Lepisorus Thunbergianuksen kofeoyylikiinihappojen ja niiden melanogeneesiä estävän vaikutuksen karakterisointi

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* ja Kooyeon Lee*

ABSTRAKTI:Tyrosinaasin yliaktivoitumisesta johtuva hyperpigmentaatio johtaa tummempiin pisteisiin tai laikkuihin ihmisen iholla. Vaikka nämä ilmiöt ovat vaarattomia, melanogeneesin estäjille on edelleen suuri kysyntä estämään hyperpigmentaatiota estämällä tyrosinaasia, melanogeneesin nopeutta rajoittavaa entsyymiä. Vaikka Lepisorus thunbergianusta on käytetty kansanlääkkeissä diureettisena ja hemostaattisena aineena, sen vaikutusta melanogeneesiin ei ole vielä raportoitu. Tässä tutkimuksessa valmistimme L. thunbergianus -uutetta ja sen liuotinfraktioita ja arvioimme niiden biologista aktiivisuutta vapaiden radikaalien ja melaniinin synteesiä vastaan. L. thunbergianuksen uute esti sienen tyrosinaasin aktiivisuutta tehokkaammin kuin arbutiini ja samalla antioksidanttiaktiivisuudella kuin arbutiini in vitro. L. thunbergianuksen liuotinfraktioiden melanogeneesin ja tyrosinaasivastaisen aktiivisuuden vertaileva arviointi osoitti, että tyrosinaasiaktiivisuutta inhiboimalla butanolifraktiolla on suurin potentiaali melanogeneesin melanoomasolujen inhiboimiseksi. Havaitsimme rakenneanalyysillä käyttämällä korkean suorituskyvyn nestekromatografiaa (HPLC) ja NMR-spektroskopiaa, että tärkeimmät yhdisteet butanolifraktiossa olivat kolme kofeoyylikiinihappojohdannaista. Näillä kolmella johdannaisella oli samanlainen radikaaleja poistava ja tyrosinaasivastainen aktiivisuus in vitro, kun taas vain 5-kofeoyylikiinihapolla oli estävä vaikutus -MSH:n aiheuttamaan melanogeneesiin. 5-Kofeoyylikiinihapon estovaikutus varmistettiin määrittämällä melaniinipitoisuus ja tyrosinaasiaktiivisuus melanoomassa sen jälkeen, kun soluja oli käsitelty kaupallisella yhdisteellä. Lisäksi paljastimme, että 5-kofeoyylikiinihappo esti melanogeneesiä kelatoimalla kupari-tyrosinaasikompleksista kuparikationin. Siten L. thunbergianuksesta erotettu 5-kofeoyylikiniinihappo tai butanoli voivat olla hyödyllisiä kosmetiikassa ihon valkaisuaineena.

Cistanche tubulosa: ihoa valkaiseva aine.

JOHDANTO

Melaniinilla, ryhmällä luonnollisia pigmenttejä, joita löytyy useimmista organismeista, on tärkeä rooli hedelmien, sienten ja vihannesten ruskistuksessa sekä ihmisen ihon pigmentaatiossa.1 Melaniinia valmistetaan aminohappotyrosiinista monivaiheisella prosessilla, joka sisältää entsymaattisen hapettumisen ja polymeroinnin. 2 Epäihmisillä melaniinipigmenttiä syntetisoivat erikoistuneet dendriittisolujen melanosyytit, jotka sijaitsevat orvaskeden ja dermiksen liitoskohdassa ja joissa synteesi käynnistyy altistumisesta ultraviolettisäteille (UV-säteille).3 Melaniinipigmenttiä kuljetetaan keratinosyytteihin suojaamaan ihoa UV-säteiltä ja vapailta radikaaleilta; näin ollen ihon väri määräytyy melaniinipigmentin jakautumiskuvion mukaan.2 Säätelyhäiriöt Inmelaniinin synteesi johtaa moniin hyperpigmentaatiomuotoihin, kuten melasmaan, pisamioihin, ikääntymiseen, auringon lentigoon, tulehduksen jälkeiseen hyperpigmentaatioon ja muihin hyperpigmentaatiooireyhtymiin.4 Enemmän kuin sata proteiinia liittyy tomelaniinin synteesiin, ja niiden joukossa tyrosinaasi on nopeutta rajoittava entsyymi, jonka tunnustetaan olevan vastuussa formelaniinin synteesistä.5 Siten useimmat hyperpigmentaatiota ehkäisevät tutkimustyöt keskittyvät uusien voimakkaiden aineiden tunnistamiseen, eristämiseen, synteesiin ja karakterisointiin. tyrosinaasin estäjät melanogeneesin estämiseen.1,6 Useita tyrosinaasin estäjiä, kuten kojiinihappo, arbutiini, hydrokinoni, atselaiinihappo, ellagiinihappo ja traneksaamihappo, on käytetty yleisesti kosmetiikkateollisuudessa melanogeneesin vastaisina aineina; Kuitenkin kemiallisten lääkkeiden rajoituksista johtuen, mukaan lukien sytotoksisuus ja sivuvaikutukset, on edelleen kysyntää uusille materiaaleille, joilla on parempi turvallisuus, stabiilisuus ja teho.7

