Kuinka tutkia Herba Cistanchesin geneettistä monimuotoisuutta?

RAPD:n tutkimus Herba Cistanchesin geneettisestä monimuotoisuudesta

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Cui Guanghong, Chen Min, Huang Luqi*, Xiao Suping, Li Da

(Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medicine, Beijing 100700)

Abstrakti

Tarkoitus:Tutkimaan väestöägeneettinen monimuotoisuus/Cistanche deserticolajaCistanche tubulosa.

Menetelmät:Kaksi luonnonvaraista populaatiotaCistanche deserticolaja neljä luonnonvaraista populaatiotaCistanche tubulosaanalysoitiin RAPD:llä jageneettinen monimuotoisuuspopulaatioista analysoitiin POPGENEN ohjelmistoversiolla 1.31.

Tulokset:Keskimääräinen prosenttiosuus polymorfisista lokuksistaCistanche deserticolaoli 47,37 prosenttia, näiden kahden populaation polymorfiset lokukset olivat 39,47 prosenttia ja 35,53 prosenttia ja Nein geenien keskimääräinen monimuotoisuus oli 0.135 8. Shannonin oli enemmän. Tilatietoindeksi on 0.207 2 ja geenin erilaistumiskerroin Gst {{1{{20}}}.254 6. Keskimääräinen polymorfisten lokusten prosenttiosuus Cistancessa oli 27,59 prosenttia ja polymorfisten lokusten prosenttiosuus kussakin populaatiossa vaihteli 19,54 prosentista 25,29 prosenttiin, josta Andier-populaatiolla oli korkein 25,29 prosenttia ja Nein keskimääräinen geenidiversiteetti oli 0. { {21}}, Shannonin polymorfismitietoindeksi on 0,1258, geenin erilaistumiskerroin Gst =0.175 5.

Johtopäätös:Cistanche deserticolajaCistanche tubulosajoilla on tietty ero väestöryhmien välillä. Thegeneettinen monimuotoisuusDesert Cistanche on huomattavasti korkeampi kuin Cistanche tubulosa, ja se on jakautunut kahteen ekotyyppiin.

Avainsanat: Cistanche deserticola; Cistanche tubulosa; RAPD; geneettinen monimuotoisuus

[Kiinan kirjaston luokitusnumero] S 567 [Dokumentin tunnistekoodi] A [Artikkelinumero] 1001-5302 (2004) 08-0727-04

Cistanche on Lidanaceae-heimon Cistanche-sukuun kuuluva loiskavi, joka tunnetaan myös nimellä Dayun, joka on arvokas kiinalainen lääkeaine. Cistanche deserticolan tärkeimmät lähdekasvit maassani ovatCistanche deserticolaYCMa ja C.tubulosa (Schenk) R.Wight[1]. Cistanche deserticolan isäntäkasveja ovat Haloxylon ammodendron ja Haloxylon ammodendron, joita esiintyy pääasiassa Alashan Leaguessa Sisä-Mongoliassa, Pohjois-Xinjiangissa, Qinghaissa, Gansussa ja muissa paikoissa. Cistanche deserticolan levinneisyys on sama kuin isäntäkasveilla. Kotimaassani Cistanche cistanchea levitetään vain Taklimakanin aavikon ympärillä Xinjiangin Tianshanin vuoriston eteläpuolella, eikä sen leviämistä ole täysin synkronoitu isäntä Tamarixin kanssa. Muut alueet, kuten Pohjois-Xinjiang, Gansu, Qinghai, Ningxia, Sisä-Mongolia, Shaanxi ja muut Tamarix-kasvien paikat eivät ole Cistanche Tubula -loisia[2]. Cistanchen kysynnän nopean kasvun vuoksi viime vuosina, mikä on johtanut sen resurssien sukupuuttoon, luonnonvaraiset vesivarastot ovat kutistuneet vain muutamalle päätuotantoalueelle. Molemmat on listattu uhanalaisten suojeltujen kasvilajien luetteloon maassani [3], muun muassaCistanche deserticolaon sisällytetty CITESin liitteeseen II [4].

