Glycyrrhiza Uralensiksen ilmaosien aktiiviset flavonoidikomponentit ja mahdolliset mekanismit krooniseen eturauhastulehdukseen verkkofarmakologian ja kokeellisen validoinnin perusteella
Nov 06, 2025
Abstrakti:
Tavoite: Määrittää Cistanchen ilmaosista peräisin olevien flavonoidien aktiiviset ainesosat ja mahdolliset vaikutusmekanismit krooniseen eturauhastulehdukseen. Menetelmät: Ultra-suorituskykyinen nestekromatografia – kvadrupoli – sähköstaattinen kenttä Orbitrap-korkean resoluution massaspektrometriaa (UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS) käytettiin tunnistamaan tärkeimmät flavonoidiaineosat Cistanchen ilmaosien alkoholiuutteesta. Verkkofarmakologiaa ja molekulaarista telakointia käytettiin krooniseen eturauhastulehdukseen liittyvien ydinkomponenttien ja tärkeimpien kohteiden ennustamiseen. Kroonisen eturauhastulehduksen rotan malli indusoitiin karrageenilla, ja histopatologisia muutoksia rotan eturauhasissa havaittiin HE-värjäyksellä. DHT-, IFN-, IgG-, IL-6-, PSA- ja TNF-pitoisuudet seerumissa mitattiin ELISA:lla uutteen terapeuttisen tehon arvioimiseksi. Tulokset: Yhteensä 44 flavonoidia tunnistettiin alkoholiuutteesta. Verkkofarmakologia osoitti, että ydinkomponentit, mukaan lukien glykyrritsiini, trikotekeeni-isoflavoni, piikikäs manzanita florifera ja glysyrritsiini (ennustettu edustaviksi aineosiksi), vaikuttavat krooniseen eturauhastulehdukseen vaikuttamalla avainkohteisiin, kuten AKT1:een, TNF:ään, VEGFA:han, niiden kautta sääteleviin signaaleihin ja MMP9:ään. Molekyylitelakka osoitti suotuisia sitoutumisaffiniteetteja ydinkomponenttien ja tärkeimpien kohteiden välillä. Eläinkokeet osoittivat, että Cistanchen ilmaosien alkoholiuute tuotti selkeän terapeuttisen vaikutuksen krooniseen eturauhastulehdukseen rotilla. Johtopäätös: Cistanchen ilmaosien tehokkuus kroonista eturauhastulehdusta vastaan on validoitu. Aktiiviset komponentit, mukaan lukien piikkiaristolokisiini, trikostatiini-isoflavonit ja glykyrritsiini, voivat vaikuttaa PI3K–AKT-signalointireitin kautta moduloidakseen EGFR:ää, AKT1:tä ja MMP9:ää.
Avainsanat: Cistanchen ilmaosat; krooninen eturauhastulehdus; flavonoidi; UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS; verkostofarmakologia
cistanchen edut eturauhasen terveydelle
Esittely:
Perinteinen kiinalainen lääkeyrtti Cistanche (Cistanche spp.) koostuu pääasiassa TCM:ssä käytetystä kuivatusta lääkeaineesta. Se on tärkeä bulkkilääkeresurssi Kiinassa, ja sen toimintoja ovat muun muassa tonisoivat ja tukevat kehon toimintoja, poistavat lämpöä ja poistavat myrkkyjä, lievittävät kipua ja harmonisoivat kaavoja, ja sitä käytetään yleisesti lisäkomponenttina monissa moniyrttiresepteissä. Markkinoiden kysyntä on kovaa sekä kotimaassa että kansainvälisesti. Ilmaosat, mukaan lukien varret ja lehdet, ovat runsaita resursseja, jotka odottavat kehittämistä ja käyttöä.
Krooninen eturauhastulehdus on yleinen urologinen sairaus nuorten ja keski-ikäisten miesten keskuudessa. Kliinisiä oireita ovat alavatsan tai lantion kipu, dysuria ja virtsaamistiheys. Ilman oikea-aikaista hoitoa se voi johtaa seksuaaliseen toimintahäiriöön, kuten ennenaikaiseen siemensyöksyyn ja erektiohäiriöön, mikä vaikuttaa vakavasti miesten fyysiseen ja henkiseen terveyteen.
Flavonoideja on runsaasti Cistanchen ilmaosissa, ja niillä on huomattava anti-inflammatorinen ja kasvainten vastainen vaikutus. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ilmaosat sisältävät runsaasti flavonoideja, joilla on kasvaimia ja tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia. Flavonoidien rikastaminen ilmaosista osoitti hyvää antioksidanttiaktiivisuutta in vitro. Farmakodynaaminen tutkimus on myös havainnut, että ilmaosista peräisin olevilla flavonoideilla on ehkäiseviä ja terapeuttisia vaikutuksia krooniseen eturauhastulehdukseen.