Luonnontuotteista, mukaan lukien kasvit, bakteerit ja sienet, on tullut vaihtoehtoisia lähteitä tehokkaiden ihoa valkaisevien ainesosien löytämiselle niiden vähäisemmän myrkyllisyyden ja paremman biologisen yhteensopivuuden ja biologisen hyötyosuuden vuoksi.1,8 Lepisorus thunbergianusis on Polypodiaceae-heimoon kuuluva saniainen, joka kasvaa kiinnittyneenä vanhoihin kiviin. tai puiden kuorta ja sitä esiintyy Itä-Aasian lauhkeilla alueilla, kuten Koreassa, Japanissa, Kiinassa, Filippiineillä ja Indokiinassa. L. thunbergianusta on käytetty adiureettisena, hemostaattisena aineena ja se on yskää hillitsevä korealaisissa kansanlääkkeissä. Aiemmissa tutkimuksissa on raportoitu, että L. thunbergianus -uutteella on paikallinen anti-lipidiperoksidaatiovaikutus paikallisessa ja antioksidanttisessa aktiivisuudessa.9 Lisäksi L. thunbergianus -uutte osoitti merkittävää pitoisuudesta riippuvaa kasvun estymistä suusyöpä- ja paksusuolensyöpäsoluissa.10 L. thunbergianus-uutteella voi olla potentiaalisia käyttökohteita. kosmetiikkateollisuudessa, koska tämä kasvi sisältää erilaisia ​​flavonoidiyhdisteitä ja lukuisia bioaktiivisia molekyylejä, joihin kuuluvat kvertsetiini-3-metyylieetteriglukosidi, viteksiini, itämainen, kausi-glukosidi, isoviteksiini, orientiini, korentiini ja kofeoyylikiniinihappo.9a Kuitenkin L. thunbergianus -uutteen onmelaniinin synteesi melanosyyteissä on vielä selvittämättä.

Kuva 1. L. thunbergianus -uutteen analyysi (A) ABTS:n radikaalinpoiston, (B) antityrosinaasin ja (C) solunsisäisen ROS-puhdistusaktiivisuuden suhteen

Tässä tutkimuksessa valmistimme L. thunbergianus -uutetta ja sen liuotinfraktioita sarjafraktioinnilla ja tutkimme liuotinfraktioiden estäviä vaikutuksia melaniinin biosynteesiin B16F10-melanoomasoluissa. Tunnistamme butanoli- (n-BuOH) -fraktion pääosan sisältäväksi luonnollista inhibiittoria ja karakterisoimme edelleen L. thunbergianus -uutteista eristettyjen kofeoyylikiniinihappojohdannaisten vaikutukset melaniinin biosynteesin estämiseen.

cistanche-arvostelu: antioksidantti

TULOKSET JA KESKUSTELU

L. thunbergianuksen etanoliuute Scavenges 2,2'-Azinobis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo (ABTS)radikaali ja estää tyrosinaasiaktiivisuutta.

L:n uuttaminen. thunbergianus 70-prosenttisella etanolilla (EtOH) suoritettiin arvioimaan kasvin luonnollisten yhdisteiden mahdollista estoaktiivisuutta. L.thunbergianus-uutteen radikaaleja poistava aktiivisuus määritettiin pitoisuusalueella 2-200 ug/ml. Etanoliuutte osoitti pitoisuudesta riippuvaa radikaaleja poistavaa aktiivisuutta maksimaalisella vaikutuksella pitoisuudessa 50 ug/ml, jossa tulos oli yhdenmukainen positiivisena kontrollina käytetyn arbutiinin kanssa (kuvio 1A).

Arvioimme myös uutteen estävän vaikutuksen sienen tyrosinaasin aktiivisuuteen mittaamalla tyrosinaasin katalysoiman dopakromisynteesin nopeutta. Etanoliuute esti 87 prosenttia tyrosinaasiaktiivisuudesta pitoisuudella 500 ug/ml, kun taas arbutiini esti vain 38 prosenttia tyrosinaasiaktiivisuudesta samalla pitoisuudella (kuvio 1B). Sitten arvioimme uutteen poistamisaktiivisuutta solunsisäisellä ROS:lla, joka lisääntyi 100 μM vetyperoksidilla. Käsittely vetyperoksidilla nosti B16F10-solujen solunsisäistä ROS-tasoa noin 2{7}-kertaiseksi (kuva 1C). Havaitsimme, että vetyperoksidivälitteinen solunsisäisen ROS:n lisääntyminen poistui uutteesta annoksesta riippuvaisella tavalla: maksimaalinen poistoaktiivisuus pitoisuudella 100 ug/ml oli 78 prosenttia (kuvio 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että L. thunbergianuksen etanoliuute sisältää bioaktiivisia ainesosia, jotka estävät tyrosinaasiaktiivisuutta sekä poistavat ABTS-radikaaleja ja solunsisäistä ROS:ää.

cistanche deserticola -uute: estää tyrosinaasin aktiivisuutta.

