Autofluoresenssi ei-invasiivisena ikääntymisen ja edistyneen glykaation lopputuotteiden biomarkkerina Caenorhabditis Elegansissa

Autofluoresenssin hyödyllisyyden arvioimiseksi ei-invasiivisena vanhenemisen biomarkkerina Caenorhabditis elegansissa mittasimme yksittäisten sukkulamatojen autofluoresenssia spektrofluorimetrialla. Kunkin madon fluoresenssi lisääntyi iän myötä. Eläimillä, joiden fluoresenssin intensiteetti oli pienempi, oli pidempi elinajanodote. Kun matoista uutettuja proteiineja inkuboitiin sokereiden kanssa, fluoresenssin intensiteetti ja edistyneiden glykaation lopputuotteiden (AGE) pitoisuus kasvoivat ajan myötä. Riboosi tehosti näitä muutoksia ei vain in vitro vaan myös in vivo. Glykaation estäjä rifampisiini tukahdutti tämän fluoresenssin nousun. Korkearesoluutioinen massaspektrometria paljasti, että vanhoihin matoihin kerääntyneet vitellogeniinit ja glykoituneet vitellogeniinit emittoivat kuusi kertaa korkeamman fluoresenssin kuin naiivit vitellogeniinit.Fluoresenssin lisääntyminen ikääntymisen myötä johtuu glykoituneista aineistaja siksi voisi toimia hyödyllisenä ei-invasiivisena AGE:n biomarkkerina.Cistanchevoi toimia uutena mallina AGE-tekijöiden etsimiseenja tutkia AGE:n ja vanhenemisen välistä suhdetta.

Etäisyyshe Yrtit ikääntymistä estäviä tekijöitä varten

JOHDANTO

Ihmisten keskimääräinen elinikä on pidentynyt dramaattisesti kehittyneissä maissa viimeisen puolen vuosisadan aikana. Kuitenkin,ikääntymisen myötä etenevät vauriot aiheuttavat haitallisia vaikutuksia fysiologisiin toimintoihin, tunnetaanvanheneminen, jaikääntymiseen liittyvät sairaudetmyös lisääntyvätsuhteessa pitkäikäisyyteen. Laajennus"terveyttä" on nyt välttämätön sen sijaan, että se pidentäisi vain elinikää. Interventiot, jotka hidastavat vanhenemista ja pidentävät terveyttä, ovat toivottuja. Brenner et ai. otettu käyttöönCaenorhabditis elegans, joka on pieni, vapaasti elävä maaperän sukkulamato, joka ruokkii bakteereja, käytettäväksimolekyyligenetiikan erilaistumisen ja kehityksen tutkimukset.

Tämän eläimen takia matoa on käytetty laajasti kokeellisena järjestelmänä biologisiin tutkimuksiin, mukaan lukien vanhenemisen tutkimukseen.'s yksinkertaisuus, läpinäkyvyys, viljelyn helppous, lyhyt käyttöikä ja soveltuvuus geneettiseen analyysiin2. Madossa ikääntymistä voidaan tutkia vaimentamalla liikkumiskykyä, stressinsietokykyä, kognitiivista kykyä ja nielun pumppausta sekä keräämällä niin sanottua ikäpigmenttiä lipofuskiinia3–5 .

Useat kemikaalit, mukaan lukien antioksidantit ja useat lääkkeet, ovat ehdokkaita estämään vanhenemista6,7. Lisäksi koska raportoimme, että sukkulamatojen terveyttä ja elinikää voitaisiin pidentää ruokkimalla probioottisia bakteereja8,9Useat laboratoriot ovat osoittaneet myös hyödyllisten bakteerien pitkäikäisyyden10–12. Pitkäikäisyyden vaikutuksia on tutkittu eloonjäämiskäyrillä, mutta tällaiset matotutkimukset vaativat yli 3 viikkoa, vaikka niiden elinikä on suhteellisen lyhyt.C. elegans. Interventioiden vaikutusten arvioimiseksi ikääntymistä vastaan ​​halutaan käteviä ja ei-invasiivisia vanhenemisen indikaattoreita jäljittääkseen vaikutuksen yksittäisissä matoissa ja (lopulta) ihmisissä lopullisena kohteena.