Useiden vuosien tutkimuksen jälkeen Cistanchen keinojalostuksen tutkimus on ollut menestyksellistä ja se on laajamittaisen edistämisen ja istutuksen vaiheessa. Kuitenkin, kuinka estää Cistanche-lajien väheneminen teollisen tuotannon aikana, kuinka rajallinen luonnonvarainen populaatio palautetaan mahdollisimman pian ja säilytetään arvokkaat luonnonvaraiset itiöresurssit, ovat avaimia sen kestävään käyttöön. Mitä tulee Cistanchen suojeltuun perintöön [vastaanottopäivämäärä], 2004-03-11 [rahastohanke] Tiede- ja teknologiaministeriön sosiaalinen hyvinvointihanke (2001.109); Tiede- ja teknologiaministeriö "Kymmenen viisivuotissuunnitelma" -hanke (2001BA701A09a) [Vastaava kirjoittaja] * Huang Luqi, Puh:( 010) 64014411-2955, Sähköposti: huangluqi @263.net Siirtymisen tutkimus on edelleen kesken tyhjä. Tämä tutkimus käyttää RAPD-tekniikkaa kahden luonnonvaraisen populaation tutkimiseenCistanche deserticolaja 4 luonnonvaraista populaatiotaCistanche tubulosaja analysoi molemmat. Erogeneettinen monimuotoisuusodotetaan tarjoavan tärkeän kokeellisen geneettisen perustan Cistanchen, arvokkaan kiinalaisen lääketieteen, suojelulle.

cistanche

1. Materiaali ja menetelmät

1.1 Materiaalit

Cistanche deserticolakerättiin Jimsarin piirikunnasta Xinjiangista ja muinaisen Alxa-liigan Jilantain alueelta Sisä-Mongoliassa. Cistanche-populaatiot kerättiin Minfeng Countysta ja Yutian Countysta Xinjiangista. Minfengin piirikunta on tällä hetkellä alue, jolla on eniten Cistanche cistanchea, tiheämmin ja suhteellisen täydellisiä luonnonmetsiä. Näytteenottopaikat Andil, Sawuzek, Yatongguz ja Daheyan Yutianin läänistä ovat tärkeimmät tuotantoalueet, jotka sijaitsevat Andir-joessa, Yeyike-joessa, Yatongguzi-joessa ja Kelaniyassa. Joen alajuoksussa populaatioiden välinen etäisyys on enemmän kuin 50 km. Jokainen populaatio otti satunnaisesti 19-30 yksilöä. Näytteet kuivattiin nopeasti silikageelissä ja käytettiin DNA-uuttoon (taulukko 1).

Taulukko 1 Näytteenotto Cistanche deserticolan ja Cistanche tubulosan populaatioista ja tuotantoalueista

1.2 DNA-uutto

Kokonais-DNA:n uuttomenetelmässä käytetään korkean suolan ja matalan pH:n menetelmää [5]. DNA-näyte altistettiin spektrofotometrille DNA-templaatin pitoisuuden havaitsemiseksi, sitten RAPD-analyysiin käytettiin 1 prosentin agaroosigeelielektroforeesia, EB-värjäystä, tarkkailua ja valokuvausta ultraviolettivalossa, elektroforeesi-DNA:ta kirkkailla vyöhykkeillä ja vähemmän pyrstöä.

1.3 RAPD-alukkeiden seulonta

Koska kokeessa havaittiin, että samalla alukkeella on epätyydyttävä vaikutus molempien samanaikaiseen monistumiseen.Cistanche deserticolaja Cistanche tubulosa, alukkeet seulottiin itsenäisesti. Monistukseen ja seulomiseen käytettiin 150 satunnaista aluketta (10 bp), Shanghai Shenggong Biotechnology Co., Ltd.:n 25 µl:n reaktiojärjestelmä; jokaisessa alukkeessa käytettiin kahta populaatiomallia ja 1 steriloitua kahdesti tislattua vettä nollakontrollina, ja saatiin 10 aluketta Cistanche deserticolan monistamiseen kirkkailla juovilla, vahvalla polymorfialla ja hyvällä toistettavuudella: S490, S1 101, S{{ 8}}, S1 137, S1 165, S1 218, S1 222, S2 015, S2 112, S{{15 }}; 10 alukettaCistanche tubulosa: S1 141, S1 146, S1 183, S1 208, S1 500, S2 032, S2 042, S2 052, S2 059, S2 155.

