Immuniteetin arviointi SARS-CoV-2 IgG-vasta-aineiden kvantitatiivisella mittauksella sormenpäänäytteissä
Apr 13, 2023
Abstrakti
COVID{0}} on vaikuttanut suoraan tai epäsuorasti miljardeihin ihmisiin ympäri maailmaa. Pandemiaan reagoinnissa on keskitytty taudin leviämisen estämiseen ja hoitomahdollisuuksien parantamiseen. Diagnostiikkateknologiat ovat olleet avainasemassa tässä vastauksessa pandemian alusta lähtien. Kun rokotteita ja muita hoitoja on kehitetty ja otettu käyttöön, kiinnostus yksilön immuunisuojelun tason ymmärtämiseen ja mittaamiseen on lisääntynyt. Historiallisesti vasta-ainetiitterien käyttöä systeemisen immuniteetin mittaamiseen on rajoittanut epätäydellinen ymmärrys vasta-aineiden ja immuniteetin välisestä suhteesta, vasta-ainepitoisuutta koskevien kansainvälisten standardien puute tutkimusten välisten vertailujen mahdollistamiseksi ja riittämättömät kliiniset tiedot kehityksen mahdollistamiseksi. vankkaista vasta-aineimmuniteettimalleista.
Nämä rajoitteet ovat kuitenkin viime aikoina muuttuneet. Vasta-aineiden syvempi ymmärtäminen, WHO:n vasta-ainestandardien levittäminen ja immuniteettimallien kehittäminen useiden COVID{0}}-rokotekokeiden tietosarjoja käyttäen, joten tietyntyyppiset kvantitatiiviset vasta-ainetestit voivat nyt tarjota tavan seurata yksilön tai yhteisön immuniteettia. COVIDia vastaan-19. Tarkemmin sanottuna testit, jotka määrittävät anti-RBD IgG -vasta-aineiden, jotka kohdistuvat SARS-CoV-2 -viruksen S1-piikkiproteiinikomponentin reseptoria sitovaan domeeniin, pitoisuuden osoittavat lupaavia hyödyllisiä ja skaalautuvia COVID-mittauksia. {6}} koskemattomuus sekä yksilöiltä että yhteisöiltä. Tämän lupauksen täyttämiseksi tarvitaan kuitenkin nopea ja helppokäyttöinen testi.
Vastatakseen tähän tärkeään kliiniseen tarpeeseen Brevitest otti käyttöön hoitopisteeseen sopivan teknologia-alustan, joka voi suorittaa nopean (<15 minute), quantitative antibody test with a sample of 10 µl of whole blood from a fingerstick. The test we validated on this platform measures the concentration of anti-RBD IgG in Binding Antibody Units per milliliter (BAU/mL) per WHO Reference Standard NIBSC 20/136.
Tässä artikkelissa esittelemme tutkimuksia, joita on käytetty Brevitest anti-RBD IgG -määrityksen karakterisoimiseen ja sen kliinisen suorituskyvyn, mittauksen alarajojen, tarkkuuden, lineaarisuuden, häiriön ja ristireaktiivisuuden arvioimiseen. Tulokset osoittavat tämän määrityksen kyvyn mitata potilaan anti-RBD IgG-pitoisuus. Nämä tiedot yhdessä viimeaikaisista COVID-19-rokotekliinisistä tutkimuksista kehitettyjen mallien kanssa voivat tarjota keinon arvioida yksilön tai yhteisön immuunisuojelun nykyistä tasoa COVID-19-infektiota vastaan.
Siksi meidän on jokapäiväisessä elämässämme aktiivisesti parannettava vastustuskykyämme ja noudatettava terveitä elämäntapoja: riittävä uni, terveellinen ruokavalio, kohtuullinen liikunta ja huonojen tapojen, kuten tupakoinnin, välttäminen ovat perusedellytyksiä vastustuskyvyn parantamiselle ja oikea liikunta. Lisäksi havaitsimme, että Cistanche voi myös parantaa immuniteettia, ja Cistanchen sisältämät fenyylietanoidiglykosidit voivat estää immunosuppressiivisten tekijöiden tuotantoa ja vaikutusta, mikä parantaa kehon vastustuskykyä.
Johdanto
Severe Acute Respiratory Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) on uusi koronavirus, joka nousi vakavan hengitystiesairauden (COVID-19) aiheuttajaksi joulukuussa 2019 Kiinassa ja levisi nopeasti aiheuttaen maailmanlaajuisen pandemian. . SARS-CoV-2-virus on osa Coronaviridae-heimon Betacoronavirus-sukuun. Muita jäseniä ovat vakava akuutti hengitystieoireyhtymä Coronavirus 1 (SARS-CoV-1) ja Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV).1 Viruksen korkea tarttuvuus johti sen nopeaan maailmanlaajuiseen leviämiseen ennennäkemättömistä ponnisteluista huolimatta. kansanterveysviranomaiset hidastamaan pandemian etenemistä, mukaan lukien sulkemiset, maskivaltuutukset, julkisen hygienian edistäminen, julkiset investoinnit nopeaan rokotteiden ja terapeuttiseen kehittämiseen sekä muut toimenpiteet.
Diagnostinen testaus aktiivisen virusinfektion havaitsemiseksi ja kehon immuunivasteen arvioiminen virushaasteeseen on ollut ratkaisevassa roolissa pandemiaan reagoinnissa sekä taudin ja sen vaikutusten elimistössä ymmärtämisessä. Viruksen suoraa havaitsemista varten hengitysteissä on kehitetty lukuisia nukleiinihapon monistusmäärityksiä (mukaan lukien PCR-määritykset) ja virusantigeenimäärityksiä. Nämä testit ovat osoittautuneet kliinisen diagnoosin ja taudinhallintastrategioiden tärkeiksi osiksi. Viruksen havaitsemis- ja kvantitointimääritykset eivät kuitenkaan anna tietoa kehon immuunihistoriasta, -vasteesta tai -tilasta, eivätkä ne anna mitään viitteitä tulevan infektion tai uudelleeninfektion riskistä.
