Cistanchen vaikutukset neurotoksiinin 1-metyyli-4-fenyylipyridiniumin (MPP) indusoimiin apoptoosi dopaminergisiin neuroneihin

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Perinteinen kiinalainen lääketiede ja kiinalainen Materia Medica -tutkimuskeskus Xijingin sairaalassa, FMMU, Xi'an 710032)

Abstrakti

Objektiivi: Tutkia vaikutuksiaCistanche primaariviljelmässä dopaminergiset neuronit apoptoosisolut, joita indusoi 1-metyyli-4-fenyylipyridinium (MPP+).Menetelmä: Kanin seerumin valmistamiseksi, joka koostuuCistanchekäyttää seerumin farmakologian menetelmää. Määritä sitten Cistanchen vaikutukset DA-neuronien apoptoosisoluunMPP+indusoidut mallit, joissa käytetään morfologista, virtaussytometriaa, TUNEL-värjäystä.Tulos: Käsittely 200 μmol/lMPP+24h tai pidempään indusoidulle apoptoosille DA-neuroneissa. JälkeenMPP+käsitelty, Cistanchen seerumin ekvivalenttiannos sisältävän ryhmän apoptoosisuhde on 6,3%, ryhmäMPP+yksin hoidettuna on 30,2%. B- ja C-ryhmän apoptoosisolujen lukumäärä on merkittävästi pienempi kuin E-ryhmä (P<0.05).>Johtopäätös: Seerumi sisälsiCistanchesuojatut apoptoosi DA-neuronit, jotka on indusoituMPP+.

Avainsanat：Cistanche;1-metyyli-4-fenyylipyridinium(MPP+); dopaminergiset neuronit; apoptoosi

Tällä hetkellä päähoitoParkinsonin taution levodopa-yhdisteiden (L-dopa) valmisteiden korvaushoito, joka ei voi hallita taudin kehittymistä. Taudin edetessä annosta lisätään, ja yleisesti ottaen 3–5 vuoden kuluessa parantava vaikutus vähenee, motoriset oireet vaihtelevat ja lääkkeen aiheuttamia dyskinesioita ilmaantuu. Viimeaikaisissa tutkimuksissa on havaittu, että L-dopalla on apoptoosin in vitro viljeltyjen hermosolujen vaikutus[1, 2], ja sitten on ehdotettu, että endogeenisen dopamiinin neurotoksinen vaikutus johtaa dopaminergisten hermosolujen menetykseenParkinsonin tauti. Yksi syy [3]. Pitkäaikaisessa kliinisessä käytännössä olemme käyttäneet kiinalaista lääketiedettäravitsee maksaa ja munuaisiayhdistettynä levodopavalmisteisiin PD: n hoitoon ja saavutti hyviä tuloksia [4-6]. Tässä kokeessa tutkittiin perinteisen kiinalaisen lääketieteen suojaavaa vaikutusta dopaminergiseen neuroni-apoptoosiin ja sen mekanismiin molekyyli- ja solutasoilta.

1. Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit

DMEM-väliaine,1-metyyli-4-fenyylipyridini um, MPP+, Gibco-yhtiöltä ostettu sikiön naudanseerumi.Sytarabiini, poly-l-lysiini, PLLostettiin Sigma Companylta. 24-kuoppainen viljelylevy, 25cm2

Muoviset viljelypullotostettiin NUNC Companylta.Kiinalainen lääketiedemeitä käytettiin, ostettiin Xi'an Decoction Piece Factorysta. Eläimiä, joita käytimme, tarjoaa koulun eläinkeskus.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Lääkeseerumin valmistus ja kokeellinen ryhmittely