Lipofuskiinia, niin kutsuttua ikääntymispigmenttiä, on käytetty laajalti vanhenemisen indikaattorina. Tarkka suhde autofluoresenssin, vanhenemisen ja madon eliniän välillä on kuitenkin jäänyt epäselväksi. Gerstbrein et ai. ilmoitti, että ikäpigmentit ovat kelvollisia kertojia sukkulamatojen terveydentilasta13kun taas Coburn et ai. raportoi, että sininen fluoresenssi (viritys-/emissioaallonpituudet, joiden keskipiste on 340/430 nm) toimii kuoleman merkkinä useita tunteja ennen ja jälkeen kuolemanC. elegans14. On ehdotettu, että sinisen autofluoresenssin lisääntyminen ajan myötä havaittiin ikääntyvien populaatioiden kohdallaC. elegansei ehkä heijasta väestön ikääntymisastetta tai terveydentilaa sinänsä, vaan sen sijaan kuolleiden tai melkein kuolleiden yksilöiden osuutta otoksesta15.

Edistyneet glykaation lopputuotteet (AGE) ovat herättäneet tieteellistä huomiota16 koska niitä muodostuu suuria määriä diabetestapauksissa, mutta myös fysiologisen ikääntymisen aikana ja ne johtavat oksidatiiviseen stressiin. AGE:t ovat monimutkaisia ​​yhdisteitä, jotka muodostuvat ei-entsymaattisissa reaktioissa pelkistäviä sokereita ja proteiineissa, lipideissä tai nukleiinihapoissa olevien aminoryhmien välillä; Schiff-emäkset ja Amadori-tuotteet muodostuvat sitten Maillard-reaktioiden kautta, jolloin saadaan AGE:ita. AGE-pitoisuus on korkea potilailla, joilla on diabetes, nivelreuma tai Alzheimer's sairaus ja muut sairaudet17–19. Diabetespotilailla AGE-kertymä korreloi hyvin mikrovaskulaarisen sairauden vaikeusasteen kanssa ja lisääntyy iän myötä. Kuitenkin, ovatko AGE:t patogeneesin syy vai ovatko vain sekundaarisia tuotteita, on vielä selvitettävä. AGE:ita pidetään myös mahdollisina ikääntymisen syinä20,21, kuten kohdan a löydöistä ehdotetaanC. eleganssokerin toksisuuden malli22,23.

ELISA-menetelmä on kehitetty käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä useille AGE-yhdisteille.24–26. Tarvitaan kuitenkin myös ei-invasiivisia menetelmiä AGE-tasojen karkeiden arvioiden mahdollistamiseksi. Koska useiden AGE:iden kerrotaan olevanFLuoresoivat ja niihin liittyvätFLuoresenssin intensiteetillä on merkkiFifiei voi korreloida ELISA:lla mitattujen tasojen kanssa27, tutkimme, onko tämäFLuoresenssia voitaisiin käyttää vaihtoehtoisena markkerina AGE:iden ja vanhenemisen tilan jäljittämiseenC. elegansmalli.

Sen tarkistamiseksi, onko havaittufluoresenssikuvastaa vain kuolemaafluoresenssiraportoivat Coburn et ai., matoja tutkittiin jäljittämälläFLyksittäisten matojen uoresenssi samallakyseisten eläinten kuoleman ajoitus. Lisäksi,AGE:n muodostumisen estäjien vaikutuksiinfluoresenssija AGE:n kertymistä tutkittiin myös käyttökelpoisuuden vahvistamiseksiC. elegansmallieläimenä AGE-tutkimukselle.

TULOKSET

Uutettujen proteiinien autofluoresenssi ikääntymisen ja AGE:iden biomarkkerina matoissa

Uutettujen proteiinien fluoresenssispektrofotometria osoitti, että viritys 325 °C:ssa–365 nm teki 17-vuorokauden ikäisiä matojaFLuoresce 400:n suurimmalla päästöllä–430 nm (huippu 420 nm) intervalli (kuva1a). SininenFLuoresenssi oli verrattain pienempi nuoren aikuisiän aikana (3-päivän ikäisestä 5-päiväiseen), mutta nousi ajan myötä (7-päivän ikäisillä eläimillä) (kuva 1).1b). Lipofussiini, niin kutsuttu ikäpigmentti, säteilee punaistaFLuoresenssi (viritys 530 asteessa–560 nm, emissio 585:ssä–645 nm)15; aiemmassa tutkimuksessamme tämä merkki havaittiin myöhään (yli 13-päivän ikäisillä) matoilla9. 