Tarvitsemme serologisia määrityksiä ymmärtääksemme, kuinka potilaan immuunijärjestelmä reagoi virukseen. Ennen laajaa molekyylitestausta ja rokotusta näitä määrityksiä käytettiin joskus myös SARS-CoV-infektion diagnosoimiseen-2. Tämän lähestymistavan perusteena oli, että vasta-aineiden läsnäoloa uutta virusta vastaan, erityisesti IgM-vasta-aineita, ilman aiempaa infektiota, voitaisiin käyttää nykyisen infektion diagnosoimiseen, jos siihen liittyy samanlaisia kliinisiä oireita. Tämä diagnostinen lähestymistapa kuitenkin hylättiin suurelta osin pandemian varhaisessa vaiheessa antigeeni- ja nukleiinihappotestien (NAT) nopean kasvun ja helpon saatavuuden vuoksi. Siitä huolimatta serologisissa testeissä löydettiin joitain käyttötarkoituksia epidemiologiseen seurantaan ja taudinpurkauksen torjuntaan tietyissä populaatioissa.
Pandemian edetessä hallitusten, tutkijoiden ja lääketeollisuuden yhteistyö johti useiden rokoteehdokkaiden kehittämiseen ja testaamiseen, mikä huipentui sarjaan terveysviranomaisten hyväksyntää maailmanlaajuisesti vuoden 2020 lopulla. Vaikka rokotukset vaikuttivat merkittävästi rokoteehdokkaisiin. Useimmissa tapauksissa infektioiden laajuuden ja vakavuuden vuoksi suojan väistämätön heikkeneminen oli odotettavissa rokotuksista aikaisemman kokemuksen perusteella. Tämän heikkenemisen luonne ja suojan tehokas kesto vaihtelevat kuitenkin suuresti rokotteiden ja yksilöiden välillä, ja suojan menettämisen vaikutus yhteisöön on edelleen tuntematon. Tästä syystä käydään jatkuvaa keskustelua rokotteiden tehosteannosten hyödyllisyydestä, tarpeesta ja ajoituksesta immuunisuojan ylläpitämiseksi virusta vastaan, keskustelu, joka on voimistunut alkuperäisen kannan eri muunnelmien ilmaantumisen myötä.
Jotta voitaisiin ymmärtää ja kuvata tarkasti yksilön vastetta rokotuksiin ja auttaa häntä tekemään yksilöllisiä päätöksiä parhaan saatavilla olevan tiedon avulla, tarvitaan kvantitatiivisia vasta-ainetestejä, jotka voivat mitata herkästi rokotteen, luonnollisen infektion tai näiden yhdistelmän tuottamia vasta-ainetasoja. Mutta vaikka herkkyys, spesifisyys ja toistettavuus ovat olennaisia, nopeat tulokset ja helppo annostelu (mukaan lukien sekä näytematriisi että testauspaikka) ovat myös toivottavia ominaisuuksia kaikille kokeille, joita odotetaan käytettävän laajasti.
Useat valmistajat ovat luoneet ja markkinoineet serologisia määrityksiä. Useimpien näiden immunomääritysten taustalla oleva tekniikka voidaan luokitella joko lateraalivirtaustesteiksi (LFT) tai entsyymi-immunomäärityksiksi (ELISA). LFT:t ovat yksinkertaisia käyttää ja vaativat pienen määrän verta, mutta tarkimmat LFT:t vaativat laskimopunktion seerumi- tai plasmanäytteen saamiseksi testiä varten. Viime aikoina on kehitetty muutamia serologisia LFT:itä, jotka voivat käyttää sormenpääverinäytteitä. Esimerkkejä kaupallisesti saatavista LFT:istä ovat InBiosin SCoV-2 Detect IgG Rapid Test2 ja Access Bion CareStart COVID-19 IgM/IgG3. Helppokäyttöisyydestään ja tulosten nopeasta käänteestä huolimatta LFT:iden haasteena on niiden kvantifioinnin puute ja luonnostaan alhaisempi herkkyys verrattuna laboratorio-ELISA-testeihin4. Herkkyysrajoitus johtuu signaalin entsyymivahvistuksen puuttumisesta ja pesuvaiheiden puutteesta reaktioiden välillä reagoivien kemikaalien erottamiseksi. LFT:illä on kuitenkin merkittävä rooli diagnostiikassa alhaisten kustannustensa, nopeudensa ja helppokäyttöisyytensä vuoksi.
Toinen tärkeä immunomääritystestien luokka on ELISA. Entsyymi-immunosorbenttimääritykset suoritetaan tavallisesti käyttämällä yhtä kahdesta menetelmästä:
1. ELISA-laboratoriosarjat, jotka on tarkoitettu käytettäväksi sertifioiduissa laboratorioissa, joissa käytetään 96-kuoppamikrolevyjä yhdessä levynlukijoiden kanssa (esim. ZEUS ELISA SARS-CoV-2 IgG Test System5 tai EUROIMMUN Anti-SARS- CoV-2 ELISA (IgG)6).
2. Esiladatut kasetit, jotka on tarkoitettu käytettäväksi patentoiduilla laboratorion immunoanalysaattoreilla (esim. Rochen Elecsys Anti-SARS-CoV- 7 tai Siemens ADVIA Centaur SARS-CoV-2 IgG (sCOVG)8 ). Nämä ELISA-testit ovat korkeamman herkkyyden testejä, jotka ovat usein puolikvantitatiivisia.
Valitettavasti näistä menetelmistä puuttuu LFT:iden nopeus ja helppokäyttöisyys, mikä vaatii laskimopunktioverta kliinisenä näytteenä ja koulutettua henkilökuntaa suorittamaan testit sertifioidussa laboratoriossa, jonka on usein tehtävä merkittäviä pääomasijoituksia korkean testauskapasiteetin saavuttamiseksi. Tulosten läpimenoaika on yleensä muutamassa päivässä, riippuen testaustoiminnan tehokkuudesta. Tehokkaimmatkin toiminnot voivat kuitenkin tuottaa testituloksia vain muutamassa tunnissa taustalla olevan immunomääritystekniikan rajoitusten vuoksi.