Tässä tutkimuksessa UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS:ää käytettiin Cistanchen ilmaosien alkoholiuutteen flavonoidien profilointiin. Verkkofarmakologiaa sovellettiin kroonisen eturauhastulehduksen tärkeimpien kohteiden ja reittien ennustamiseen, molekyylitelakointia käytettiin päättelemään mekanismeja, ja eläinkokeita tehtiin kroonisen eturauhastulehduksen vastaisen aktiivisuuden validoimiseksi, mikä tarjosi viitteen myöhempään lääkekehitykseen ja kliiniseen käyttöön.
Materiaalit
Eläimet
SPF-luokan SD-urosrotat (n=24), 6–7 viikon ikäiset, ruumiinpaino 230–250 g [Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd.; tuotantolisenssi: SCXK (Jing) 2019-0010]. Eläimiä pidettiin SPF-eläinlaitoksessa Pekingin kiinalaisen lääketieteen yliopiston Experimental Animal Centerissä. Protokollan hyväksyi institutionaalinen eettinen komitea (hyväksyntänumero: BUCM-2023110204-4271).
Instrumentit
Ultimate 3000 UPLC -järjestelmä (Dionex, USA)
Thermo Q Exactive Plus korkearesoluutioinen massaspektrometri (Thermo Fisher Scientific, USA)
KH500DE digitaalinen ultraäänipuhdistin (Kunshan Hechuang)
FA2004N elektroninen vaaka (Beijing Sartorius)
H1650 hidas jäähdytetty sentrifugi (Changsha Xiangyi)
RE-5023 pyöröhaihdutin (Shanghai Yarong)
Elektroninen lämpötilasäädettävä lämmitysvaippa (Tianjin Teste)
Multiskan MK3 -mikrolevylukija (Thermo Scientific, Shanghai)
B032 fluoresenssi käänteinen biologinen mikroskooppi (Nikon Instruments, Shanghai)
N5000 UV-spektrofotometri (Shanghai Youke)
Reagenssit
Cistanchen ilmassa olevat osat (varret, lehdet ja pieni määrä paloja) korjattiin syyskuussa 2019 Guazhoun piirikunnasta Jiuquan Citystä Gansun maakunnasta, ja professori Wang Wenquan (Institute of Medicinal Plant Development, CAMS) todensi ne Cistanche spp.
Muut reagenssit: Ulatan (Shandong Keyuan Biochemical Co., erä C15887472); karrageeni (Beijing Solarbio, erä 20220601); Qianliekang Pule'an tabletit (Zhejiang Conba Pharmaceutical); natriumkarboksimetyyliselluloosa (CMC-Na; Shanghai YuanYe, erä S14016); ELISA-sarjat rotan DHT:lle, IFN-, IgG:lle, IL-6, PSA:lle ja TNF-:lle (Shanghai Enzyme-linked Biotechnology); Multiskan MK3 -mikrolevylukija (Thermo Scientific); kudoskiinnitysaine (Guangzhou Shuopu, erä 23257838); etanoli (Beijing Chemical Works, analyyttinen laatu); metanoli, muurahaishappo, asetonitriili (Fisher Scientific, MS-laatu); vesi (Wahaha Group). Reference standards (purity > 98%, Shanghai YuanYe): liquiritigenin, puerarin, isoorientin II, naringenin, isoquercitrin, isoliquiritin, ononin, isoquercitrin, quercetin, astragalin, kaempferol, formononetin.
Menetelmät ja tulokset
2.1 Cistanchen ilmaosista peräisin olevan alkoholiuutteen kemiallinen profilointi
2.1.1 Näytteen valmistelu
Sopivat määrät ilmaosia uutettiin 70 % etanolilla. Uute konsentroitiin kuiviin. Jäännös liuotettiin ultraäänellä veteen 20 minuutin ajan, sentrifugoitiin nopeudella 3000 r·min-1 15 minuuttia, ja supernatantti konsentroitiin kuiviin. Sopiva määrä kuivattua näytettä laitettiin 5 ml:n mittapulloon ja täytettiin metanolilla testiliuoksen saamiseksi.
2.1.2 Kromatografiset ja massaspektrometriset olosuhteet
UPLC-olosuhteet: ACQUITY UPLC BEH C18 -kolonni (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm); liikkuva faasi A, asetonitriili; liikkuva faasi B, 0,5 % muurahaishappoa vedessä; gradienttieluointi (0–20 min, 5–20 % A; 20–70 min, 20–30 % A); virtausnopeus 0,2 ml·min-1; injektiotilavuus 2 µl; kolonnin lämpötila 30 astetta.
MS-olosuhteet: HESI-lähde; positiiviset ja negatiiviset ionimoodit; täyden skannauksen hankinta; suihkujännite +3.2 kV (positiivinen) ja −3,0 kV (negatiivinen); kapillaarilämpötila 320 astetta; vaippakaasu 40 arb; apukaasu 15 arb; lisälämmitin 350 astetta ; MS-resoluutio 70 000; MS/MS-resoluutio 17 500; skannausalue m/z 100–1500.
Cistanchen tekniset tiedot
2.1.3 Komponenttien tunnistetiedot
Antenniosanäyte analysoitiin UPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS:llä TIC-arvojen saamiseksi (kuva 1). Tiedot käsiteltiin Thermo Xcaliburilla ja verrattiin komponenttikirjastoihin ja kirjallisuuteen, jolloin tunnistettiin yhteensä 44 flavonoidia (taulukko 1).