1.4 PCR-monistus ja tuotteen havaitseminen

Valittuja alukkeita käytettiin monistamaan templaatti-DNA:nCistanche deserticolajaCistanche tubulosaPCR:llä. Genominen DNA laimennettiin 50 ng·μL:aan -1 templaattina mitatun pitoisuuden mukaan. Reaktion kokonaistilavuus on 25 μL, josta 10 × PCR-puskuri 2,5 μL, Mg2 plus 1,5 μL, Taq (5 U·μL -1) 0,2 μL, dNTP-seos (kukin 2,5 mM) 1 μL, 5 μM aluke 1 μL, templaatti-DNA 1 μL, steriloitu kaksoistislattu vesi 18,8 μL, yllä oleva PCR-monistusliuos on Shanghai Sangonin tuote. Vahvistus suoritettiin PTC-100-lämpösyklilaitteella. Monistusohjelma oli 94 asteen esidenaturointi 5 minuutin ajan ja sitten 40 sykliä. Jokainen sykli sisälsi 94 astetta 45 s, 34 astetta 1 min, 72 astetta 1 min 30 s ja lopuksi Extend 72 astetta 5 min. Monistetut tuotteet ajettiin elektroforeesilla 2,0-prosenttisella agaroosigeelillä (sisältää EB:tä) 1 x TAE-puskurissa ja tarkkailtiin ja valokuvattiin SYNGENE-geelikuvausjärjestelmässä.

1.5 Tilastot ja tietojen analysointi

Elektroforeesispektrissä reaktiotuotteen vastaavaa paikkaa geelissä verrataan molekyylipainostandardin mukaan ja amplifioidun tuotteen molekyylipaino arvioidaan. Bändi, jossa on kaista, tallennetaan arvoksi 1 ja kaista ilman kaistaa kirjataan 0, muodostaen 0/1 matriisikaavion ja syötetään tietokoneeseen käyttämällä POPGENE32:ta polymorfisten kohtien prosenttiosuuden laskemiseen (PPL) jokaisesta populaatiosta, Nein geenidiversiteettiindeksi (H), Shannonin polymorfismitietoindeksi (I), geenien erilaistumiskerroin (Gst), geenien monimuotoisuus (Ht),Geneettinen monimuotoisuus(Hs), Nein (1978) geneettinen identiteetti (I) ja geneettinen etäisyys (D) populaation sisällä sekä klusterianalyysi suoritettiin UPGMA-menetelmällä.

2. Tulokset ja analyysi

2.1 Cistanchen geneettinen monimuotoisuus

Kaikki näytteet saivat vyöhykkeitä, joiden molekyylipaino vaihteli välillä 200 - 2 200 bp (Kuva 1, 2). Yhteensä 76 lokusta havaittiin 60 näytteessä kahdesta populaatiostaCistanche deserticola, joista 36 oli polymorfisia lokuksia, mikä vastaa 47,37 prosenttia , H=0.135 8, I=0.207 2. Niistä Jimsarin PPL on 39,47 prosenttia ja Gilantyn 35,53 prosenttia. H on 0. 0 95 3 ja 0.1 070, ja I on 0.15 12 ja 0.163 7. Yhteensä 87 lokusta havaittiin {{20}} yksilössä neljästä Cistanchen populaatiosta, joista 24 oli polymorfisia lokuksia, mikä vastaa 27,59 prosenttia, H=0.084 8, I=0.1278. Korkein PPL oli Andil, 25,29 prosenttia, kun taas PPL oli alhaisempi Savuzekissa ja Yatungusissa (molemmat 19,54 prosenttia). H on 0.062 1 -0.080 0, I on 0.095 0 -0.116. H:n ja I:n koko on yhdenmukainen kunkin populaation PPL:n kokotrendin kanssa, ja kertoimet ovat suurimmat Andierissa, jota seuraa Dayan. Saman PPL:n tapauksessa Savuzekin H=0.{{40}} Summa I=0.097 0 on hieman suurempi kuin 0.{{44 }} ja 0.095 0 Yatunguskasta (taulukko 2).

