastien toimintaan liittyvien proteiinien, kuten V-ATPaasi-d2 ja CTSK, ilmentyminen heikkeni CDP:n läsnä ollessa.(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)verrokkiryhmiin verrattuna. CDP:llä ei kuitenkaan ollut vaikutusta RANK-ilmentymiseen (kuvio 5b).

3,5|CDP edistää antioksidanttientsyymien ilmentymistä ROS-tuotannon poistamiseksi RANKL:n aiheuttaman osteoklastogeneesin aikana

CDP-riippuvaisen osteoklastogeneesin eston taustalla olevan mekanismin tutkimiseksi BMM-soluja käsiteltiin RANKL:llä (100 ng/ml) ja M-CSF:llä (50 ng/ml) yhdessä PBS:n tai CDP:n kanssa.(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)72 tunnin ajan. Tutkimme CDP:n vaikutusta RANKL:n stimuloimaan solunsisäiseen ROS-tuotantoon. RANKL-käsittely nosti solunsisäisiä ROS-tasoja, joita CDP heikensi (5 ja 10 uM; kuvio 6a). CDP-käsittely vähensi sekä ROS-positiivisten solujen lukumäärää että ROS-värjäytymisen voimakkuutta annoksesta riippuvalla tavalla (kuva 6b, c). Western blot -analyysi osoitti, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)edisti tioredoksiinin (TRX1) ja glutationireduktaasin (GSR) ilmentymistä samalla kun se suppressoi indusoituvan typpioksidisyntaasin (NOS2) ilmentymistä BMM:issä, joita käsiteltiin RANKL:llä ja M-CSF:llä 3 päivän ajan (kuva 6d).

Voit tutkia tarkemmin, onko CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tukahdutti osteoklastien erilaistumisen vähentämällä ROS-tuotantoa, sitten käsittelimme BMM:itä peroksidilla (10 µM) jäljittelemään korkeaa ROS-tilaa soluissa. BMM:itä indusoitiin RANKL:llä ja M-CSF:llä 3 päivän ajan, ja Western blot -analyysin ja RT-PCR:n tulokset osoittivat, että peroksidi edisti NFATc1- ja c-Fos-ilmentymistä kontrolliryhmiin verrattuna. Kuvan 5 tulosten mukaisesti CDP tukahdutti NFATc1:n ja c‐Fos:n ilmentymisen(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)kun taas peroksidi pelasti CDP:n estävän vaikutuksen (kuvio 6e, f). Nämä tiedot osoittivat, että CDP tukahdutti NFATc1:n ja c-Fosin ilmentymisen poistamalla ROS-tuotannon.

3,6|CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tukahduttaa MAPK-reittejä RANKL:n aiheuttaman osteoklastogeneesin aikana

Seuraavaksi tutkimme CDP:n vaikutusta(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)RANKL-välitteisen TRAF6-ilmentymisen ja MAPK-reitin aktivaation hoito. 2 tunnin inkubaation jälkeen seerumittomassa elatusaineessa, BMM:itä stimuloitiin RANKL:llä CDP:n kanssa tai ilman sitä 60 minuutin ajan. Stimulaatiolla CDP:llä (10 uM) ei ollut vaikutusta TRAF6-ilmentymiseen ja heikensi JNK2:n ja ERK1/2:n fosforylaatiota 10 ja 20 minuutin kohdalla (kuvio 7). Lisäksi CDP esti merkittävästi p38:n fosforylaatiota(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)käsittely 60 minuuttia verrattuna kontrolliryhmiin (kuvio 7). Nämä tiedot paljastavat, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tukahduttaa RANKL:n aiheuttamia MAPK-signalointireittejä, mikä on yhdenmukainen sen osteoklastien muodostumista ja aktiivisuutta estävän vaikutuksensa kanssa.