Cistanche valmistetaan pakastekuivattuna jauheena säilöntää varten ja laimennetaan tislatulla vedellä käytettäessä. Eläinseerumi valmistettiin Uuden-Seelannin isokorvaisesta valkoisesta kanistaseerumi, jotka kaikki olivat terveitä miehiä, jotka painoivat 2,5-3,0 kg. Eläinten ekvivalenttiannos muunnetaan kehon pinta-alan mukaan ja jaetaan satunnaisesti tyhjään kontrolliryhmän seerumiin; 1/2 ekvivalenttiannosryhmän seerumi (mitta-annos Cistanche-raaka-ainetta 0,8 g/kg); ekvivalenttiannosryhmäseerumi(Gavage-annos on Cistanche cistanche -etäisyysperäinen alkuperäinen lääkemateriaali 1,6 g/kg); 2 kertaa ekvivalenttiannosseerumi(gavage-annos on Cistanchen alkuperäinen lääkevalmisteaine 3,2 g/kg). Gavage kahdesti päivässä yhteensä 3 päivän ajan, 1 tunti viimeisen suukapulan jälkeen, kaulavaltimon verenlasku, yön yli 4 °C:ssa, sentrifugointi 2500 r/min 25 minuutin ajan, seerumin huolellinen erottaminen, inaktivointi 56 °C:ssa 30 minuutin ajan ja imu 0,22 μm:n suodatinkalvon läpi Suodata bakteerit pois ja säilytä -20 °C:ssa. Samoissa olosuhteissa tyhjä kanin kontrolliseerumi valmistettiin villillä, jossa oli yhtä suuri määrä normaalia suolaliuosta. Kokeilu jaettiin 5 ryhmään. Ryhmä A oli tyhjä kaniseerumikulttuurin kontrolliryhmä; Ryhmä B oli aseerumin kulttuuri + MPPhoitoryhmä, joka sisältää 2 kertaa ekvivalenttiannoksen; Ryhmä C oli aseerumin kulttuuri + MPPhoitoryhmä, joka sisältää ekvivalenttiannoksen; Ryhmä D oli seerumin viljelyn kontrolliryhmä, joka sisälsi 1/2 ekvivalenttiannoksen seerumiviljelmää + MPP-hoitoryhmää; E-ryhmä on tyhjä kanin seerumiviljelmä + MPP-hoitoryhmä.

Cistanche-etu

1.3 Keskiaivojen dopaminergisten neuronien viljely

Kolme SD-rottaa, joilla oli 14 raskauspäivää, valittiin ja tapettiin suoralla ilmaembolian injektiolla sydämeen; alkion rotat otettiin pois aseptisissa olosuhteissa ja laitettiin petrimaljaan, joka oli täytetty D-Hanks-jääliuoksella. Sikiön rotan aivokudos leikattiin ja erotettiin stereomikroskoopilla. Vertailumenetelmää [7] parannettiin hieman. Aivokalvot ja verisuonikudos irrotettiin, ja vatsan keskiaivojen A8-, A9- ja A10-alueiden kudokset erotettiin toisistaan. Lisää 1 ml 0,125- prosenttista pankreatiinia ja aseta se 37 °C:n inkubaattoriin noin 20 minuutiksi, lisää sopiva määrä kasvatusväliainetta, joka sisältää 10% sikiön naudan seerumia ruoansulatuksen lopettamiseksi, ja käytä aspiraatiota

Pipetoidaan putki tasaiseksi solususpensioksi, sentrifugoidaan 1500r/min 5 minuutin ajan huoneenlämmössä, poistetaan supernatantti varovasti, pipetoidaan 15 kertaa ohutkaulaisella pipetillä ja annetaan sen seistä 5 minuuttia. Lisää lysiinin 24-kuoppaisessa viljelylevyssä viljelyväliainetta kuhunkin kuoppaan solutiheyden säätämiseksi 2×105 soluun/ml, lisää viljelyväliaine 0,5 ml:aan kuoppaa kohti ja lisää sytarabiinia 3 päivän viljelmän jälkeen (lopullinen pitoisuus on 10 μmol/l), estää ei-neuronien kasvua.

