Gallihappoon konjugoidun peptidivalmisteen (Gal2-Pep) antioksidantti- ja ikääntymistä estävä potentiaali

Iho on erittäin herkkä ennenaikaiselle ikääntymiselleulkoisen stressin vuoksi tässä tutkimuksessa peptidiformulaatio (galloyyli)2–KTPPTTP (gal2–Pep) syntetisoitiin yhdistämällä TPPTTP-peptidi ja gallushappo (GA). Kaikki peptidit syntetisoitiin 2-klooritrityylikloridihartsilla käyttämällä kiinteän faasin peptidiäsynteesi (SPPS) ja analysoitiin sähkösumutusionisaatiolla (ESI) / kvadrupoli-aikaflflight (Q-TOF) tandemmassaspektroskopia (MS) järjestelmä. Aluksi Gal2–Pep ei osoittanut myrkyllisyyttä alle pitoisuuden 100mM, jonka solujen eloonjäämisaste on 88 prosenttia keratinosyyteillä jafibroblastit. Thereaktiiviset happilajit(ROS) huuhteluaktiivisuus Gal2–Pep oli vakaampi kuin pelkkä GA; ja neljän viikon jälkeen huoneessalämpötila, senROS-poistotoimintapysyi yli 50 prosentissa. Lisäksi peptidiformulaatio,Gal2–Pepillä oli myös elastaasia estävä vaikutus CCD{0}}Sk:ssäfibroblastitsoluja. RT-qPCR:n tulosten perusteella tässä tutkimuksessa osoitettiin, että Gal2–Pep lisäsi PGC:n ilmentymistä-1a toestääoksidatiivista stressiäja vahvisti sen potentiaalinikääntymistä estävä ainekirjoittajalisää ilmaisuatyypin I kollageenijamatriisin metalloproteinaasin-1 (MMP1) ilmentymisen vähentäminen. Thelöydöksiä saadut tulokset vahvistavat ehdotusta, että tässä tutkimuksessa syntetisoitua peptidiformulaatiota voitaisiin käyttää aluonnollinen antioksidanttijaikääntymistä estävä ainesen kosmeettisiin sovelluksiin.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja Cistanche Anti-Aging -tuotteista

1. Esittely

Ihon ikääntyminentapahtuu keratinosyyttien ja solujen jakautumisen asteittaisen vähenemisen ja mahdollisen pysähtymisen seurauksenaräjähdykset ihon sisällä. Iholle kehittyy ryppyjä solujen määrän vähentyessä, minkä seurauksena solunulkoisen matriisin denaturoituminen johtaa kuivumiseen ja elastisuuden menettämiseen.ihossa.1 Solunsisäisen mitokondrion DNA:n vaurioituminenja tapahtuu myös proteiinisynteesin nopeuden hidastuminenihon ikääntymisprosessin aikana.2 Ihon ikääntymisellä on kaksi pääpolkuasisäisillä ja ulkoisilla tavoilla ultraviolettialtistuksella (UV).

merkittävä tekijäulkoinen ikääntyminen. UV-valo reagoi ihon tärkeimpien komponenttien kanssamukaan lukien lipidit, proteiinit ja nukleiinihapot, tuottamaan reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka johtavat soluihinkuolema.3–5 Liialliset ROS-tasot johtavat myös halkeamiseen jakollageeni- tai elastiiniketjujen epänormaali sitoutuminen ja edistää matriksimetalloproteinaasien (MMP:iden), kuten MMP-1, ilmentymistä, jotka hajottavat kollageenia, mikä johtaa ihon ryppyihin janopeuttaa ihon ikääntymistä.6,7 Siksi antioksidanttihoito poistaaROS ja mitokondriopotentiaalin aktivoiminen suojaavat ihoa ikääntymiseltä.

ROS:n lisäksi elastaasilla on merkittävä rooli kudosten häviämisessäihon joustavuutta, joka hajottaa elastiinia, joka on tärkeä proteiinisolunulkoinen matriisi.8 Elastiini, johtuen sen merkittävästä elastisesta rekyylistäominaisuudet tarjoavat iholle joustavuutta, kun taas elastaasi onkyky pilkkoa elastiinia ja muita proteiineja.8 Siksi inhibiElastaasientsyymin lisääminen voi olla keskeinen strategia ihon roikkumiseen ehkäisee ihon kimmoisuuden menetystä.