Brevitest Technologies, Inc. (Brevitest) on kehittänyt immuunimääritysalustan, joka suorittaa entsyymi-immunomääritykset hoitopisteessä 15 minuutissa. Siinä yhdistyvät LFT:n (yksinkertaisuus, pieni näytemäärä, hinta ja nopeus) ja ELISA:n (herkkyys, spesifisyys, tarkkuus, kvantitointi ja luotettavuus) edut. Brevitest-alusta koostuu näytteenkäsittely-yksiköstä (SPU), joka suorittaa yksittäisiä testejä kertakäyttöisillä testipatruunoilla. SPU on pieni robottilaite, joka on täysin automatisoitu ja on vuorovaikutuksessa pilvessä toimivan keskusanalyysi- ja tietokantajärjestelmän (Brevitest Cloud) kanssa. Se käyttää patentoitua patruunaa, joka sisältää kaikkien ELISA-vaiheiden suorittamiseen tarvittavia reagensseja, ja käyttää lämpöä ja liikkuvia magneetteja reaktioprosessin ohjaamiseen.
Kun reaktiot ovat päättyneet, SPU mittaa indikaattorireagenssin värinmuutoksen, joka johtuu ELISA-prosessin viimeisestä vaiheesta. Optiset raakalukemat siirretään turvallisesti Brevitest Cloudiin analysoitavaksi ja prosessoitavaksi ennen kuin tulos on reaaliajassa potilaan ja lääkärin saatavilla. Olemme aiemmin julkaisseet tämän alustan käytön anti-SARS-CoV-2-erittävän IgA:n havaitsemiseen syljestä. 9
Brevitest on kehittänyt ja validoinut määrityksen SARS-CoV-2 anti-RBD IgG-vasta-aineiden kvantifioimiseksi sormenpääveressä alle 15 minuutissa omalla alustallaan. Tässä raportissa esittelemme validointitutkimuksista saatuja tietoja ja keskustelemme testin mahdollisista kliinisistä ja epidemiologisista käyttötavoista.
Materiaalit ja menetelmät
Materiaalit, instrumentit ja reagenssit: Brevitest-määritysalustassa on kolme osaa: näytteenkäsittelyyksikkö (SPU), esiladattu patruuna ja pilvipohjainen analyyttinen ohjelmisto (Brevitest Cloud). (Katso kuva 1.) SPU on miniatyrisoitu täysin automatisoitu robottilaite, jossa on mekaanisia, optisia ja lämpöä sääteleviä elementtejä. SPU käyttää kestomagneetteja ohjaamaan magneettisten mikropallojen liikettä patruunan useissa osastoissa ja värähtelee kunkin lokeron magneetteja käyttämällä omia sekoituskuvioita.
Jokaisessa osastossa näiden mikropallojen pinnalla tapahtuu yksi monivaiheisen ELISA-reaktion vaihe. Lopullinen reaktio johtaa värillisen yhdisteen tuotantoon, joka mitataan optisena signaalina ja raakalukemat lähetetään Brevitest Cloudiin analysoitavaksi. Alustassa on useita suojatoimia, joilla varmistetaan, että patruuna on asetettu oikein, suoritetaan oikea testi, että patruunan viimeinen käyttöpäivä ei ole ohi, testitulokset ovat päteviä ja potilaan tunnistettavissa olevat tiedot eivät ole vaarassa.
Patruuna on esiladattu Brevitestin COVID-19 IgG-määrityksen suorittamiseen tarvittavilla reagensseilla. Patruuna ei ole mikrofluidilaite, koska patruunan sisällä ei liiku reagenssit; sen sijaan tärkeimmät ELISA-komponentit – antigeeni, sieppausvasta-aine ja merkkivasta-aine – on sidottu magneettisiin mikropalloihin, joita siirretään reagenssikuoppien välillä. Siepattu antigeeni on SARS-CoV-2 -viruksen S1-proteiinin reseptorisitoutumisdomeeni (RBD). Siepattu IgG havaitaan sitten käyttämällä anti-ihmis-IgG:tä, joka on liitetty piparjuuriperoksidaasi (HRP) -molekyyliin. Lopullinen värinmuutos tapahtuu TMB:tä sisältävässä osastossa, joka muuttuu värittömästä siniseksi HRP:n läsnä ollessa. Jokainen patruuna on konfiguroitu suorittamaan 3 ELISA-reaktiota samanaikaisesti erillisissä kanavissa. Kaksi kanavaa sisältävät näytteen korkealla ja matalalla laimennuksella, ja yksi kanava on ladattu tunnetulla pitoisuudella anti-SARS-CoV-2 Spike S1 IgG:tä laadunvalvontaa varten. Testausmateriaalit, jotka sisältävät SPU:n ja patruunat, on kehitetty Brevitest Technologies, Inc:ssä ja valmistettu heidän CLIA-sertifioidussa laboratoriossa.
Näytteet kerättiin koehenkilöiltä IRB-hyväksytyn protokollan mukaisesti saatuaan suostumuksen IRB:n hyväksymällä tietoon perustuvalla suostumuslomakkeella. Näytteet sisältävät sormenpääverta, joka on saatu tavanomaisten menetelmien mukaisesti asianmukaisin varotoimin. Sormenpääveren keräämiseksi Brevitest-määritystä varten käytettiin 28 G kertakäyttöistä lansettia, jonka jälkeen kerättiin 10 µl:n kertakäyttöisellä kiinteän tilavuuden mikrokapillaariputkella. Valmistajan tiedot mikrokapillaariputkesta osoittavat, että näytteen tilavuus vaihtelee<1% on clinical tests. The clinical history of the subjects was collected in a questionnaire and recorded before taking their sample.