1.4 Tyrosiinihydroksylaasi (TH) immunosytokemiallinen värjäytyminen

SABC-menetelmää käyttäen vasta-aine laimennusaine sisältää naudan seerumin albumiinia 1g/100 ml (Boster Company, Wuhan), 0,3% Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80 mg/100 ml, laimennettuna PBS:llä 100 ml:aan, säätää pH:n arvoon 7,6. Viljelmä lopetettiin 7. päivänä, pestiin D-PBS: llä 5 minuutin ajan 3 kertaa, juuri valmistettu 4% paraformaldehydiä kiinnitettiin huoneenlämpötilaan 30 minuutin ajan ja pestiin D-PBS: llä 5min 3 kertaa; 1:1:8 vetyperoksidilla, metanolilla ja PBS-liuoksella Inkuboi 30 minuuttia huoneenlämmössä, huuhtele D-PBS:llä 5 minuutin ajan, lisää 5% estävää vuohen seerumia 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, huuhtele D-PBS:llä 5 minuutin ajan ja lisää vuohen anti-hiiren TH-vasta-aine, joka on laimennettu vasta-aine-laimennusaineella (1:1000 laimennus, Calbiochem) ), yön yli 4 °C:ssa, huuhtele D-PBS:llä 3 min 3 kertaa, lisää biotinyloitua hiiren rotanvastaista IgG: tä, joka on laimennettu vasta-aine-laimennusaineella (laimennettu 1:200, Sigma USA), toimi huoneenlämmössä 4 tuntia, huuhtele D-PBS: llä 3 min 3 kertaa, lisää vasta-aineella laimennettu HRP-kompleksi 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja huuhtele D-PBS: llä 3 minuutin ajan 3 kertaa. Huuhtele DAB-laimennusainetta 3 minuutin ajan, lisää käyttövalmis DAB-kromogeeninen reagenssi (Wuhan Boster Company) soluihin ja tarkkaile väriä käänteisen mikroskoopin alla.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Huumeiden käsittely

Viljeltyjen neuronien morfologiset havainnot tehtiin vaihekontrastimikroskoopilla joka päivä ja muutokset tallennettiin valokuvilla. 12 tunnin viljelyn jälkeen soluja havaittiin käänteisen mikroskoopin alla ja lääkkeet lisättiin juuri ennen yhtymäkohtaa. Kunkin ryhmän seerumipitoisuus oli 10%. 3 päivän viljelyn jälkeen MPP+ lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 200 μmol/l. Kun olet inkuboinut 37 ° C: ssa, 5% CO2-inkubaattorissa 24 tunnin ajan, suorita erilaisia tarkastuksia.

Cistanche

1.6 Virtauksen sytometrian havaitseminen

Lääkehoito oli sama kuin ennenkin. Jokaisen ryhmän käsittelyn jälkeen pysyvät PC12-solut pilkottiin 0,125%: lla trypsiinillä ja solut otettiin noin 1×106 PBS: llä. Solut pestiin kahdesti, ja 490 μl sitoutumispuskuria lisättiin, ja solut sekoitettiin perusteellisesti ja lisättiin 5 μl liitettä V. FITC ja 10 μl liuennutta PI:tä solususpensiossa, sekoitetaan varovasti, laitetaan koeputki 4 °C:seen, inkuboidaan 10 minuutin ajan pimeässä ja testataan COULTER EPICS -virtaussytometrillä (Beckman Coulter, USA).

1.7 In situ -loppumerkintä (TUNEL) solujen apoptoosin havaitsemiseksi

Viljeltyjen hermosolujen DNA in situ -loppumerkintä käyttää Bosterin apoptoosin havaitsemissarjaa (MK1022), ja vaiheet ovat seuraavat: Ota kunkin ryhmän dopaminergiset neuronisolut MPP+ -hoidon jälkeen (liukumäki ennen primaariviljelmää esiviljelty polymeerilysiinikäsittelyllä), kiinnitetään 40 g/ l paraformaldehydillä 1 tunnin ajan, tuore 3% etikkahappoa (pH2,5) huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, neutraloidaan emäksinen fosfataasi, lisätään 0,1mol/l TBS (pH7,5 ) 1:200 juuri laimennettua proteinaasi K:n hajoamista 37 °C:ssa 20 sekunnin ajan, lisätään 1 μl TdT:tä ja DIG-d-UTP:tä kumpaankin levyyn ja 18 μl puskuriliuosta 2 tunnin ajan 37 °C:ssa; lisätään 50μl estoliuosta jokaiseen levyyn huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan; Lisätään 50μl biotinyloitua anti-digoksigeniinivasta-ainetta, joka on laimennettu estoliuoksella; reagoi 30 minuutin ajan märässä laatikossa 37 °C:ssa; lisätään 50μl SABC-AP:tä, joka on laimennettu 0,1mol/l TBS:llä jokaiseen levyyn; BCIP/NBT (0,1mol pH9,5 /L TBS laimennettuna 1:20) lisättiin näytteeseen värin kehittämiseksi 30 minuutin ajan; Samanaikaisesti fotomikrografiassa ja käänteisessä faasikontrastimikroskoopissa (200×) käytettiin vaihtoehtoista kontrollia (TdT-puskuria TdT-puskuria TdT/biotiini-dUTP-seoksen sijasta) Tarkkaile apoptoottisia soluja. Laske positiiviset solut faasikontrastimikroskoopilla, laske 5 kenttää kuoppaa kohti kussakin ryhmässä, yhteensä 6 kaivoa.