Tässä tutkimuksessa suunnittelimme uuden materiaalin, jossa yhdistyvätperoksisomiproliferaattorin aktivoima reseptorin gamma-koaktivaattori1-alpha (PGC-1a) -peräinen peptidi TPPTTP ja gallushappo (GA)käytettäväksi ikääntymistä estävässä kosmetiikassa. GA on fytokemikaali, jota löytyy erilaisista hedelmistä ja vihanneksista, mukaan lukien viinirypäleet, tomaatit ja vihreä tee, jolla tiedetään olevan runsaasti antioksidantteja ja antibakteerisia. effects.9 Vaikka GA:ta käytetään kosmetiikka- ja elintarviketeollisuudessa näiden hyödyllisten mmffects, sen muotoilu on taipumus olla epävakaa.10 Näin kehitimme (galloyyli)2–KTPPTTP (gal2–Pep) lisätäkseen GA:n vakautta sitomalla se PGC:hen-1a-peräinen peptidi TTPTTP.

Tässä tutkimuksessa syntetisoimme (galloyyli)2–KTPPTTP (gal2– Pep) peptidiformulaatio konjugaatiossa gallushapon kanssa ja vahvistettusen potentiaali antioksidanttina ja ikääntymistä estävänä aineena.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Materiaalit

Dulbeccon muokattuEagle's Medium (DMEM), penisilliini/streptomysiini, sikiön naudan seerumi (FBS), fosfaatti-buffsaatusuolaliuos (PBS) ja trypsiini ostettiin Gibcolta (Carls

huono, CA). Hydroksibentsotriatsoli (HOBt), di-isopropyylikarbodi-imidi (DIC), 1,8-diatsabisyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU),N, N-di-isopropyylietyyliamiini (DIEA), gallushappo jaN-sukkinyyli-tri-alanyyli-pnitroanilidi saatiin Sigma-Aldrichilta (St. Louis, MO).L- Muodosta aminohappoja (Fmoc-Lys (Boc)–OH, Fmoc-Thr (tBu)–OH ja Fmoc-Pro–OH) ostettiin Bead-Techiltä (Soul,Korea).

2.2. Peptidien ja gallushappoon kytkettyjen peptidien synteesi

Kaikki peptidit syntetisoitiin 2-klooritrityylikloridihartsilla (200mmol-asteikko, korvausarvo¼ 1,46 mmol g 1) käyttämällä HOBt–DIC-välitteinen kiinteäfaasinen peptidisynteesi (SPPS).

Peptidisynteesi SPPS-menetelmää käyttäen suoritettiin vähäisellä modifikaatiollakationeja, jotka viittaavat aikaisempiin tutkimuksiin.11–13 2-klooritrityylikloridi (CTC) -hartsia turvotettiin dikloorissa

metaani (DCM, 8 ml) 30 minuutin ajan. Hartsi pestiindimetyyliformamidi (DMF). Kaikki reaktiot suoritettiin huoneenlämpötilassa. Fmoc-suojatut aminohappojohdannaiset (2 ekvivalenttia(Vastaa.), vartenfiensimmäiseksi kiinnittynyt aminohappo tai 5 ekv. muiden aminohappojen osalta) kytkettiin joko DIEA:n (5 ekv. kiinnittyneen aminohapon osalta) tai HOBt/DIC:n (6 ekv./5 ekv.) kanssa DMF a:ssa.fterFmoc:n suojauksen poistaminen käyttämällä 2 % (v/v) DBU:ta DMF:ssä (2 kertaa, 2 min kerrallaan, 8 ml). Ja kaikki vaiheet pestiin 5 kertaa DMF:llä. Lopullinen gallushappo kytkettiin lysiiniin kiinnittyneiden peptidien kanssa.Gallushapon kytkemisen jälkeen hartsi oliasuodatettu, pesty,ja kuivattiin korkeassa tyhjiössä. Pilkkomisliuos (TFA:deionisoitu [DI] vesi: TIS¼ 95:2,5:2,5, v/v/v %) käsiteltiin 2 tuntiaraakapeptidien saamiseksi. Raakapeptidit saostettiin ja pestiin kolme kertaa kylmällä dietyylieetterillä.

Analyyttinen käänteisfaasi korkean suorituskyvyn nestekromatografia(RP-HPLC) suoritettiin Waters 2695 Separations -laitteellaModuuli Capcell Pak C18 -kolonnilla (4,6 mm 250 mm, 5mm, Shiseido). Liikkuva vaihe koostui 0,05 prosenttia TFA:sta H2O (liikkuva faasi A) ja 0,05 prosenttia TFA:ta asetonitriilissä (liikkuva faasi B).