Kliininen validointi: Sormenpäänäytteitä (107 näytettä) otettiin henkilöiltä, jotka vastasivat kutsuun osallistua kliiniseen tutkimukseen, joka suoritettiin Brevitestin CLIA-sertifioidussa laboratoriossa Houstonissa, Texasissa. Yhdeksänkymmentä (90) näytettä otettiin niiltä, joilla oli raportoitu SARS-CoV-2-infektio ja/tai heiltä, jotka olivat saaneet vähintään yhden annoksen mitä tahansa kolmesta rokotteesta, ja ne luokiteltiin "positiivisiksi". Seitsemäntoista (17) näytettä otettiin henkilöiltä, joilla ei ollut lääketieteellistä historiaa SARS-CoV-2-infektiosta ja jotka eivät koskaan saaneet COVID{8}}-rokotetta, ja ne luokiteltiin "negatiivisiksi".
Tarkkuus: Määrityksen tarkkuus karakterisoitiin CLSI EP{0}}A3:n ohjaamassa tutkimuksessa. Tässä tutkimuksessa testattiin kolme näytettä, jotka edustavat rutiinikliinisissä toimenpiteissä havaittujen pitoisuuksien kirjoa. Näytteet testattiin kahden rinnakkaisina kolmen päivän ajan kahdella eri erällä päivässä (yhteensä kuudella erällä) ja kolmella analysaattorilla. Ohjelmisto Analyse-it käytettiin tulosten laskemiseen.
Ristireaktiivisuus ja häiriöt: Ristireaktiivisuuden testaamiseksi Brevitest-määrityksessä BioIVT:ltä hankittiin sarja näytteitä, joiden tiedettiin olevan negatiivinen SARS-CoV-2 ja positiivinen seuraavien virusten IgG-vasta-aineille: influenssa A , influenssa B, HBV, HCV, HIV, Haemophilus influenzae, alfakoronavirukset 229E ja NL63, beetakoronavirukset OC43 ja HKU1, RSV, parainfluenssa ja Mycoplasma pneumonia. Nämä näytteet testattiin Brevitest-määrityksellä, ja ne, joiden tulokset olivat alle havainnointirajan (LOD; 6,2 BAU/ml), luokiteltiin ei-ristireaktiivisiksi.
Sun Diagnosticsilta hankittiin yleisiä häiriötekijöitä näytteiden siivittämiseksi ja niiden vaikutuksen määrittämiseksi testiin. Neljään sormenpään näytteeseen, jotka eivät sisältäneet häiriötekijää (matala ja korkea SARS-CoV-2 IgG-näytteet), lisättiin hemolysaattia (1000 mg/dl), triglyseridejä sisältäviä lipoproteiineja (500 mg/dl) ja konjugoitua bilirubiinia (40 mg) /dL). Prosentuaalinen ero kontrollinäytteeseen laskettiin jokaiselle piikkinäytteelle ja tulosten tulkinnat tutkittiin.
Määrityksen analyyttinen suorituskyky: Määrityksen havaitsemisominaisuudet, mukaan lukien tyhjän kokeen raja (LOB) ja LOD, määritettiin CLSI EP{{0}}A2:n ohjeiden perusteella. LOB:n saamiseksi testattiin 4 tyhjää sormenpäänäytettä 2 rinnakkaisina 3 päivän ajan 2 erällä ja 3 analysaattorilla. LOD määritettiin testaamalla 4 matalan tason näytettä 2 rinnakkaisina 3 päivän ajan 2 erällä ja 3 analysaattorilla. Neljä matalan tason näytettä luotiin sekoittamalla vahvistetut negatiiviset näytteet tunnetun määrän kanssa WHO-standardia (0,17 µl 1000 BAU/ml standardia). Kvantitointiraja (LOQ) laskettiin pienimmältä testatulta pitoisuudelta, joka oli suurempi kuin LOD plus 4,5 kertaa LOD-tutkimuksessamme havaittu standardipoikkeama. Tilastollinen analyysi suoritettiin Analyse-it-ohjelmistolla. Lineaarisuuden määrittämiseksi suoritettiin CLSI EP{21}}A:n tutkimusopas. Tyhjiä näytteitä lisättiin kansainvälisellä WHO-standardilla (WHO:n viitestandardi NIBSC 20/136) 10 tunnetun pitoisuuden omaavan näytteen valmistamiseksi. Näytteet testattiin 4 rinnakkaisena käyttäen yhtä reagenssierää.
Tulokset
Väestötiedot: Testatun väestön demografisten tietojen erittely on esitetty alla (taulukko 1).
Kliininen suorituskyky: Koska sormenpään kokoverestä ei ollut käytännöllistä ottaa COVID-ä edeltäviä näytteitä ja koska COVID-19 IgG-vasta-aineiden kvantitatiivista mittaamista varten ei ollut olemassa vertailutestiä sormenpäästä, suoritettiin kliiniseen historiaan perustuva kliininen sopimustutkimus. Näytteitä kerättiin yhteensä 107 koehenkilöltä. Näiltä koehenkilöiltä saatiin myös kliiniset historiatiedot; kaikki tiedot olivat itse raportoituja ja tiedot tarkistettiin mahdollisuuksien mukaan.
Näiden itse ilmoittamien kliinisen historiatietojen perusteella 17 koehenkilöllä ei koskaan ollut oireista COVID-infektiota-19, eikä heitä koskaan rokotettu. Muut 90 henkilöä olivat joko saaneet tartunnan, rokotuksen tai molemmat. Koehenkilöillä, joita ei ollut rokotettu tai infektoitunut, ei odotettu olevan havaittavia vasta-aineita (eli havaitsemisrajan alapuolella), ja ne luonnehdittiin negatiivisiksi. Muilla koehenkilöillä odotettiin olevan havaittavissa olevia vasta-aineita (eli havaitsemisrajan yläpuolella), ja heidät luonnehdittiin positiivisiksi.