L. thunbergianuksen fraktioiden estopotentiaali melanogeneesiä vastaan.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, mikä on yhdenmukainen edellisen raportin kanssa.10b Lisäksi eri liuotinfraktioiden tyrosinaasiaktiivisuutta estävät vaikutukset lisääntyivät pitoisuudesta riippuvaisella tavalla: n-Hex- ja CH2Cl2-fraktioiden maksimaalinen estoaktiivisuus oli alle 65 prosenttia, mutta EtOAc:n ja n-BuOH-fraktiot olivat yli 70 prosenttia (kuvio 2B). Estoaktiivisuus oli luokkaa n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hydrofiilisemmat fraktiot, mukaan lukien n-BuOH- ja EtOAc-fraktiot, osoittivat voimakkaampaa radikaaleja poistavaa aktiivisuutta ja parempaa estoaktiivisuutta kuin lipofiiliset n-Hex- ja CH2Cl2-fraktiot. .

Seuraavaksi L. thunbergianuksen liuotinfraktioiden vaikutuksia melanoomasolujen lisääntymiseen tutkittiin käsittelemällä B16F10-soluja 200 ug/ml eri fraktioita tai 2 mg/ml arbutiinia. melanosyyttiä stimuloivan hormonin (-MSH) läsnäolo, jonka tiedetään hyvin edistävän melanogeneesiä mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF) induktion kautta.11 Tulokset osoittivat, että millään fraktioista ei ollut merkittävää vaikutusta melanoomasolujen lisääntymiseen (kuvio 2C). Sitten tutkimme liuotinfraktioiden estävää vaikutusta -MSH:n stimuloimaan melanogeneesiin melanoomasoluissa. -MSH-hoito aiheutti B16F10-solujen solunsisäisen melaniinipitoisuuden noin 2,{13}}kertaisen kasvun (kuva 2D). Havaitsimme, että n-BuOH-fraktio esti täysin -MSH-välitteisen melanogeneesin (p < 0,01)="" ja="" osittain="" etoa-fraktio="" (40="" prosenttia,="" p="">< 0,01),="" kun="" taas="" n-hex="" ei="" muuttanut="" merkittävästi="" -msh-välitteistä="" melanogeneesiä.="" ja="" ch2cl2-fraktiot="" (kuvio="" 2d).="" lisäksi="" määritettiin="" liuotinfraktioiden="" estävät="" vaikutukset="" -msh:n="" välittämään="" tyrosinaasin="" aktivaatioon,="" koska="" tyrosinaasilla="" on="" keskeinen="" rooli="" melanogeneesissä.="" n-buoh="" (95="" prosenttia,="" p="">< 0,001)="" ja="" etoac="" (66="" prosenttia,="" p="">< 0,001)="" tyrosinaasin="" aktivoidut="" fraktiot="" käännetään.="" -msh:lla,="" kun="" taas="" n-hex-="" ja="" ch2cl2-fraktiot="" eivät,="" kuten="" kuviossa="" 2e="" esitetään.="" lisäksi="" vetyperoksidi="" stimuloi="" eri="" liuotinfraktioiden="" huuhteluvaikutusta="" solunsisäiseen="" ros:n="" kasvuun.="" kaikki="" liuotinfraktiot="" käänsivät="" vetyperoksidin="" välittämän="" solunsisäisen="" ros-lisäyksen,="" kuten="" kuvassa="" 2f="" on="" esitetty.="" nämä="" tulokset="" osoittavat,="" että="" l.="" thunbergianuksen="" buoh-fraktio="" esti="" -msh:n="" indusoimaa="" melaniinisynteesiä="" inhiboimalla="" solunsisäistä="" tyrosinaasiaktiivisuutta="" b16f10-soluissa.="" lisäksi="" nämä="" tulokset="" viittaavat="" siihen,="" että="" melaniinin="" synteesiä="" estävät="" bioaktiiviset="" aineosat="" olivat="" hydrofiilisiä="" ja="" niitä="" löydettiin="" pääasiassa="">

Kuvio 2. Liuotinfraktioiden vaikutukset ABTS-radikaalien poistamiseen, tyrosinaasin vastaisiin ja melanogeneesin vastaisiin aktiivisuuksiin.