Kuva 1 RAPD-vahvistetut vyöhykkeet joistakin aavikkonäytteistäCistanche deserticola, pohjamaali S490 1-10. Takuu näytteet; 11-20. Jimpster-näytteet M-DNA Marker (200 - 2 000 bp)

Kuva 2 Joidenkin Cistanche Tubulosan, alukkeen S2 042 1-20 näytteiden RAPD-monistetut vyöhykkeet. Xinjiang Andier -näytteen M-DNA-markkeri (200 - 2 000 bp)

Taulukko 2geneettinen monimuotoisuus/Cistanche deserticolajaCistanche tubulosapopulaatiot

2.2 Cistanchen geneettinen variaatioanalyysi

Tason mukaangeneettinen monimuotoisuuspopulaatioissa (Hs), populaatioiden välisessä erottelussa (Dst) ja populaatioiden välisten geneettisten erojen osuudessa geneettisissä kokonaiseroissa (Gst) voidaan nähdä, että Cistanche deserticola Ht:n geneettinen kokonaisdiversiteetti=0.{{ 1}}, jossa Hs=0.101 2, Gst =0.254 6. Cistanche Ht=0.082 2, josta Hs=0.067 8, Gst=0.175 5 (taulukko 3). Yllä olevat tulokset osoittavat, että populaatioiden välillä on tiettyä geneettistä vaihtelua. Cistanche deserticolan aavikkopopulaatioiden välinen vaihtelu vastasi 25,46 prosenttia kokonaisvaihtelusta ja Cistanche tubulosa -populaatioiden vaihtelu 17,55 prosenttia kokonaisvaihtelusta.

Taulukko 3 Geneettinen variaatioanalyysiCistanche deserticolajaCistanche tubulosa.

2.3 Cistanche deserticola -populaatioiden geneettinen etäisyys ja klusterianalyysi

Kahden populaation geneettinen etäisyysCistanche deserticolaon {{0}}.080 0 ja geneettinen identiteetti on 0.9231. Cistanchen neljän populaation geneettinen etäisyys oli 0.012 0-0.031 5 ja geneettinen identiteetti oli 0.9690-0.988 1 (Taulukko 4) . Cistanche deserticolan ja cistanche tubulosan yksilöiden klusterointi osoittaa, että Cistanche deserticola voidaan ryhmitellä kahteen erilliseen ryhmään populaation mukaan, kun taas cistanche tubulosan eri yksilöitä ei voida ryhmitellä populaation mukaan, mikä myös osoittaa, että Cistanche deserticolan geneettinen erilaistuminen väestömäärä on suhteellisen korkea. Suuri, mutta geneettinen erilaistuminen Cistanche tubulosan populaatioiden välillä on pieni.

Taulukko 4 Geneettinen identiteetti (alhaalla vasemmalla) ja geneettinen etäisyys (ylhäällä oikealla).cistanche tubulosa.