2. Kokeelliset tulokset

2.1 Viljeltyjen neuronien morfologinen havainto

OlympusIX70-vaihekontrastimikroskoopilla havaittu: 5h inokuloinnin jälkeen suurin osa soluista tarttuu seinään, solut ovat hajallaan, solurunko on pyöreä, ydin on näkymätön ja taitekerroin on vahva. 24 tunnin viljelyn jälkeen solujen ulkonemat kasvoivat ja vähitellen pidentyivät. 48 tunnin kohdalla suurin osa soluista työntyi ulos haarautuneilla rihmamaisilla ulkonemilla. Solumorfologia oli monipuolinen, mikä oli kaksisuuntaista mielialahäiriötä, tripolaarista ja moninapaista ja muodosti vähitellen harvan verkon. Solun runko oli laajentunut, pyöreä ja elliptinen. MPP+ -vamman jälkeen solut turposivat ensin, taitekerroin nousi, solut olivat rappeuttavassa tilassa ja solut lopulta kutistuivat ja putosivat. Kiinalaisia lääkkeitä sisältävän seerumin eri annoksilla on suojaavia vaikutuksia MPP+ -vammoihin. Kun viljelmä oli värjätty TH-immuunisoluilla, nähtiin, että TH-positiiviset solut olivat ruskeita ja neuriitin kasvu. Kun olet lisännyt perinteisen kiinalaisen lääketieteen seerumin ekvivalenttiannoksen, TH-positiivisen osuusNeuronienvoi saavuttaa 55% ~ 60%.

2.2 Virtaussytometriakokeiden tulosten analyysi (ks. kuva 1)

Fosfatidyyliseriini (PS), joka sijaitsee solukalvon sisällä apoptoosin alkuvaiheessa, siirtyy solukalvon ulkopuolelle. Fosfatidyyliä sitova proteiini V (liite V) on kalsiumista riippuvainen fosfolipidiä sitova proteiini, jolla on suuri affiniteetti PS:hen. Siksi liitettä V voidaan käyttää koettimena solukalvon pinnalla altistuneen PS: n havaitsemiseksi. Samaan aikaan yhdistettynä PI-poissulkemismenetelmään kaksinkertaiseksiVärjäysapoptoottisista soluista apoptoottiset solut voidaan havaita virtaussytometrialla. Kuvan 1 oikeassa alakulmassa (FITC+/PI-) näytetään kunkin ryhmän apoptoosin yksityiskohdat. Solujen osuus, kunkin ryhmän apoptoosinopeus oli 4,1%, 5,8%, 6,3%, 28,6%, 30,2%.

2.3 TUNEL-värjäystulosten analyysi

Ne, joilla on sini-violetteja hiukkasia ytimessä, ovat positiivisia soluja eli apoptoottisia soluja. Apoptoottisten solujen osuus kussakin ryhmässä laskettiin valomikroskoopilla. Apoptoottisten solujen lukumäärä näkökenttää kohti kussakin ryhmässä olivat: Ryhmä A 2.13±0.34; Ryhmä B 4.92±0.67; Ryhmä C 6.20±1.47; Ryhmä D 10.33±1.51; Ryhmä E 12.74±2.51. Jälkeent-testin analyysi,B- ja C-ryhmiä verrattiin E-ryhmään (P<0.05). the="">Tuloksetovat pohjimmiltaan yhdenmukaisiavirtaussytometrian tulokset.