L. thunbergianus -uutteen bioaktiivisten yhdisteiden tunnistaminen ja karakterisointi.

Melanogeneesiä inhiboivien aineosien tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi suoritettiin korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) kaikille liuotinfraktioille. Liuotinfraktioiden HPLC-analyysi paljasti, että kaikki fraktiot sisältävät kolme pääyhdistettä retentioajoilla 21, 28 ja 29 minuuttia yhdisteille 1, 2 ja 3 (kuvio 3A-D). Nämä kolme pääyhdistettä eristettiin edelleen preparatiivisella HPLC-puhdistuksella. Kolmen pääyhdisteen määrät n-BuOH-fraktiossa määritettiin käyttämällä kaupallisia kofeoyylikiinihappojohdannaisia ​​sisäisinä standardimolekyyleina edellisen raportin mukaan.12

Eristetyt yhdisteet tunnistettiin sitten vertaamalla niiden1H- ja13C NMR-tietoja kirjallisuuteen, ja niiden havaittiin olevan yhtäpitäviä ehdotettujen rakenteiden kanssa (kuvio 4).13 Kuva 3E esittää kolmen yhdisteen molekyylirakennetta. Yhdiste 1 (saanto, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n BuOH-fraktio) saatiin vaaleankeltaisena jauheena. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,66 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,49 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1 H, s), 6,99 ( 1 H, d, J=8,2 Hz), 6,78 (1 H, d, J=8,1 Hz), 6,23 (1 H, d, J=15,9 Hz), 5,20( 1 H, m), 5,08 (1 H, brs), 4,89 (1 H, brs) 4,13 (1 H, m), 3,84 (1 H, m), 3,56 (1 H, s), 3,35 (1 H, s), 1,99 (1 H, s). m), 1,92 (1 H, m), 1,89 (1 H, m), 1,79 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,42, 168,10, 148,14, 145,53, 144,75, 125,65, 121,07, 115,75, 121,07, 115,75, 27,3,8,2,7,2,8,5,8,2,8,114,71). Yhdiste 1 tunnistettiin 3-kofeoyylikinihapoksi NMR-analyysillä ja vertailulla aikaisempaan kirjallisuuteen.13b

Yhdiste 2 (saanto, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg n-BuOH-fraktio) saatiin vaaleankeltaisena jauheena. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1 H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1 H, brs), 4,70 (1 H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1 H, brs), 3,95 (1 H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1 H, m), 1,83 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 21,76, 214,68, 214,66,66. Yhdiste 2 tunnistettiin 5-kofeoyylikiinihapoksi NMR-analyysillä ja vertailulla aikaisempaan kirjallisuuteen.13c

Yhdiste 3 (saanto, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg n-BuOH-fraktio) saatiin vaaleankeltaisena jauheena. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 8 9,64 (1 H, brs), 9,20 (1 H, brs), 7,52 (1 H, d, J=15,9 Hz), 7,06 (1 H, s), 7,02 ( 1 H, d, J=8,1 Hz) 6,79 (1 H, d, J=7,9 Hz), 6,30 (1 H, d, J=15,9 Hz), 4,85 ( 1 H, brs), 4,70 (1 H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1 H, brs), 3,95 (1 H, m), 1,97 (2H, m), 1,88 (1 H, m), 1,83 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) 8 (176,02, 166,27, 148,28, 145,55, 144,77, 125,54, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 121,19, 115,76, 21,76, 214,68, 214,66,66. Yhdiste 3 tunnistettiin 4-kofeoyylikiinihapoksi NMR-analyysillä ja vertailulla aikaisempaan kirjallisuuteen.13a

Kuva 3. L. thunbergianuksen (A) n-Hex-, (B) CH2Cl2-, (C) EtOAc- ja (D) n-BuOH-fraktioiden HPLC-kromatogrammit ja kolmen pääyhdisteen (E) rakenne.