Autosta lähtienFLtässä tutkimuksessa havaittu uoresenssi ilmestyi aikaisemmassa vaiheessa ja lisääntyi ajan myötä, sininen autoFLuoresenssin odotettiin olevan parempi biomarkkeri vanhenemisen jäljittämiseksi. Koska useiden AGE-yhdisteiden tiedetään olevan autofluoresoivia27, tutkimme AGE-sisällön ja sinisen suhdetta.FLuoresenssi Western blot -menetelmällä, jossa N:n vasta-aineε- (karboksimetyyli)lysiiniä (CML), edustava AGE, käytettiin. Blottaus osoitti, että erinomainen vyöhyke vahvistui ajan myötä (kuva 1).1c ja täydentävä kuva 1). Itse asiassa alueen kvantifiointi osoitti lisääntynyttä AGE:ta (kuva 1).1d), vaikka CML ei ole automaattinenfluoresoiva.

Sen määrittämiseksi, onko autofluoresenssi osoitti epäsuorasti anMaillardin reaktion muodostamien AGE:iden lisääntyminen, proteiinitmatohomogenaateista uutettuja, inkuboitiin aseptisesti jopa 4 viikkoa pelkistyssokereiden, kuten glukoosin, riboosin ja fruktoosin, kanssa. TheFLproteiinien uoresenssi nousi ajan myötä sokereiden läsnä ollessa, kun taas proteiinien määrä ei lisääntynyt merkittävästiFLuoresenssi reaktioissa, jotka suoritetaan ilman sokereita (kuva 1).2a). Matoproteiineista tuliFLuoresoiva glykaation kautta jopa in vitro. Jokaisella kolmesta sokerista suoritetuista reaktioista riboosilla saadut reaktiot tuottivat enitenFLuoresenssi, jonka jälkeen seuraavat kaksi muuta sokeria. TämäFiLöytäminen voidaan selittää Bunnin ja Higginsin raportilla, jossa kunkin monosakkaridin reaktiivisuus aminoryhmien kanssa muodostaa Schiff-emässidoksia riippuu siitä, missä määrin se esiintyy avoimessa (karbonyyli)rakenteessa renkaan sijasta. hemiasetaali- tai hemiketaalirakenne, ja reaktiivisuusnopeudet kasvoivat riboosin (10.0), fruktoosin (4,5) ja glukoosin (0,6) (×10) järjestyksessä.−3 mm−1 h−1 ), vastaavasti28.

Kuva 1 Fluoresenssispektrofotometria ja matoproteiininäytteiden AGE-arvot. anViritysemissiomatriisi (EEM) -käyrät lyysattujen matojen autofluoresenssista 3-päivä- ja 17-päivän ikäisillä. TheFLuoresenssitasot emissioaallonpituudella EEM-käyrissä näytetään värillisinä lämpökarttoina. Sata matoa (villin tyypin N2) sekä 3-- että 17--päivän ikäisiä lyysattiin 3 µl:ssa lyysipuskuria ja 4 µl:ssa 15-prosenttista SDS:ää. Proteiinit vapautettiin jäädytys-sulatussykleillä, ja fotoluminesenssispektrit kerättiinFLuoresenssispektrofotometri (Hitachi FL-4500). Lyysattujen sukkulamatojen fluoresenssiominaisuudet analysoitiin käyttämällä EEM:ääFLuoresenssispektroskopia. Herätys 325:ssä–365 nm teki 17-vuorokauden ikäisiä matojaFLuoresce, jolla on suurimmat päästöt 400:ssa–430 nm:n välein vastaavia lentoratoja sarjanaFLuoresenssin intensiteetit, kun taas 3-päivän ikäiset nuoret madot eivätFLuoresce. Monimuuttujaanalyysi (yhden aallonpituuden heräte useilla aallonpituuksilla emissiolla ja synkroninen skannausFLuorometria) tuotti EEM-käyrät, jotka koostuivat yhden skannauksen virityksestä.b Auton tasotFLuoresenssi (ex 340/em 360–600) kunkin ikäryhmän eläimistä otetuilla matoproteiininäytteillä (3–13 päivää vanha). Madot (villityyppinen N2) kerättiin putkiin, pestiinviisikertaa ja hajotettiin jokaisessa putkessa. Näytteet jauhettiin sitten käyttämällä Mini Cordless Grinder -laitetta (Funakoshi, Tokio, Japani) proteiinin vapauttamiseksi. Proteiinipitoisuudet mitattiin kvantitatiivisesti menetelmissä kuvatulla tavalla. AFLuoresenssispektri määritettiin jokaiselle 30-µl näytteelle (sisältää 1,5μg kokonaisproteiinia) käyttämällä monimuotohiila-mikrolevylukijamallia SH-9000Lab (Corona Electric, Ibaraki, Japani). Jokainen mittaus suoritettiin kolme kertaa.c AGE CML:n Western blot -analyysi näytteistä, jotka on uutettu eri-ikäisistä matopopulaatioista (villityyppi N2). Kuvassa on edustava valokuva kolmesta toistettavissa olevasta kokeesta. Blotit saatiin saman geelin eri osista (esitetty täydentävässä kuvassa 1) ja niitä käsiteltiin rinnakkain.d KvantifiointiAGE:iden Western blot -analyysissä käyttämällä densitometriaa. Suorakaiteen muotoisilla kehyksillä ympäröimät nauhat kuvassa.1c kvantifioitiin, ja kolmen toistettavan kokeen tiedot esitetään keskiarvona ± SE.

vastaavasti.