2.2 Verkkofarmakologia
Tunnistetut aineosat tuotiin TCMSP 2.3 -tietokantaan (http://tcmspw.com/tcmsp.php). Perustuen oraaliseen biologiseen hyötyosuuteen (OB), joka on suurempi tai yhtä suuri kuin 30,00 % ja lääkemäisyyteen (DL) suurempi tai yhtä suuri kuin 0,18, seulottiin 19 aktiivista komponenttia. Kroonisen eturauhastulehduksen aktiivisten komponenttien ennustetut kohteet ja sairauskohteet leikattiin, jolloin saatiin 88 yleistä kohdetta. PPI-verkon rakentamiseen käytettiin STRING 11.0:aa (http://string-db.org). Asteen mukaan luokiteltuja ydinkohteita olivat AKT1, TNF, VEGFA, EGFR, SRC, ESR1, PTGS2, MMP9, BCL2L1 ja MMP2. GO- ja KEGG-rikastus (DAVID 6.8, http://david.ncifcrf.gov) osoitti biologisia prosesseja, kuten proteiinikinaasi B:n positiivista säätelyä, apoptoosin negatiivista säätelyä ja MAPK-aktiivisuuden positiivista säätelyä; solukomponentit, mukaan lukien solunulkoinen alue, makromolekyylikompleksit ja reseptorikompleksit; molekyylifunktiot mukaan lukien tyrosiinikinaasi-, seriinikinaasi- ja treoniinikinaasiaktiivisuudet. KEGG-reitit rikastuivat syövän, PI3K-AKT-signaloinnin, eturauhassyövän ja EGFR-tyrosiinikinaasi-inhibiittoreiden vastustuskyvyn reiteillä. Cytoscape 3.7.1:tä käytettiin "aktiivinen komponentti-ydinkohde-polku" -verkoston rakentamiseen (kuva 2). Top 10 komponenttia asteittain olivat liquiritigenin, spinasetin (edustava flavoni), isoviteksiini, krysoeroli, santiini, kaempferoli, schaftosidi, luteoliini, ononiini ja formononetiini.
Molekyylitelakointi suoritettiin pareittain 10 ydinkomponentin ja PPI-analyysin tärkeimpien kohteiden välillä. Ydinkomponenttien molekyylirakenteet ladattiin TCMSP 2.3:sta (mol2-muoto), ja tärkeimpien kohteiden 3D-rakenteet saatiin PDB:stä (http://www.rscb.org/) pdb-muodossa. Autodockia käytettiin jokaisen ligandi-proteiiniparin telakointiin. Sitoutumisenergiat < -20,92 kJ·mol-1 osoittivat suotuisaa sitoutumista; mitä pienempi energia, sitä parempi affiniteetti. Parhaat pisteet saaneet kohde-ligandi-parit on lueteltu taulukossa 2. PyMolissa visualisoitiin edustavat telakointikompleksit, joissa oli viisi kohdetta (kuva 3).
2.3 In vivo -validointi
Kroonisen eturauhastulehduksen rottamalli perustettiin käyttämällä karrageenia. HE-värjäys paljasti krooniselle eturauhastulehdukselle tyypillisiä histopatologisia vaurioita mallieläimissä, kun taas Cistanchen ilmaosien alkoholiuutteen käsittely paransi rauhasrakennetta ja vähensi tulehduksellista infiltraatiota. ELISA osoitti, että malliryhmään verrattuna hoitoryhmissä seerumin DHT-, IFN-, IgG-, IL-6-, PSA- ja TNF-tasot säätelevät kohti normaaleja tasoja, mikä viittaa terapeuttiseen tehokkuuteen.
Keskustelu
Kattava analyysi, joka yhdistää korkearesoluutioisen MS-pohjaisen profiloinnin, verkkofarmakologian, molekyylitelakoinnin ja eläinvalidoinnin, tukee sitä, että Cistanchen ilmaosista peräisin olevilla flavonoidilla on kroonista eturauhastulehdusta estäviä vaikutuksia. Oletettuihin mekanismeihin kuuluu PI3K-AKT:n ja siihen liittyvien tulehdukseen ja proliferaatioon liittyvien reittien ja avainkohteiden, kuten EGFR, AKT1 ja MMP9, modulointi. Tulokset tarjoavat tieteellisen perustan Cistanchen ilmassa olevien flavonoidivalmisteiden kehittämiseen ja kliiniseen käyttöön kroonisen eturauhastulehduksen hoidossa.
Johtopäätös
Cistanchen ilmaosista peräisin olevat flavonoidit osoittavat terapeuttista potentiaalia kroonista eturauhastulehdusta vastaan, todennäköisesti PI3K–AKT-reitin säätelyn ja vuorovaikutuksen kautta EGFR:n, AKT1:n ja MMP9:n kanssa. Kemiallisen profiloinnin, verkkofarmakologian, molekyylitelakoinnin ja eläinkokeiden integrointi vahvistaa niiden tehokkuuden ja selventää uskottavia mekanismeja.