Eluutio saavutettiin käyttämällä matkaviestinten lineaarista gradienttiavaihe B 5 prosentista 65 prosenttiin 30 minuutin aikana avirtausnopeus 1.0 ml min 1. Peptidihuiput havaittiin aallonpituudella 230 nm. Puolipreparatiivinen RP-HPLC suoritettiin Waters HPLC -järjestelmällä (Pump 600E, Detector UV-484) Gemini RP-C18:lla.kolonni (21,2 mm 250 mm, 5mm, Phenomenex). Liikkuva vaihe koostui 0,05 prosenttia TFA:sta H2O (liikkuva vaihe A)ja 0,05 % TFA:ta asetonitriilissä (liikkuva faasi B). Eluointi saavutettiin käyttämällä lineaarista gradienttia liikkuvalle faasille B7 prosentista 22 prosenttiin 15 minuutin aikana alvirtausnopeus 10 ml min 1. Thepeptidihuiput havaittiin spektrofotometrisesti aallonpituudella 230 nm.

Syntetisoidut peptidit liuotettiin 5-prosenttiseen muurahaishappoon vedessä ja analysoitiin sähkösumutusionisaatiolla (ESI)/kvadrupoli-aika-light (Q-TOF) tandemmassaspektroskopia(MS) -järjestelmä (TripleTOF6600, ABSciex, Foster City, CA). Näytteet injektoitiin Q-TOF-järjestelmään, joka oli varustettunano-suihkulähde osoitteessa alhinta 1mL min 1. ESI-ionilähdeparametrit olivat seuraavat: ionisuihkujännite 1,5 kV, verhokaasu 10 psi:ssä ja vaippakaasu 5 psi:ssä. Spektrit sisääntäyden skannauksen tila ja MS/MS kerättiin alueellam/z

100–1200 Da kerääntymisajalla 25 ms spektriä kohti.Törmäysenergia nostettiin arvosta 10 arvoon 80. Tuloksenatiedot hankittiin käyttämällä Analyst TF sotavarat ja automaattisestimääritetään sentroidilla 80 prosentilla minimihuipulla, 10 prosentin kohinanvaimennus, keskitasoinen deisotooppi 3 prosentin kynnyksellä, ei kohinanvaimennusta eikä tasoitusta. Syntetisoidut peptidit tunnistettiinmassatoleranssilla 0.05 Da ja sekvensoitu manuaalisesti käyttämällä MS/MS-toleranssia 0.01 Da.

2.3. Soluviljelmät ja elinkelpoisuusmääritykset

Ihmisen, aikuisen, vähän kalsiumia, korkean lämpötilan (HaCaT) solutja CCD{0}}Sk (normaali ihmisen ihofibroblasti) solut olivatviljelty DMEM:ssä, jossa on 10 prosenttia FBS:ää ja 1 prosenttia penisilliiniä/streptomysiini. Soluja inkuboitiin 37 °C:ssa C kostutetussa ilmakammiossa, jossa on 5 prosenttia CO2.Elinkykymäärityksissä käytettiin solulaskentasarjaa-8 (CCK-8, Dojindo Co. Ltd. Beijing, Kiina). HaCaT ja CCD-1064Sk-solutkylvettiin 96-kuoppamikrolevyille (5 103 soluja per kuoppa) ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 5 prosentissa CO:ssa2 24 tunnin ajan. Viljelmät altistettiin sitten syntetisoitujen peptidien tai GA:n erilaisille pitoisuuksille ja inkuboitiin 37 °C:ssa. C 5 prosentissa CO:ssa2 24 tunnin ajan. Solujen elinkelpoisuusmitattiin myöhemmin käyttämällä CCK:ta{0}} valmistajan ohjeiden mukaisesti.

2.4. Antioksidanttiaktiivisuuden määrittäminen

2.4.1. DPPH-määritys.Syntetisoidun antioksidanttiaktiivisuuspeptidit ja GA arvioitiin yksittäin käyttämällä DPPH-määritystä. DPPH-määritykset suoritettiin aiemmin raportoitujen ohjeiden mukaisesti

menetelmä pienillä muokkauksillakationi.12,14–16 Ensin 0,12 mg ml 1 DPPH-liuos valmistettiin metanoliin, sitten 100 uimL DPPH-liuosta ja 100 uimL syntetisoituja peptidejä tai GA:ta sekoitettiin eri pitoisuuksina ({{0}},1 mM, 0,05 mM, 0,01 mM ja 1 ugmM) 96-kuoppamikrolevyillä. Orbital-ravisteluhautomossaseosten annettiin reagoida 30 minuuttia 37 °C:ssa C ja 100 rpm ilmanvaloa. Absorbanssi mitattiin sitten aallonpituudella 517 nm ja antioksidanttikapasiteetti laskettiin.