Voit arvioida suoraan, lisääntyyköFLuoresenssi sokereiden läsnä ollessa johtui AGE:n muodostumisesta, ELISAa käytettiin edustavan AGE-yhdisteen CML:n havaitsemiseen. KML lisääntyi näissä reaktioissa, ja taso riboosin kanssa inkuboiduissa näytteissä oli jopa lähes seitsemän kertaa korkeampi kuin kontrolleissa, joita inkuboitiin ilman sokereita 4 viikkoa (kuva 1).2b). Verrattuna riboosiin, glukoosilla tai fruktoosilla tuotetun KML:n määrät olivat pieniä, samanlaisia ​​kuin kontrollissa; Tämälöytäminenon yhdenmukainen edellisen raportin kanssa29.

Autofluoresenssi ikääntymisen ja AGE:iden biomarkkerina in vivo

Seuraavaksi testasimme, onkoFLuoresenssi voidaan havaita paitsi uutetuista proteiineista myös elävistä matoista. Kun yksittäisten matojen autofluoresenssi luettiin muovikäärekalvolla, joka oli venytetty 384-kuoppalevyille monimuotoisella hila-mikrolevylukijalla, spektrofotometriatulokset olivat samanlaiset kuin uutettujen proteiinien tulokset (kuva 1).3a). Sinisen yksilöllinen intensiteettiFLuoresenssi lisääntyi ajan myötä (kuva 1).3b ja täydentävä kuva 2), mutta ei punaistaFLuoresenssi havaittiin tällä menetelmällä. Sinisestä lähtienFLuoresenssin (340/430 tai 350/460 nm) on aiemmin raportoitu liittyvän kuolemaan14,15, analyysi suoritettiin sulkemalla pois tiedot, jotka oli saatu 2 päivää ennen eläintä's kuolema. Kuitenkin sininenFLmatojen uoresenssi kasvoi edelleen ajan myötä: lisääntyminenFLuoresenssin on siksi oltava osittain kuolemasta riippumatonFLuoresenssi. Testaaksemme, voisiko autofluoresenssi olla vanhenemisen biomarkkeri, tutkimme, kuinka monta päivää madot selvisivät sen jälkeen, kun autofluoresenssi mitattiin 13-vuorokauden ikäisillä matoilla. Kunkin madon elinajanodote oli kääntäen verrannollinen autofluoresenssin intensiteettiin (kuva 1).3c).

TheFLuoresenssin intensiteetti oli kohonnut myös riboosilla kasvatetuissa matoissa (kuva 1).4a); näiden matojen elinikä oli merkkiFifireilusti lyhyempi kuin kontrollimadoilla (kuva 1).4b). Sitä vastoin madot, joita kasvatettiin alustalla, joka sisälsi rifampisiinia, AGE:n salpaajaa, emittoivat vähemmänFLuoresenssi verrattuna kontrollimatoihin, joita kasvatettiin ilman rifampisiinia (kuva 1).4c); rifampisiinin pitkäikäisyyttä edistävä vaikutus on raportoitu aiemmin30. Lisäksi,DAF-2, edustava pitkäikäisyyttä edistävä mutantti, myös autofluoresoi vähemmän kuin villityyppi (kuva 1).4d), kun taasflvillityypin uoresenssin intensiteetti kasvoi ikääntymisen myötä.