4|KESKUSTELU

Cistanche, joka tunnetaan nimellä "aavikon ginseng", on viime aikoina herättänyt paljon huomiota kyvystään moduloida immuniteettia ja toimia suojaavasti ikääntymisen ja oksidatiivisen stressin aikana (Jia et al., 2012; Snytnikova et al., 2012). Fenyylipropanoidilla substituoitujen glykosidien, Cistanchen tärkeimpien aktiivisten komponenttien, on osoitettu estävän NO-aktiivisuutta makrofageissa (Ahn, Chae, Chin ja Kim, 2017). Lisäksi aCistancheuute vähensi oksidatiivista stressiä reperfusoidussa sydänlihaksessa iskemian jälkeen ja sillä oli merkittävä rooli sydänsuojaukseen johtavien apoptoottisten reittien estämisessä (Yu, Li ja Cao, 2016). Tärkeänä osana Cistanchea, CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)sillä on erilaisia ​​farmakologisia tehtäviä. Nykyinen tutkimuksemme havaitsi, että CDP tukahdutti RANKL-aktivoitua osteoklastien erilaistumista ja aktivaatiota heikentämällä ROS-tuotantoa sekä NFAT- ja MAPK-aktivaatiota.

Hapana fosfataasina TRAcP:tä esiintyy useissa soluissa ja sitä on runsaasti osteoklasteissa ja alveolaarisissa makrofageissa (Snipes, Lam, Dodd, Gray ja Cohen, 1986). TRAcP on osteoklastien tyypillinen entsyymi ja sen ilmentyminen liittyy läheisesti osteoklastien toimintaan, ja sitä pidetään osteoklastien aktiivisuuden ja luun resorption indikaattorina (Minkin, 1982). Tutkimuksessamme CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)esti TRAcP-positiivisten solujen määrää, mikä osoittaa, että CDP esti RANKL:n aiheuttaman osteoklastogeneesin(Cistanchedeserticolapolysakkaridi). Osteoklastien aiheuttama luumatriisin hajoaminen riippuu katepsiini K:stä (CTSK) ja MMP:istä (Gruber, 2015). Tässä CDP vähensi merkittävästi osteoklastien toiminnallisten geenien, kuten Mmp9, Ctsk ja Acp5, ilmentymistä.

Osteoklastien erilaistumista ja toimintaa säätelevät useat signalointireitit (Boyle, Simonet ja Lacey, 2003). RANK:iin sitoutumisen jälkeen RANKL värvää adapteriproteiinin TRAF6:n aktivoimaan NFATc1:n ilmentymisen. NFATc1 on tärkeä transkriptiotekijä osteoklastien muodostukselle ja vaikuttaa osteoklastispesifiseen geeniekspressioon, mukaan lukien TRAcP ja CTSK (X. Feng, 2005; Takayanagi et al., 2002). Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)ei vaikuttanut RANK- ja TRAF6-ilmentymiseen osteoklasteissa. Kuitenkin CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)esti RANKL:n aiheuttamaa NFATc1-aktivaatiota BMM:ien osteoklastogeneesin aikana. Lisäksi osoitettiin, että mitokondrioiden tuottama ROS edisti osteoklastien proliferaatiota ja erilaistumista ja sääteli luumatriisin hajoamista (Ha et al., 2004). Äskettäisessä tutkimuksessa havaittiin, että RANKL indusoi Bach1-tuman tuontia ja heikensi Nrf2-välitteistä antioksidanttientsyymien tuotantoa, mikä lisäsi solunsisäistä ROS-ilmentymistä ja osteoklastogeneesiä hiirillä (Kanzaki et al., 2017). Lisäksi homokysteiinin lisääntynyt solunsisäinen ROS-tuotanto lisäsi osteoklastien muodostumista ja aktiivisuutta (Koh et al., 2006). Tutkimuksemme havaitsi, että CDP vähensi ROS:n kertymistä osteoklasteihin estämällä NOS2:n ilmentymistä ja edistämällä antioksidanttientsyymien, kuten TRX1:n ja glutationireduktaasin, ilmentymistä. Kun käsittelimme BMM:itä peroksidilla parantaaksemme solunsisäistä ROS:n kertymistä, tulokset, joiden mukaan lisääntynyt ROS saattoi parantaa NFATc1:n ilmentymistä, paljastivat, että ROS oli ylävirtaan NFATc1:stä. Havaitsimme myös, että peroksidi pelasti CDP:n estävän vaikutuksen NFATc1:n ilmentymiseen. Joten tietomme viittaavat siihen, että CDP estää ROS:n kertymistä NFATc1:n ilmentymisen estämiseksi ja sitten osteoklastien muodostumisen ja toiminnan tukahduttamiseksi.