Tulokset osoittivat, että yleinen positiivinen prosenttisopivuus (PPA)/herkkyys oli 97,8 prosenttia (95 prosentin CI: 92,42 prosenttia - 99,40 prosenttia ) ja yleinen negatiivinen prosentuaalinen sopimus (NPA)/spesifisyys 100 prosenttia (95 prosentin CI : 79,61 prosenttia - 100 prosenttia ). Katso taulukko 2.
Lineaarisuustutkimuksessa valmistettiin tunnettujen pitoisuuksien liuoksia ja testattiin Brevitest-laitteella saatujen arvojen vertailua varten. Lineaarisuus osoitettiin analyyttisellä mittausvälillä 22,2 - 2000 BAU/ml (katso kuva 2). Testatuista 10 näytteestä 2 pistettä, 0 BAU/ml ja 4000 BAU/ml poistettiin lineaarisesta alueesta (katso taulukko 5). Ottaen huomioon LOB-, LOD-, LOQ- ja lineaarisuuden arviot, analyyttinen mittausväli on 22,2 - 2000 BAU/ml.
Ristireaktiivisuus ja häiriöt: Arvioimme määrityksen mahdollisesti ristiinreagoivien vasta-aineiden varalta. Jotkut HCV-näytteet (2), HIV-näytteet (1) ja kaikki koronavirusnäytteet ylittivät SARS-CoV-2 IgG-testin havaitsemisrajan. Loput näytteet olivat LOD:n alapuolella (katso taulukko 6).
Keskustelu
Usein sanotaan, että infektio on sotaa taudinaiheuttajan ja isännän välillä. Tässä sodassa puolustuksemme keskeinen elementti – olipa kyseessä sitten yksittäistä infektiota tai globaalia pandemiaa vastaan – on ihmisen immuunijärjestelmä.
Perustasollaan immuunijärjestelmä koostuu soluista, proteiineista ja muista molekyyleistä, jotka toimivat yhdessä tunnistaakseen taudinaiheuttajia, ehkäistäkseen infektioita ja infektion tarttuessa eliminoivat tunkeutuvan taudinaiheuttajan tai saavuttavat kestävän "patogeenin" se.
Jatkaen sodan analogiaa, immuunijärjestelmällä on laaja "älykyky", joka käyttää solun pintareseptoreita, sytokiineja, kemokiineja, dendriittisoluja, immunoglobuliineja, suuria histamiinikomplekseja ja muita elementtejä tunnistaakseen myrkkyjä, bakteereja, sieniä, loisia ja viruksia. ja lähettää hälytyksiä immuunijärjestelmän muille osille, että uhka on havaittu ja toimia tarvitaan.
Vasteena immuunijärjestelmä mobilisoi laajan valikoiman "aseita" uhan neutraloimiseksi ja poistamiseksi, mukaan lukien, mutta ei niihin rajoittuen, reaktiiviset happilajit, antimikrobiset peptidit, efektori-B-solut, plasmasolut, CD4 T-solut, CD8 T-solut NK-solut, makrofagit, neutrofiilit ja poikkeuksellisen monipuolinen valikoima vapaita immunoglobuliineja tai vasta-aineita. Näitä komponentteja voidaan pitää kolmen suuren alajärjestelmän – synnynnäisen immuniteetin, limakalvojen immuniteetin ja humoraalisen immuniteetin – elementteinä, mutta näiden alajärjestelmien keskinäinen yhteys ja vuorovaikutus ovat laajat, mikä lisää sekä redundanssia että monimutkaisuutta koko immuunijärjestelmään. 10
Vasta-aineet ovat tärkeitä sekä limakalvon että humoraalisen immuniteetin vaikuttajia, mutta ne osallistuvat myös patogeenien tunnistus- ja signalointiprosesseihin. Niiden kaksi ensisijaista efektorimuotoa ovat neutralointi ja opsonointi, ja neutralointi on erityisen tärkeää, kun se altistetaan viruspatogeenille. Rokotteiden tutkijat ja kehittäjät ovat kiinnittäneet erityistä huomiota vasta-aineiden neutralointiin, koska ne pystyvät estämään viruksen RNA:n pääsyn isäntäsoluihin, mikä estää viruksen replikaatioprosessia, joka on välttämätön komponentti minkä tahansa vakavan infektion yhteydessä.
Vasta-aineiden suojaava rooli on osoitettu COVID{0}}:ssa sekä toipilaan seerumin että terapeuttisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka ovat osoittautuneet erityisen hyödyllisiksi henkilöillä, joilla on vähän endogeenisiä vasta-aineita.11,12 FDA on hyväksynyt monoklonaaliset vasta-aineet terapeuttisesti henkilöillä, joilla on äskettäin diagnosoitu COVID-19, ja profylaktisesti henkilöillä, jotka eivät pysty muodostamaan immuunivastetta SARS-CoV-virusta vastaan-2.13
Vaikka vasta-aineilla on tärkeä biologinen rooli immuniteetin vaikuttajina, niillä voi kuitenkin olla vielä tärkeämpi kliininen ja epidemiologinen rooli immuniteetin indikaattoreina.
Nämä roolit ovat usein sekaisin; kuulemme säännöllisesti, että "immuniteetti on enemmän kuin vasta-aineita" syynä olla testaamatta vasta-ainetasoja. Tämä havainto on tietysti totta. Vaatii enemmän kuin vasta-aineita sellaisen vankan, ylimääräisen ja nopean vasteen luomiseen, jota tarvitaan ihmislajin selviytymiseen vihamielisessä ympäristössä, jossa elämme.
Mutta kysymys ei ole siitä, ovatko vasta-ainetasot synonyymejä immuniteetille; kysymys on, korreloivatko vasta-ainetasot immuniteetin kanssa.
Kliinisestä näkökulmasta yleisen immuunisuojan tärkein mittari on oireisen infektion riskin väheneminen verrattuna yleiseen väestöön. (Oireettomat infektiot voivat olla merkityksellisiä tietyissä epidemiologisissa kysymyksissä, mutta niitä ei tyypillisesti pidetä kliinisesti merkittävänä sairaudena.) Tätä mittaria on käytetty laajalti COVID{0}}-rokotteiden tehokkuuden arvioinnissa.14
Esimerkiksi rokotekokeiden ensisijainen päätetapahtuma on "rokotteen tehokkuus", joka on infektion määrän väheneminen aktiivisessa (rokotetussa) ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (plasebo).