L. thunbergianuksesta eristettyjen kofeoyylikiinihappojohdannaisten estopotentiaali melanogeneesiä vastaan.

Seuraavaksi tehokkaan anti-melanogeneesin taustalla olevan biologisesti aktiivisen ainesosan tunnistamiseksi määritimme L. thunbergianuksesta eristettyjen kolmen kofeoyylikiniinihappojohdannaisen estävän vaikutuksen melaniinin synteesiä sisältäviä inmelanoomasoluja vastaan. Ensin tutkittiin kolmen johdannaisen vaikutuksia ABTS-radikaalin poistamiseen. Tulokset osoittivat, että näillä kolmella johdannaisella oli samanlainen ABTS-radikaaleja poistava aktiivisuus (kuvio 5A). Sitten tutkimme L. thunbergianuksen ontyrosinaasiaktiivisuudesta eristettyjen kolmen johdannaisen estovaikutusta. Nämä kolme johdannaista osoittivat pitoisuudesta riippuvaista tyrosinaasiaktiivisuuden inhibitiota, maksimaalisella inhibitiolla pitoisuudella 200 µM (kuvio 5B). Lisäksi tutkimme kolmen johdannaisen estävää vaikutusta -MSH:n aiheuttamaan melaniinin synteesiin B16F10-soluissa. -MSH-käsittely aiheutti B16F10-solujen intrasellulaarisen melaniinipitoisuuden noin 2{11}}nkertaisen kasvun (kuva 5C). Mielenkiintoista on, että yhdisteet 1 (3-kofeoyylikiniinihappo) ja 3 (4-kofeoyylikiniinihappo) lisäsivät melaniinin synteesiä merkittävästi 25 ja 23 prosentilla, vastaavasti (kuva 5C, s.< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Kuva 4. (A) 3-kofeoyylikiinihapon, (B) 4-kofeoyylikiinihapon ja (C) 5-kofeoyylikiinihapon 1H NMR-spektrit ja (D) {{13C-NMR-spektrit 6}}kofeoyylikiinihappo, (E) 4-kofeoyylikiinihappo ja (F) 5-kofeoyylikiinihappo

5-Kofeoyylikiinihapon melanogeneesin vastaisen tehon todentaminen.

Vahvistaaksemme {{0}}kofeoyylikiinihapon melanogeneesiä estävän vaikutuksen määritimme kaupallisen 5-kofeoyylikiinihapon onmelaniinin synteesiä estävän vaikutuksen -MSH:n välittämää. Käsittely pienemmillä pitoisuuksilla 0,1 ja 0,2 mM 5-kofeoyylikiniinihappoa lisäsi hieman melaniinin synteesiä ja solunsisäistä tyrosinaasin aktiivisuutta, kun taas yhdisteen korkeammat pitoisuudet 0,5 ja 1 mm käänsivät -MSH-välitteisen melanogeneesin. ja solunsisäinen tyrosinaasiaktiivisuus (kuvio 6A, B), joiden tulokset ovat yhdenmukaisia ​​edellisen raportin kanssa.14

Kofeoyylikiinihappo on fenoliyhdiste, joka muodostuu kofeiinihapon ja L-kiniinihapon välisestä esterisidoksesta. Kofeoyylikiinihappojohdannaisilla on tiedetty olevan anti-melanogeneesia ja antityrosinaasia sekä ROS-puhdistusaktiivisuutta. Tyrosinaasi on monitoiminen kuparia sisältävä metalloentsyymi, jossa on kaksiarvoisia kuparikationeja.1 Kofeoyylikiinihappojohdannaiset voivat estää tyrosinaasiaktiivisuutta kelatoimalla kuparikationin, joka on vastuussa tyrosinaasin aktiivisen tilan ylläpitämisestä. 5-Kofeoyylikiinihapon ja tyrosinaasin välisen vuorovaikutuksen ennustamiseksi suoritettiin laskennallinen molekyylitelakkatutkimus Maestro-ohjelmalla. Paras asento yhdisteelle, telakoitu totyrosinaasi, on kuvattu kuvassa 6C, D. Molekyylitelakkatutkimus paljasti, että 5-kofeoyylikiniinihappo on vuorovaikutuksessa kuparin kanssa 2,43 Å:n etäisyydellä ja muodostaa sarjan π−π-pinoamista Hisin kanssa. 259, Asn 260, His 85 ja His 263 ja H-sidos Arg 268:n kanssa. Lisäksi tyrosinaasin ja 5-kofeoyylikiinihapon välinen sitoutumisenergia oli −4,425 kJ/mol. Nämä tulokset osoittavat, että 5-kofeoyylikiinihappo voi estää tyrosinaasiaktiivisuutta kuparin kelatoimalla. Vahvistaaksemme 5-kofeoyylikiniinihapon melanogeneesiä estävän mekanismin määritimme 5-kofeoyylikiinihapon kuparin kelatointikyvyn. 5-kofeoyylikiinihapon kuparin kelatointikyky parani pitoisuudesta riippuvaisella tavalla (kuva 6E). Tämä tulos viittaa siihen, että 5-kofeoyylikiniinihappo estää melaniinin synteesiä kelatoimalla kuparikationin, joka on vuorovaikutuksessa tyrosinaasin kanssa.

Kuvio 5. Kolmen kofeoyylikiniinihappojohdannaisen vaikutukset radikaalien poistamiseen, in vitro antityrosinaasiin ja anti-melanogeneesiaktiivisuuteen B16F10-soluissa.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Materiaalit

L. thunbergianus ostettiin verkkokaupasta www.jirisangol.com (Korea) ja kuivattiin ympäristön olosuhteissa ennen käyttöä tässä tutkimuksessa. Reagenssit, kuten 2,2'-sinkki-bis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo (ABTS) ja 3-(4,5-dimetyylitiatsoli-2- yl)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT), melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH) ja entsyymit, kuten sienityrosinaasi, saatiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO, Kaliumpersulfaatti (K2S2O8), pyrokatekolivioletti ja 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniini (L-DOPA) ostettiin Alfa Aesarilta (Haverhill, MA, USA).