Osa siitäFLuoresenssin odotetaan olevan peräisin yhdisteistä, joita syntyy eläinten kuoleman yhteydessä. SininenFLuoresenssi voisi olla kuoleman merkki, jonka Coburn et al. havaittu vuonnaC. elegansuseita tunteja ennen ja jälkeen kuoleman; sininen valo tulisi antraniilihaposta, joka muodostuu heti matojen kuolemisen jälkeen14. Kuulemma kuolemaFLuoresenssia emittoi kinureniinireitin tuottama antraniilihapon glykosyloitu muoto14. kyu-1mutanttimatojen, joista puuttuu kinureninaasi, ei näin ollen odotettu aiheuttavan kuolemaaFLuoresenssi. Kuitenkin jopa tämän mutaation läsnä ollessa ikääntyneet madot näyttivät edelleen emittoivan enemmänfluoresenssikuin nuoremmat madot (kuva.5a) ja riboosilla täydennetyllä sukkulamatojen kasvualustalla (NGM) kasvatetuilla madoilla oli merkkejäFifihurjasti korkeammalleFLuoresenssi kuin ne, jotka on kasvatettu ilman lisäriboosia tai kontrollisokerin sorbitolilla (kuva 1).5b). Riboosilla ylläpidettyjen matojen elinikä oli selvästi lyhyempi kuin muiden (kuva 1).5c), mikä viittaa AGE:iden ikääntymistä edistäviin vaikutuksiin matoissa.

Autofluoresoivien materiaalien tunnistaminenTunnistaaksesi aineet, jotkaFLuoresced ikääntyvissä eläimissä, LC MALDI -määritys suoritettiin uutetuille proteiineille. Kuusi runsainta proteiinia, jotka löytyvät kustakin näytteestä, on lueteltu taulukossa1; erityisesti vitellogeniinit ja elongaatiotekijät rikastuivat parhaiden joukossa-45FLuoressoivat proteiineja vanhemmissa matoissa. Lisäksi etsimme korkean resoluution MS:n ja Mascot-laskentaympäristön avulla proteiineja, joita oli enemmän 15-päivämadoissa kuin 3-päivämadoissa, ja tunnistimme 180 proteiinia (lisätaulukot 1).–3). Vaikka vitellogeniinit jälleen rikastuivat (vanhemmilla madoilla kuusi kertaa korkeammalla tasolla kuin nuorilla aikuisilla), pidentymistekijöiden tasot olivat samanlaiset kahdessa ryhmässä (täydentävä kuva 3). Sen varmistamiseksi, voitiinko näitä proteiineja glykoida autofluoresoivien AGE:iden muodostamiseksi, puhdistettua elongaatiotekijää ja vitellogeniiniä inkuboitiin riboosin kanssa in vitro. Glykoituneiden vitellogeniinien emittoiman fluoresenssin spektrit olivat samanlaisia ​​kuin ne, jotka saatiin 17-päivän ikäisistä matoista talteenotetuilla raakauutteilla (kuva 1).6a). Vaikka riboflaviinin tiedetäänFLuoresce, havaitsimme, että riboflaviinin emission aallonpituus erosiettä matouutteet. Glykoituneen vitellogeniinin ja elongaatiotekijän FL-fluoresenssi oli kuusi- ja kolminkertainen (vastaavasti) glykoitumattomien proteiinien fluoresenssiin verrattuna 23 päivän kuluttua in vitro (kuva 1).6b).

Western blot -analyysillä anti-CML-vasta-aineilla havaitut AGE-arvot lisääntyivät myös ajan myötä 3-päiväisistä 13-päivämadoista in vivo (kuva 1).1c). Samanaikaisella Western blot -tutkimuksella anti-vitellogeniinivasta-aineilla havaitsimme, että anti-CML-signaalit olivat samankokoisia vyöhykkeitä kuin vitellogeniinit (kuva 1).6c). Vaikka vitellogeniinit YP170 ja YP115 kerääntyivät iän myötä tämän ajanjakson aikana, AGE-signaalien intensiteetti parani enemmän kuin vitellogeniinin YP170 määrän kasvu (kuva 1).6d). Fluoresenssimikroskopia paljasti, että 13-päivän ikäiset matot (kuva7d–f, sarakkeet 2 ja 3) lähettivät merkitFifihuomattavasti voimakkaampaa sinistä valoa kuin 3-päivän ikäiset nuoret aikuiset (kuva.7a–c, sarakkeet 2 ja 3; Kuva.7g); sukurauhaset näyttivät myös kirkkaammilta (kuva.7d–f, sarakkeet 1 ja 2). CML on edustava AGE, vaikka CML ei itse ole ft fluoresoiva. Pentosidiinin, toisen AGE:n, tiedetään olevan fluoresoiva. Immunovärjäys ei kuitenkaan anti-CML- tai anti-pentosidiinivasta-aineilla tuottanut merkittäviä eroja vanhojen ja nuorten matojen välillä (tietoja ei näytetä). Anti-CML osoitti kuitenkin diffuusia leviämistä kudoksiin, kun taas anti-pentosidiini tuskin osoittanut tätä.