Koska tartuntaluvut ovat kuitenkin yleensä melko alhaiset, rokotekokeissa on pakostakin hyvin suuri määrä koehenkilöitä. Tällaisten kokeiden kesto ja kustannukset (sekä rahallisesti että riskinä ihmisten terveydelle) ovat olleet poliittisille päättäjille ja teollisuudelle merkittävä huolenaihe, koska ne rajoittavat vastausta nopeasti eteneviin virusepidemioihin, joista voi tulla maailmanlaajuisia pandemioita. Tämän seurauksena on jo pitkään haluttu löytää korvikebiomarkkeri, jota voidaan käyttää yksilöiden ja populaatioiden immuunitilan arvioimiseen ja siten ohjata sekä rokotteiden kehitystä että pandemiavasteen hallintaa.
Lyhyesti sanottuna haluamme helpon tavan mitata immuniteettia.
Ottaen huomioon sen, mitä tiedämme immuunijärjestelmän toiminnasta, vasta-aineet ovat ilmeinen mittausluokka, joka on otettava huomioon tässä roolissa. Ne osallistuvat sekä varhaiseen vasteeseen taudinaiheuttajahaasteeseen (pentameerisen IgM:n ja dimeerisen erittävän IgA:n synnyttämisen kautta) että pitkäaikaisessa immuniteetissa muisti-B-solujen kautta, jotka erilaistuvat vasta-aineita tuottaviksi plasmasoluiksi, kun patogeeni ilmaantuu uudelleen ja synnyttää sekundaarisen immuunijärjestelmän. vastaus.15
Vasta-aineiden käyttöä immuniteetin korrelaatteina on kuitenkin estänyt vastausten puute kahteen peruskysymykseen:
Vasta-ainepitoisuutta koskevan kansainvälisen standardin äskettäinen ilmestyminen oli tärkeä ensimmäinen askel näihin kahteen kysymykseen vastaamisessa. Ilman tällaista standardia vasta-ainetestiaineistojen vertailu vaihtelee vaikeasta epäkäytännölliseen mahdottomaan. WHO:n viitestandardi NIBSC 20/13616 perustettiin joulukuussa 2020, ja se on tärkeä ja tervetullut kehityskulku, joka lupaa nopeuttaa dramaattisesti kykyämme löytää ja levittää tutkijoita, kliinikkoja ja päättäjiä kiinnostavia oivalluksia.
Toinen merkittävä viimeaikainen kehitys, joka on dramaattisesti parantanut mahdollisuuksia immuniteetin mittaamiseen, on viimeisten 12 kuukauden aikana tehtyjen rokotekokeiden ennennäkemätön määrä ja laajuus. Kun näistä kokeista saatuja tietoja on julkaistu ja analysoitu, on syntynyt kaksi erittäin tärkeää oivallusta:
A. Neutraloivat vasta-aineet korreloivat voimakkaasti COVID{0}}-immuniteetin kanssa.17 Pandemian alusta lähtien tutkijat keskittyivät SARS-CoV-2-viruksen piikkiproteiiniin.
Tämä keskittyminen palkittiin ja vahvistettiin mRNA-rokotekokeiden tiedoilla, jotka osoittivat, että vasta-aineet rokotteen tuottamaa piikkiproteiinia vastaan olivat erittäin suojaavia.
B. Tietyt vasta-ainetestit ovat hyviä korrelaatioita COVID-suojalle-19. 18 Yllä olevan näkemyksen perusteella ei ole yllättävää, että neutralointimääritykset – sekä elävät virus- että pseudovirustyypit – ovat hyviä korrelaatioita COVID-immuniteetille-19 ja taudin vakavuuden vähentämiselle. Neutraloivat vasta-ainemääritykset ovat kuitenkin vaikeita (ja elävien virusmääritysten tapauksessa vaarallisia) suorittaa, mikä rajoittaa niiden saatavuuden vain muutamiin kliinisiin olosuhteisiin. Lisätutkimukset ovat kuitenkin havainneet, että RBD-domeenia vastaan sitoutuvat vasta-aineet korreloivat myös vahvasti suojan kanssa COVID--19 vastaan, mikä johtuu ehkä kilpailevan vasta-aineen sitoutumisen neutraloivasta vaikutuksesta, joka häiritsee piikkiproteiinin sitoutumista ACE:hen. {5}}-reseptori.
Kaikki nämä viimeaikaiset kehityssuunnat – kansainvälisen standardin syntyminen, neutraloivien vasta-aineiden tunnistaminen erinomaisina suojan korrelaatteina ja tämän korrelaation laajentaminen muihin, helpommin saavutettaviin vasta-ainetesteihin – ovat luoneet edellytykset dramaattiselle parantumiselle kliinisen hoidon hallinnassa. COVID{0}} käyttämällä vasta-ainetestejä oppaana. Mutta tämän parannuksen toteuttamiseksi tarvitaan testaustekniikka, joka voi tuottaa kvantitatiivisia tuloksia WHO:n standardiyksiköinä BAU/ml riittävän tarkasti hoitopisteessä kätevästä, potilasystävällisestä näytteestä nopeassa aikataulussa.
Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG -vasta-ainetesti on kvantitatiivinen testi, joka esittää tulokset BAU/ml:na WHO:n viitestandardin NIBSC 20/136 mukaisesti anti-SARS-CoV-2-vasta-aineelle. Tätä määritystä kehitettäessä LOB, LOD, LOQ, toistettavuus ja lineaarisuus mitattiin ja laskettiin. LOD:ksi laskettiin 6,2 BAU/ml ja Lwas OQ:ksi 22,2 BAU/ml. Tutkimukset näiden arvojen määrittämiseksi suoritettiin sormenpäänäytteillä potilailta, jotka eivät olleet aiemmin saaneet tartuntaa tai rokotettuja. Potilaiden näytteisiin lisättiin myös alhaiset WHO-standardien tasot, jotta laskelmissa käytettyjä näytteitä olisi alhainen. Lineaarisuuden testaamiseksi negatiiviseen näytteeseen lisättiin tunnettuja WHO-viitestandardin tasoja. Tulosten perusteella määrityksen kvantitatiiviseksi alueeksi määritettiin 22,2 - 2000 BAU/ml. Tarkkuustutkimukset osoittivat 13,8 prosentin tarkkuuden erän sisällä ja 23,4 prosentin CV:n toistettavuuden. Ristireaktiivisuus ja häiriöt testattiin myös sen määrittämiseksi, voisivatko mahdolliset näytteet tai aineet vaikuttaa testitulokseen.
Brevitest mittaa piikkiproteiinin RBD-osaa vastaan vasta-aineita, jotka korreloivat voimakkaasti neutraloivan aktiivisuuden kanssa.19 Äskettäin julkaistussa tutkimuksessa tutkijat analysoivat tiettyjen vasta-aineiden pitoisuuden ja SARS-CoV-2-suojan välistä yhteyttä. rokotteen tehokkuus, eli oireenmukaisten infektioiden määrän väheneminen rokotetuilla vs. rokottamattomilla henkilöillä. 18 Tutkimuksessa sitoutuvat ja neutraloivat vasta-aineet 28 päivän kuluttua toisesta annoksesta mitattiin infektoituneilla ja tartuttamattomilla rokotteen saajilla, ja vasta-ainepitoisuudet ilmoitettiin WHO:n vertailustandardia käyttäen. Rokotteen 50 prosentin tehokkuus SARS-CoV:n-2 enemmistöalfa (B.1.1.7) -muunnoksen oireenmukaista infektiota vastaan saavutettiin 95 prosentin varmuudella (VE50@95) anti-RBD-vasta-aineiden pitoisuudella 109 BAU/ml.18
Brevitest-määrityksessä tätä numeroa käytettiin asettamaan raja-ero "Matala" ja "Korkea" välillä, ja LOD:n alapuolella olevat arvot ilmoitettiin "None Detected". Kuva 3 esittää Brevitest-määrityksen raja-arvot. Näin ollen Brevitest Quantimmune™ COVID-19 IgG-vasta-ainetestin tuloksia voidaan käyttää suojan tason arvioimiseen kliinisissä olosuhteissa.
Nopean, kvantitatiivisen serologian saatavuus hoitopisteissä sormenpäästä käsin, jolla voidaan arvioida immuunisuojelun tasoa yksilön ja yhteisön tasolla, on ennennäkemätön, ja sillä voi olla syvällinen vaikutus pandemioiden, kuten COVIDin, reagoimiseen{{ 2}}. Esimerkiksi rokotteiden tehostehoidossa kansanterveysviranomaiset ja rokotteiden kehittäjät ovat tyypillisesti suositelleet tehosterokotteita tietyn ajan kuluttua. Nykyinen suositus esimerkiksi mRNA-rokotteille on saada tehosterokotus 6 kuukauden kuluttua. Tämä "kiinteä tehosteaika" -lähestymistapa voi kuitenkin olla epäoptimaalinen potilaille (erityisesti iäkkäille), joilla on taipumus menettää immuniteettinsa nopeammin kuin 6 kuukautta. Lisäksi monille ihmisille COVID-rokotus-19 antaa vähintään 12 kuukauden suojan. Tälle rokotetulle väestöryhmälle voisi olla optimaalista lykätä tehostehoitoa, kunnes heidän immuniteettinsa laskee alle kynnyksen. Tällaisella lykkäämisellä voi olla monia etuja: se voisi pidentää potilaan kokonaissuoja-aikaa, ehkä saada aikaan vahvemman ja tarkemman toissijaisen vasteen ja mahdollistaa rajoitettujen rokotetarvikkeiden paremman käytön.
Kuva 4 esittää Brevitestin kliinisestä validointitutkimuksesta otettuja tietoja, joissa näkyy vain koehenkilöt, jotka ovat saaneet mRNA-rokotteen (Moderna tai Pfizer-BioNTech). Vaikka tietojoukko on suhteellisen pieni (n=73), yli 12 prosenttia koehenkilöistä oli alle VE50@95-tason 109 BAU/ml ennen 6-kuukauden suositeltua tehostepäivämäärää, mikä viittaa siihen, että heillä saattaa olla suojakuilun, jos he odottaisivat tehostusta. Toisaalta yli 31 prosentilla koehenkilöistä vasta-ainetasot olivat yli VE50@95, mikä viittaa siihen, että heillä oli edelleen jäännösimmuniteetti ainakin B.1.1.7-varianttia vastaan, ja he saattoivat pidentää immuunisuoja-aikaansa siirtämällä tehostehoitoa. . Vaikka tällaiset päätökset tulisi aina tehdä kliinikon kanssa, tämä lähestymistapa voi olla hyödyllinen opas niille, jotka yrittävät hallita potilaan immuniteettia.
Toinen kliininen käyttötapaus voi olla immuunivasteen arviointi infektion tai rokotuksen jälkeen. Serokonversion erityispiirteet vaihtelevat yksilöiden iän, geneettisen koostumuksen, taustalla olevan sairauden, lääkityksen ja muiden tekijöiden mukaan. Rokotetut ihmiset tuottavat erilaisia ja eri pitoisuuksia vasta-aineita, ja nämä ominaisuudet muuttuvat ajan myötä. Tieto potilaan tämänhetkisestä vasta-ainepitoisuudesta voi ohjata elämäntapapäätöksiä ottamalla huomioon suojatasoon ja mahdolliseen virusaltistumiseen eri ympäristöissä liittyvät riskit.