L. thunbergianuksen uuttaminen ja fraktiointi.

Kuivattu L. thunbergianus (80 g) jauhettiin jauhaimella (HBL-3500S, Samyang Electronics, Korea) ja uutettiin 70-prosenttisella EtOH:lla kolme kertaa (800 ml kullakin kerralla) ) 70 asteessa 3 päivää. Saatu uute tyhjiösuodatettiin käyttämällä Advantecfilter-paperia nro. 1 ja 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokio, Japani) ja konsentroitiin käyttämällä Hei-Vap Advantage -kiertohaihdutinta (Heidolph, Saksa), jolloin saatiin 17,2 g EtOH-raakauutetta. Tämä raakauute suspendoitiin dH20:hon (180 ml) ja fraktioitiin peräkkäin heksaaniin, CH2Cl2:n, EtOAc:n ja n-BuOH:n kanssa, jolloin saatiin heksaani (1,51 g, 8,8 %), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 %), EtOAc (3,95 g). % ) ja n-BuOH (3,02 g, 17,6 prosenttia), kuten aiemmin on kuvattu.15 Saadut uutteet ja fraktiot pakastekuivattiin ja säilytettiin -80 asteessa ennen käyttöä.

ABTS:n vapaiden radikaalien poistamisaktiivisuuden määrittäminen.

L.thunbergianus-uutteiden ja sen liuotinfraktioiden antioksidanttiaktiivisuuden arvioimiseksi määritettiin ABTSradikaaleja poistava aktiivisuus, kuten aiemmin on kuvattu.16 ABTS-radikaalin muodostamiseksi 10 ml 7 mMABTS:a sekoitettiin 176 µl:aan 140 mM:a. kaliumperoksidisulfaattia dH20:ssa ja inkuboitiin pimeässä huoneenlämpötilassa (RT) 16 tuntia ennen käyttöä. ABTS-radikaaliliuos laimennettiin absoluuttisella metanolilla, jotta saavutettiin lähes 0,7 aabsorbanssi aallonpituudella 734 nm. Jokaisen uutteen tai fraktioiden 100 µl:n alikvootit ilmoitetulla pitoisuusalueella 2–200 ug/ml lisättiin 100 µl:aan laimennettua ABTS-radikaaliliuosta ja inkuboitiin 10 minuuttia pimeässä huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin sitten aallonpituudella 732 nm käyttämällä SpectraMaxM5-monimoodimikrolevylukijaa (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). ABTS-radikaalinpoistoaktiivisuus laskettiin seuraavasti

ABTS:n radikaalinpoistoaktiivisuus (prosentti) =1−(Asample/Acontrol)×100 (1)

In vitro -tyrosinaasin esto.

L.thunbergianus-uutteiden ja sen liuotinfraktioiden estovaikutus tyrosinaasin aktiivisuuteen arvioitiin tyrosinaasin katalyyttisestä reaktiosta syntetisoidun dopakromimäärän perusteella.2a,17 Lyhyesti sanottuna 50 μl kutakin ilmoitetun pitoisuusalueen uutetta tai fraktiota sekoitettiin 50 50 μl:aan. U/ml sienityrosinaasia 50 mM fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS; 8,1 mM Na2HPO4, 1,2 mM KH2PO4, pH 6,8, 2,7 mMCl ja 138 mM NaCl) 96--kuoppalevyllä ja inkuboitu 30 min RT:ssä. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin 100 µl 1 mM L-DOPA:ta, minkä jälkeen inkuboitiin vielä 10 minuuttia 37 asteessa. Saadun liuoksen absorbanssi mitattiin 475 nm:ssä käyttämällä SpectraMax M5 -monimoodimikrolevyn lukulaitetta.

Soluviljely.

B16F10 hiiren melanoomasoluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle's mediumissa (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA), jota oli täydennetty 10 prosentilla lämmöllä inaktivoidulla naudan sikiön seerumilla (Gibco), 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml streptomycin 3 asteessa (streptomycin) alle kostutetun 5 prosentin CO2:n.

Solujen elinkelpoisuus.

B16F10-solujen elinkelpoisuus määritettiin käyttämällä MTT-määritystä, kuten aiemmin on kuvattu.18 Lyhyesti sanottuna B16F10-solut kylvettiin 24-kuoppalevyille tiheydellä 1 × 104 solua per kuoppa. 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin osoitetuilla L. thunbergianus -uutteiden tai -fraktioiden pitoisuuksilla 48 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin MTT-liuoksen kanssa 4 tuntia ja pelkistyneet formatsaanikiteet liuotettiin DMSO:hon. Saatu liuos siirrettiin 96-kuoppalevyille, ja absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä käyttämällä SpectraMax M5-multimode -mikrolevylukijaa.