2.4.2. ROS-poistotoiminta.

Solunsisäinen ROS-poistoaktiivisuus arvioitiin käyttämällä 20,70-dikloorifluoreseiinidiasetaattipakkausta(DCF-DA, Abcam, USA). HaCaT-solut kylvettiin 96-kuoppamikrolevyille (5 103 soluja per kuoppa) ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 24 tuntia.AftInkuboinnin jälkeen viljelmät altistettiin syntetisoiduille peptideille tai GA:lle (100mM) ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 24 tuntia. Sitten solut altistettiin 10 °C:llemM DCF-DA -liuoksella ja inkuboitiin 30 minuuttia. AftInkuboinnin jälkeen liuos pestiin PBS:llä. Thesolut analysoitiin käyttämällä mikrolevylukijaa virityksessä ja

emissioaallonpituudet 485 nm ja 530 nm.

Kuva 1Peptidien synteettinen vaihe ja sekvenssin vahvistus käyttämällä kvadrupoliaikaalento(Q-TOF) massaspektrometria: (a) yksityiskohtainen synteesimenetelmä (b) TPPTTP, (c) galloyyli–TPPTTP ja (d) (galloyyli)2–KTPPTTP.

2.5. Mitokondrioiden kalvopotentiaalin määritys

JC-1-väriä (Thermo Fisher, USA) käytettiin mitokondrioillekalvopotentiaali (MmP) -määritys. CCD-1064Sk- ja HaCaT-solut kylvettiin 96-kuoppamikrolevyille (5 10 3soluja kuoppaa kohti)

ja inkuboitiin 37 C ja 5 % CO2 24 tunnin ajan. Afteli inkubaatio,viljelmät altistettiin syntetisoitujen peptidien eri pitoisuuksille ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 5 prosentissa CO:ssa2 24 tunnin ajan.JC-1-väriainetta lisättiin CCD-1064Sk- ja HaCaT-soluihintuottaa a lopullinen pitoisuus 10mM. Aft10 minuutin inkuboinnin jälkeen solut pestiin kahdesti 37:lla C PBS. Vihreä ja punainenfluoresenssimitattiin Varioskan LUX:illaMultimode-mikrolevylukija (ThermoFisher, USA) osoitteessa excitaatio (lEsim)/päästö (lEm) 475/530 nm ja alEsim/lEm475/590 nm, vastaavasti.

2.6. Elastaasia estävän aktiivisuuden määritys

CCD{0}}Sk-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 5 prosentissa CO:ssa2 24 tunnin ajan. Viljelmät altistettiin sitten pitoisuudelle 100 uimM syntetisoituja peptidejä tai GA:ta ja inkuboitiin 37 °C:ssa C 5 prosentissa CO:ssa2 24 tunnin ajan. Solut pestiin dPBS:llä kahdesti ja keräsimme jokaisen solun käyttämällä solukaavinta. Aer lisäämällä 0.2 M Tris–HCl (pH 8.0), jossa on 0,1 prosenttia Triton-X:ää kerättyynsolut, solut homogenisoitiin ultraäänilaitteella. Homogenisoitua liuosta sentrifugoitiin 20 minuuttia nopeudella 3000 rpmja 4 C. Sitten after ottaen supernatantin, proteiinimäärät-kationi suoritettiin käyttämällä BCA-proteiinimääritystä. Proteiinia jokaisellenäyte jaettiin osoitteessafilopullinen pitoisuus 100mgmL 1, jaN-sukkinyyli-tri-alanyyli-p-nitroanilidiä lisättiinlopullinen konsentraatio 1,6 mM ja reagoi 36 °C:ssa C 1 tunnin ajan.Sitten absorbanssi mitattiin 405 nm:ssä käyttäen mikrolevylukijaa.

2.7. RT-qPCR

Anti-aging-merkkien mRNA-tasot CCK-1064Sk-soluissaarvioitiin käyttämällä RT-qPCR:ää. Kokonais-RNA kerättiin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, CA) ja käänteistä

kopioitu käyttäen PrimeScript RT -reagenssisarjaa (Takara BioInc., Kusatsu, Japani). CFX96-järjestelmä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) ja iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Labora)

tories) käytettiin RT-qPCR:ssä.b-Aktiinia käytettiin normalisoimaan tyypin I kollageenin, MMP{1}} ja PGC-1 mRNA-tasot.a. 

2.8. Tilastollinen analyysi

 Tiedot esitetään keskiarvona standardipoikkeamakolme itsenäistä mittausta ja analysoitu Studentin avullat-testit, joissa ap < 0.05 considered to be a signiei voi eroa.

Kysy lisää:

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950