3. Keskustelu

Parkinsonin tautikuuluu kiinalaisen lääketieteen "vapinaoireyhtymän" luokkaan. Perinteinen kiinalainen lääketiede uskoo, että PD: n alkaminen on enimmäkseen sarja ilmenemismuotoja maksan ja munuaisten asteittaisesta ehtymisestä vanhuksilla ja aivojen luuytimen meridiaanin ravinnon menetyksestä. Tärkein hoito onravitsee maksaa ja munuaisia, rauhoittaa maksaa ja poistaa tuulen. Perinteisellä kiinalaisella lääketieteellä voi olla tarkoitus "toksisuuden vähentäminen ja tehon lisääminen" hoidossaParkinsonin tauti, mutta sen toimintamekanismi ei ole tällä hetkellä kovin selkeä. Suuri määrä kokeellisia todisteita nykyaikaisessa lääketieteessä osoittaa, että oksidatiivinen stressi on yksi tekijöistä, jotka aiheuttavat PD-hermosolujen kuoleman [3]. Tutkimuksissa on havaittu, että istanchen glykosidit voivat tehokkaasti poistaa erilaisia reaktiivisia hapettomia radikaaleja ja suojata DNA:ta OH:n aiheuttamalta hapettumiselta[8]. Cistanche-uute tubulosidi B voi vaimentaa sytotoksisuutta, jonka aiheuttaaMPP+,heikentää reaktiivisten happilajien kertymistä soluun ja niillä on antagonistinen vaikutus apoptoosiin ja oksidatiiviseen stressiin, jonka aiheuttaaMPP+[9]. Perinteinen kiinalainen lääketiede voi aktivoida ja vahvistaa omaa suojaavaa signaalireittiään, vastustaa ulkoisia vaurioita ja palauttaa tasapainonsa. Tämä on yksi perinteisen kiinalaisen lääketieteen nykyaikaistamisen tavoitteista. Dopamiinin korvaushoidon jälkeen ihmiset arvostavat nyt yleensä neuroprotektiivista hoitoa, jota kutsutaan toiseksi vallankumoukseksi hoidon hoidossaParkinsonin tauti. Tässä kokeessa eristettyjä keskiaivojen dopaminergisiä hermosoluja viljeltiin seerumia sisältävällä kiinalaisella lääkkeellä, ja havaittiin, että Cistanchella on tietty neuroprotektiivinen vaikutus. Tässä kokeessa käytettiin kahta virtaussytometrian ja TUNEL-värjäyksen havaitsemismenetelmää samanaikaisesti sen toteamiseksi, että ekvivalenttiannosryhmän seerumi ja Cistanche-lääkeseerumiviljelmän 2-kertainen ekvivalenttiryhmän seerumi voivat vähentää primaarista viljeltyä keskiaivojen dopamiinihermoa, jonka aiheuttaaMPP+Apoptoottisten solujen lukumäärällä on tietty suojaava vaikutus apoptoottisiin soluihin. Perinteinen kiinalainen lääketiede voi suojata dopaminergisiä neuroneja vaurioilta varhaisessa vaiheessa, mikä on tärkeämpi toimenpide kuin muut hoidot. Tässä mielessä kiinalaisen lääketieteen kokonaisvaltainen hoito on parannuskeino perimmäiseen syyhyn, ja sitä voidaan pitää yhtenä neuroprotektiivisista hoidoista, joita ihmiset arvostavat tällä hetkellä.

Viittaukset

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, ym. Levodopa indusoi apoptoosia viljellyissä hermosoluissa - mahdollinen nigrostriataalisen rappeutumisen kiihdytin Parkinsonin taudissa? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Levodopan neurotoksisuus: kokeelliset tutkimukset vs. kliininen merkitys. Neurologia,1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Solukuolema Parkinsonin taudissa. J Neurol, 2002,249(Suppl 2): II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et ai. Kliininen havainto Parkinsonin taudin hoidosta maksan ja munuaisten toiminnalla: raportti 60 tapauksesta. Chengdun perinteisen kiinalaisen lääketieteen yliopiston lehti, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang jne. Kliininen havainto 40 Parkinsonin tautitapauksesta, joita hoidetaan maksan ja munuaisten ravitsemismenetelmällä. Kiinalaisen lääketieteen tutkimus, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et ai. Pingchan nro 1 suun kautta otettava neste 40 Parkinsonin tautitapauksen hoidossa. Anhuin perinteisen kiinalaisen lääketieteen korkeakoulun lehti, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, ym. Tyrosiinihydroksylaasipositiivisten solujen suuri saanto rotan E14 mesenkefaalisoluviljelmästä. Aivoressi,1992,586 (2):319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et ai. Vapaiden radikaalien in vitro -raivaus ja suojaavat vaikutukset OH·n aiheuttamiin DNA-vaurioihin, jotka johtuvat cistanchen glykosidien kokonaisglykosideista. Chinese Pharmaceutical Journal, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L,et ai. Tubuloside B Cistanche salsasta Pelastaa PC12-hermosolut 1-metyyli-4-fenyylipyridinium-ionin aiheuttamasta apoptoosista ja oksidatiivisesta. Stressi.Planta Med,2002,68(11):966