3. Keskustelu

3.1 Cistanchen geneettinen monimuotoisuus

Tasogeneettinen monimuotoisuuson erottamaton niiden biologisista ominaisuuksista, elinympäristöistä, alkuperästä ja evoluutiosta. Niistä eniten vaikuttavat jalostusjärjestelmä, levinneisyysalue, elämänmuoto sekä siitepölyn ja siementen leviämismenetelmät [6]. Ge Song et al.:n 499 kasvilajin allotsyymitietojen tilastollisten tulosten mukaan 165 suvussa. [7], Cistanchen polymorfismin pitäisi lajitasolla olla noin 50 prosenttia ja populaatiotason polymorfismin noin 40 prosenttia. Noin 0,17. Tässä kokeessa saadut polymorfismitasot ovat kaikki pienempiä kuin nämä keskiarvot. Samaan aikaan verrattuna polymorfisten lokusten tasoihin, jotka on saatu RAPD-menetelmillä useiden yleisten uhanalaisten kasvien osalta, kuten 32 prosenttia uhanalaisista lajeista Silver Fir [18], 22,5 prosenttia kääpiöpionista ja 27,6 prosenttia purppurapionista. [9] ] Voidaan nähdä, että geneettinen monimuotoisuusCistanche deserticola on hieman keskimääräistä alhaisempi, kun taas Cistanche tubulosan geneettinen monimuotoisuus on jo erittäin alhainen.

3.2 Syitä Cistanchen alhaiseen geneettiseen monimuotoisuuteen

Cistanche on erityinen loiskasvi, joka leviää kapeille autiomaa-alueille samanaikaisesti. Siksi ainutlaatuinen elämäntapa ja suhteellisen kapea asuinalue voivat olla luontainen syy siihen, miksigeneettinen monimuotoisuusCistanche on yleensä pienempi kuin tavallisten kasvien.

Ero siinägeneettinen monimuotoisuusCistanche deserticolan ja Cistanche tubulosan välillä voi olla yhteys näiden kahden levinneisyysalueen eroihin ja siihen, ovatko ne synkronoituja isäntäjakauman kanssa. Cistanche tubulosan levinneisyysalue on huomattavasti pienempi kuin Cistanche deserticolan, ja sen levinneisyys on erittäin epätahdissa isäntäkasvin kanssa. Tutkimukset ovat osoittaneet, että Tamarix-lajeissa on runsaasti monimuotoisuutta. Esimerkiksi Zhang Juan et ai. raportoi, että Tamarix sibiricuksen geneettinen monimuotoisuus oli peräti 98,7 prosenttia [10], kun taas Cistanchen geneettinen monimuotoisuus on erittäin heikko, mikä osoittaa pitkän aikavälin evoluutiota. Cistanche tubulosa on saattanut kokea vakavia pullonkauloja historiassa, mikä on johtanut suuren määrängeneettinen monimuotoisuus.

Samaan aikaan tutkimusten mukaan todettiin, ettei mikäänCistanche deserticola20 kilometrin säteellä ihmisasutuksia voitaisiin kaivaa esiin ja kukkia normaalisti. Cistanchen suuret ja pienet kuopat kaivettiin erityisesti Cistanche-putkikukan tärkeimmiltä tuotantoalueilla. Siksi se johtui suuresta kaivamisesta. Alkuperän puute ja elinympäristön tuhoutuminen voivat olla tärkeimmät ihmisen aiheuttamat syyt alhaisuuteengeneettinen monimuotoisuusCistanchesta.

3.3 Cistanchen geneettinen erilaistuminen

Xinjiangin ja Sisä-Mongolian välisen maantieteellisen etäisyyden vuoksi maantieteellinen eristyneisyys aiheutti eron ja eristyneisyydenCistanche deserticolapopulaatiot, ja nämä kaksi populaatiota muodostivat erilaisia ​​geneettisesti erilaisia ​​ekotyyppejä johtuen niiden sopeutumisesta paikallisiin elinympäristö-olosuhteisiin. Sen kapea levinneisyysalue ja tiheä geenivaihto populaatioiden välillä johtuu populaatioiden välisestä geneettisestä erottelusta vähemmän kuin Cistanche deserticolalla.