ERK, JNK ja p38 kuuluvat MAPK-perheeseen, joka on myös osallisena osteoklastien erilaistumisen säätelyssä (Seger & Krebs, 1995). RANKL aktivoi MAPK-reitin lisäämällä ERK:n, JNK:n ja p38:n fosforylaatiota (Mizukami et ai., 2002). Osoitimme, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)tukahdutti RANKL-välitteisen avainproteiinien fosforylaation MAPK-reitillä, mikä myötävaikutti CDP:n estävään vaikutukseen osteoklastimarkkerigeenien ilmentymiseen. Tietojemme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa CDP:n estävät vaikutukset(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)ROS-tuotannossa, NFAT:n ja MAPK:n aktivaatiossa, edustaen CDP:n uusia toimintamekanismeja in vitro.

Yhteenvetona osoitimme, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)heikentää osteoklastogeneesiä ja hydroksiapatiitin resorptiota sekä osteoklastimarkkerigeenien, mukaan lukien Ctsk, Mmp9 ja Acp5, ilmentymistä. CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)pystyi tukahduttamaan RANKL-välitteisen ROS-tuotannon sekä NFAT- ja MAPK-aktivoinnin (kuva 8). Yhdessä tuloksemme viittaavat siihen, että CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)voi edustaa ehdokaslääkettä osteoklasteihin liittyvien sairauksien, joihin liittyy ROS-ylituotantoa, hoitoon.

KUVIO 8 CDP:n kaavio(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)toimii osteoklastien erilaistumisessa. CDP(Cistanchedeserticolapolysakkaridi)estää RANKL:n aiheuttamaa ROS-tuotantoa sekä NFATc1- ja MAPK-aktivaatiota, mikä estää osteoklastogeneesiä. CDP,Cistanchedeserticolapolysakkaridi; MAPK, mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi; NFATc1, aktivoitujen T-solujen tumatekijä; RANKL, ydintekijä KB-ligandin reseptoriaktivaattori; ROS, reaktiiviset happilajit [Värikuvaa voi tarkastella osoitteessa wileyonlinelibrary.com]

KIITOKSET

Tätä tutkimusta ovat tukeneet Kiinan luonnontieteellinen säätiö (81572164), Kiinan kansallinen avainteknologian tutkimus- ja kehitysohjelma (2017YFC1103300), Guangxin maakunnan luonnontieteellinen säätiö (2016GXNSFAA380295) ja Guangxin yliopiston tiede- ja teknologiatutkimusprojekti. maakunta (KY2015YB054). Sitä tukevat myös osittain Guangxin tieteellisen tutkimuksen ja teknologian kehittämissuunnitelmaprojekti (GKG13349003, 1598013-15), Western Australia Medical & Health Research Infrastructure Fund, Arthritis Australia Foundation, The University of Western Australia (UWA) Research Collaboration Awards ja Australian Health and Medical Research Council (NHMRC, nro 1107828 ja 1027932).

ETURISTIRIITOJA

Kirjoittajat vakuuttavat, että eturistiriitoja ei ole

Lähettäjä:'Cistanchedeserticolapolysakkaridiheikentää osteoklastogeneesiä ja luun resorptiota estämällä RANKL-signalointia ja reaktiivisten happilajien tuotantoa, Dezhi Song et al.

---©2018 Wiley Periodicals, Inc. wileyonlinelibrary.com/journal/jcp J Cell Physiol. 2018; 233:9674–9684