Intrasellulaaristen reaktiivisten happilajien (ROS) määritys.

Solunsisäinen ROS-taso mitattiin käyttämällä DCF/H2DCFDA-solujen ROS-määrityssarjaa (ab113851, Abcam) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti sanottuna B16F10-soluja kylvettiin 48-kuoppalevyille tiheydellä 2 × 104 solua kuoppaa kohti. 24 tunnin viljelyn jälkeen soluja käsiteltiin 1 tunnin ajan ilmoitetuilla L. thunbergianus -uuttoainefraktioiden pitoisuuksilla 0,1 % naudan seerumialbumiinia (BSA) sisältävässä elatusaineessa, jossa ei ollut fenolipunaista. Soluja inkuboitiin sitten 100 µM vetyperoksidin kanssa 30 minuuttia. PBS:llä pesun jälkeen soluja käsiteltiin 25 µMH2DCFDA:lla PBS:ssä 45 minuutin ajan. ROS-taso analysoitiin mikrolevylukijalla (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA), joka oli varustettu fluoresenssisuodattimella aallonpituudella 485/545 nm (viritys/emission aallonpituus). Kontrollin keskimääräinen suhteellinen fluoresenssin intensiteetti rinnastettiin 100 prosenttiin, jolloin käsittelyolosuhteet laskettiin suhteessa.

Melaniinipitoisuuden määritys.

Melaniinipitoisuus määritettiin, kuten aiemmin on kuvattu, tietyin muutoksin.19 Melanoomasoluja viljeltiin kuusikuoppaisella levyllä 24 tuntia. Niitä käsiteltiin ilmoitetuilla L. thunbergianus -uutteen tai sen liuotinfraktioiden pitoisuuksilla vielä 48 tuntia 100 nM -MSH:n läsnä ollessa. Pesun jälkeen kahdesti jäähdytetyllä Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, jota oli täydennetty kalsiumkloridilla ja magnesiumkloridilla (D-PBS, Gibco), saadut solut irrotettiin inkuboimalla trypsiini-EDTA-liuoksen kanssa. Kun oli sentrifugoitu 1000 rpm 3 minuutin ajan, solupelletti liuotettiin 150 µl:aan 1 M NaOH:ta, joka sisälsi 10 prosenttia DMSO:ta 1 tunnin ajan 60 asteessa 1 tunnin ajan. Melaniinipitoisuus määritettiin absorbanssilla 405 nm:ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

Cistanche-uute estää melaniinia.

Solujen tyrosinaasiaktiivisuuden määritys melanoomasoluissa.

Tyrosinaasiaktiivisuus B16F10-soluissa tutkittiin solunsisäisen tyrosinaasin katalyyttisen reaktion tuottaman dopakromin määrän perusteella.20 Lyhyesti sanottuna melanoomasoluja viljeltiin kuusikuoppaisella levyllä 24 tuntia, minkä jälkeen niitä käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla L. thunbergianus -uutetta tai sen liuotinta. fraktioita vielä 48 h ajan 100 nM -MSH:n läsnä ollessa. Kun solut oli pesty kahdesti jääkylmällä D-PBS:llä, ne hajotettiin 200 µl:ssa radioimmunosaostusmääritys (RIPA) -puskuria (Sigma-Aldrich), joka sisälsi proteaasi- ja fosfataasin estäjiä. Kustakin kuopasta kerätyn solulysaatin sentrifugoinnin jälkeen 15, 000g 15 minuutin ajan, 100 µl supernatanttia sekoitettiin 100 µl 1 mM L-DOPA:n kanssa PBS:ssä (pH 6,8), mitä seurasi 30 minuutin inkubointi 37 asteessa. . Dopakromin absorbanssi mitattiin aallonpituudella 475 nm käyttämällä mikrolevynlukijaa. Tiedot normalisoitiin proteiinipitoisuudella, joka määritettiin bikinkoniinihappomäärityksellä.

Bioaktiivisten yhdisteiden eristäminen ja karakterisointi HPLC:tä käyttäen.