3.4 Suositukset Cistanchen suojelemiseksi

Geneettinen monimuotoisuuson edellytys lajien pitkäaikaiselle selviytymiselle sukupuuttoon estämiseksi. Vähennysgeneettinen monimuotoisuusvähentää väestön kykyä sopeutua ympäristön muutoksiin sekä lyhyellä että pitkällä aikavälillä [11]. Siksi Cistanchen geneettisen monimuotoisuuden suojeleminen on erittäin tärkeää tämän harvinaisen ja arvokkaan kiinalaisen lääketieteen suojelemiseksi. Koska Cistanche on laji, jolla on erityinen ekologinen tyyppi, sitä tulisi suojella pääasiassa in situ ja Cistanchen luonnonsuojeluperusta tulisi perustaa sen geneettisen monimuotoisuuden mukaan. Esimerkiksi vartenCistanche tubulosa, koska geneettinen monimuotoisuus tulee pääasiassa populaation sisältä, populaatiot, joilla on suuri geneettinen monimuotoisuus, ovat ensisijaisia ​​suojelukohteita [12], kuten Minfengin Angier ja Yutianin Daheyan. Se on listattu Cistanchen luonnonsuojelualueeksi. Mitä tuleeCistanche deserticola, Sisä-Mongolian ja Xinjiangin populaatiot ovat kokeneet merkittäviä muutoksia, joten kokeellista tutkimusta tulisi edelleen vahvistaa, jotta voidaan määrittää populaatiot, jotka ovat etusijalla suojelun kannalta. Samanaikaisesti suorittaa perustutkimusta Cistanchen lisääntymisbiologiasta ja pölytysekologiasta saadakseen tietoa sen lisäsuojelua varten.

Viitteet

[1] He Yanping, Yin Zhezhu, Tu Pengfei ym. TunnistusCistancheja kaupallisten lääkemateriaalien tutkiminen. Chinese Medicinal Materials, 1997, 20(3):117.

[2] Liu Mingting. Tamarix-kasvien kattava tutkimus ja yleinen sovellus. Lanzhou: Lanzhou University Press, 1995.

[3] Fu Guoli. Kiinan kasvien punainen kirja. Peking: Science Press, 1992.

[4] Kiinan kansantasavallan uhanalaisten lajien tuonnin ja viennin hallintotoimisto, Kiinan kansantasavallan uhanalaisten lajien tiedekomitea. Yleissopimus uhanalaisten luonnonvaraisten eläimistö- ja kasvilajien kansainvälisestä kaupasta (CITES), liite II. 2003.41.

[5] Zou Yuping, Wang Xiaoquan, Lei Yiding et ai. Useiden uhanalaisten kasvien ja niiden sukulaisten kokonais-DNA:n erottaminen ja tunnistaminen. Acta Botany, 1994, 36:528.

[6] Wang Hongxin, Hu Zhiang. Kasvinjalostusjärjestelmä, geneettinen rakenne ja suojelugeneettinen monimuotoisuus. Biodiversity, 1996, 4(2): 92.

[7] Chen Jiakuan, Yang Ji. Kasvien evoluutiobiologia. Wuhan: Wuhan University Press, 1994.

[8] Wang Xiaoquan, Zou Yuping, Zhang Daming, et ai. Kuusen geneettisen monimuotoisuuden RAPD-analyysi. Chinese Science (C), 1997, 40(2): 145.

[9] Pei Yanlong, Zou Yuping, Yin Zhen et ai. Alustava raportti kääpiopionin ja violetin pionin RAPD-analyysistä. Chinese Journal of Plant Taxonomy, 1995, 33(4): 350.

[10] Zhang Juan, Yin Linke, Zhang Daoyuan. Alustava tutkimus aiheestaGeneettinen monimuotoisuusTamarix-lanseolaatin luonnollisista populaatioista. Yunnan Botanical Research, 2003, 25(5):557.

[11] Ellstrand NC, Elam D R. Pienen populaation koon populaatiogenetiikan seuraukset: Vaikutukset kasvien suojeluun. Annual Review Ecology and Systematics, 1993, 34:217.

[12] Liu Zhanlin, Zhao Guifang. Populaatiogenetiikan periaate ja sen soveltaminen harvinaisten ja uhanalaisten kasvien suojelussa. Biodiversity, 1999, 7(4): 340.

Lähettäjä: China Journal of Chinese Materia Medica; Voi. 29, painos 8. elokuuta 2004