HPLC suoritettiin YL{{0}} (Young Lin Instrument, Korea), joka oli varustettu TC-C18-kolonnilla (4,6 mm, 250 mm ja 5 μm, Agilent, USA), inkonjunktiolla gradienttijärjestelmällä, joka koostuu liuottimesta A (0,2 % muurahaishaposta) ja liuottimesta B (MeOH). Kaltevuuden liuottimena asetettiin 0-5 min, 15 prosenttia B; 5-10 min, 15-20 prosenttia B; 10-15 min, 20-30 prosenttia B; 15-30 min, 30-40 prosenttia B; 30-37 min, 40-60 prosenttia B; 37-40 min, 60-100 prosenttia B; 40-45 min, 100 prosenttia B; 45-50 min, 100-15 prosenttia B; ja 50–55 min, 15 prosenttia B. Liuotinfraktioiden ainesosien tunnistamiseksi liikkuva faasi toimitettiin virtausnopeudella 1 ml/min, ja eluoitumisen havaitseminen suoritettiin aallonpituudella 330 nm. Bioaktiivisten aineosien liuottimien fraktioiden keräämiseksi liikkuvaa faasia syötettiin virtausnopeudella 15,0 ml/min, ja eluoitumisen havaitseminen suoritettiin 330 nm:ssä käyttäen prep-HPLC:tä (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea). ), joka on varustettu prep-C18-kolonnilla (4,6 mm, 212 mm, 10 μm, Agilent, USA) yhdessä liuottimesta A (0,2 % muurahaishappoa) ja liuottimesta B (MeOH) koostuvan gradienttijärjestelmän kanssa. Kaltevuuden liuotinsuhde asetettiin arvoon 0-10 min, 10 prosenttia B; 10-20 min, 10-15 prosenttia B; 20-40 min, 15 prosenttia B; 40-60 min, 15-20 prosenttia B; ja 60–70 min, 30 prosenttia B.

Molekyylimallinnus.

Molekyylimallintamisen sienityrosinaasin kiderakenne oli Agaricustyrosinase (PDB tekee: 2Y9X), joka saatiin Protein DataBankista (PDB). Entsyymi valmistettiin käyttämällä Maestro-ohjelmaan (Maestro, versio 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019) upotettua proteinwizard-valmistelutyönkulkua. Vesi ja kaikki muut PDB-tiedostoissa olevat molekyylit poistettiin. Molekylaarinen telakointi suoritettiin käyttämällä induced fit Docking (IFD) -protokollaa (Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking protocol), kuten aiemmin on raportoitu.21

Kuparin kelatointikyky.

L. thunbergianuksesta eristettyjen yhdisteiden kuparin kelatointikyky määritettiin edellisen raportin mukaisesti.22 Kukin kofeoyylikiinihappojohdannainen (10 μL) ilmoitetussa pitoisuudessa sekoitettiin 280 µl:aan 50 mM natriumasetaattipuskuria (pH 6,0), 6 μL 4 mM pyrokatekoliviolettiliuosta, joka on valmistettu samassa puskurissa, ja 10 μL 1 ug/μL CuSO4·5H2O:ta. Sinisen värin katoaminen havaittiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 632 nm käyttämällä SpectraMax M5 -monimoodimikrolevylukijaa. Vettä käytettiin kontrollina näytteen sijasta. Kuparin kelatoivan aktiivisuuden prosenttiosuus laskettiin absorbanssista 632 nm:ssä, joka on seuraava

kuparin kelatointikyky( prosenttia )=1− (Näyte/ohjaus)×100 (2)

Tilastollinen analyysi.

Kaikki tämän tutkimuksen tiedot ilmaistiin keskiarvona ± standardipoikkeama (SD) kolmesta riippumattomasta kokeesta. Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 8:lla.{1}} (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Vertailuryhmän ja altistuneiden ryhmien keskiarvojen väliset erot analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA), jota seurasi Dunnettin post hoctest. Tilastollisen merkitsevyyden kynnys kaikille analyyseille oli p < 0,05="">

PÄÄTELMÄT

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että L. thunbergianus -uutteet sieppaavat ABTS-radikaaleja ja osoittavat voimakkaan melaniinin biosynteesiä estävän vaikutuksen ilman merkittävää sytotoksisuutta. L. thunbergianuksessa oleva ja melanogeneesiä estävä abioaktiivinen ainesosa eristettiin n-BuOH-fraktiosta. Lisäksi havaitsimme, että kolme kofeoyylikiinihappojohdannaista ovat pääyhdisteitä, joita esiintyy n-BuOH-fraktiossa ja että 5-kofeoyylikiinihappo on tärkeä ainesosa suppressoi melanogeneesiä melanoomasoluissa inhiboimalla solujen tyrosinaasiaktiivisuutta. Tässä eristimme L.thunbergianus-uutteesta luonnollista yhdisteestä peräisin olevaa inhibiittoria 5-kofeoyylikiinihappoa hyperpigmentaation estämiseksi ja paljastimme sen estomekanismin, joka on melanogeneesin taustalla. Näin ollen havainteemme viittaavat siihen, että 5-kofeoyylikiinihappo ja L. thunbergianuksesta eristetty n-BuOH-fraktio saattavat olla hyödyllisiä kosmetiikassa ihoa valkaisuaineina.

cistanche-viipaleet