Kolmas käyttötapa voisi olla vasta-ainehoitoa saavien potilaiden seulonnassa ja seurannassa, koska havaittujen vasta-aineiden määrät voivat vaikuttaa päätöksiin. On esimerkiksi osoitettu, että toipilaan plasma- ja terapeuttiset monoklonaaliset vasta-aineet ovat tehokkaampia potilailla, joilla ei ole vasta-aineita, verrattuna potilaisiin, joilla on endogeenisiä vasta-aineita SARS-CoV:ta vastaan-2. 11,12 Näin ollen näitä tietoja voidaan käyttää myös sellaisten potilaiden tunnistamiseen, jotka hyötyisivät enemmän monoklonaalisten vasta-aineiden antamisesta joko terapeuttisesti tai ennaltaehkäisevästi, ja auttaa terveydenhuollon tarjoajia näiden hoitojen hallinnassa.
Lopuksi seroprevalenssitutkimuksia voitaisiin parantaa huomattavasti käyttämällä kvantitatiivista vasta-ainetestiä lauman immuniteetin arvioimiseksi. Tehtiinpä sitten yhteisötasolla tai tietyissä muissa sopivissa ympäristöissä, kuten toimistoissa, tuotantolaitoksissa tai kouluissa, epidemiologinen mallinnus ja kansanterveyden päätöksenteko parantuisi huomattavasti tarkemmalla ja helpommin hallinnoitavalla testillä, erityisesti sellaisella, joka on pilviyhteydessä ja pystyy siten "lintuperspektiivistä" näkemykseen immuniteetista integroimalla reaaliaikaiset vasta-ainetulokset geopaikannus- ja kartoitusohjelmistojärjestelmään.
Johtopäätös
Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kvantitatiivinen anti-RBD IgG-vasta-ainetesti on hyödyllinen korrelaatti immuunisuojalle COVID-virusta vastaan-19. Tämän tärkeän oivalluksen vaikutuksen maksimoimiseksi testi, joka on nopea (<15 minutes) and precise, requiring only a fingerstick sample of blood, and capable of running in a point-of-care setting is needed.
Brevitest-määritys voi kvantifioida SARS-CoV-2 IgG-vasta-aineiden määrän sormenpäänäytteissä BAU/ml WHO:n viitestandardin 20/136 mukaisesti. Sen suorituskykyominaisuudet on esitetty tässä työssä. Määrityksen validointitesteissä määritettiin ja arvioitiin mittauksen alarajat, tarkkuus, lineaarisuus, häiriöt ja ristireaktiivisuus.
Mahdollisista käyttötavoista tämä testi voisi olla arvokas työkalu rokotteen tehosteen ajoituksen optimointiin, serokonversion vahvistamiseen immuunipuutteellisissa ja muissa riskiryhmissä, monoklonaalisten vasta-aineiden terapeuttisen ja ennaltaehkäisevän käytön optimoinnissa ja laajemmin yksilön ja populaation arvioinnissa. immuunivasteet, erityisesti IgG-vasta-aineiden tuotanto, jotka SARS-CoV-2 tai rokote laukaisee. Tiedot SARS-CoV-2-vasta-aineiden määrästä, joita yksilön näytteessä on tiettynä ajankohtana, voivat olla arvokkaita, koska ne voivat ohjata terapeuttisia, ennaltaehkäiseviä tai elämäntapapäätöksiä, jotka voivat ehkäistä tai hallita COVIDia-19 .
Viitteet
1 Lu, R., Zhao, X., Li, J., Niu, P., Yang, B., Wu, H., ... & Tan, W. (2020). Vuoden 2019 uuden koronaviruksen genominen karakterisointi ja epidemiologia: vaikutukset viruksen alkuperään ja reseptorisitoutumiseen. The Lancet, 395(10224), 565-574.
2 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. InBios International Inc. EUA210368 valtuutuskirje, 24. elokuuta 2021.
3 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. Access Bio Inc. EUA201309 Valtuutuskirje, 6. elokuuta 2021.
4 Trombetta, BA, Kandigian, SE, Kitchen, RR, Grauwet, K., Webb, PK, Miller, GA, ... & Suliman, S. (2021). Serologisten lateraalivirtausmääritysten arviointi vakavan akuutin hengitystieoireyhtymän koronaviruksen varalta-2. BMC-tartuntataudit, 21(1), 1-14.
5 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. ZEUS Scientific Inc. EUA201833 valtuutuskirje, 12. toukokuuta 2021.
6 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. EUROIMMUN US Inc.:n valtuutuskirje, 4.5.2020.
7 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. Roche Diagnostics EUA200514 valtuutuskirje, 19. toukokuuta 2021.
8 Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto. Siemens Healthcare Diagnostics Inc. EUA202670 valtuutuskirje, 17.6.2021.
9 Varadhachary, A., Chatterjee, D., Garza, J., Garr, RP, Foley, C., Letkeman, A., ... & Linbeck III, L. (2020). Syljen anti-SARS-CoV-2 IgA käytettävissä olevana biomarkkerina limakalvon immuniteetille COVID-virusta vastaan-19. MedRxiv.
10 Janeway, C. (2001). Immunobiologia: immuunijärjestelmä terveydessä ja sairauksissa. Seppele.
11 Hamilton, FW, Lee, TC, Arnold, DT, Lilford, R. ja Hemming, K. (2021). Onko toipilasplasma turhaa COVIDissa-19? Bayesin uudelleenanalyysi satunnaistetusta kontrolloidusta RECOVERY-tutkimuksesta. International Journal of Infectious Diseases.
12 Horby, PW, Mafham, M., Peto, L., Campbell, M., Pessoa-Amorim, G., Spata, E., ... & Landray, MJ (2021). Kasirivimabi ja imdevimabi potilailla, jotka joutuvat sairaalaan COVID-19 (RECOVERY): satunnaistettu, kontrolloitu, avoin alustatutkimus. medRxiv.
13 Deb, P., Molla, MMA ja Rahman, KSU (2021). Päivitys monoklonaaliseen vasta-aineeseen terapeuttisena vaihtoehtona COVIDia vastaan-19. Bioturvallisuus ja terveys.
14 Bernal, JL, Andrews, N., Gower, C., Robertson, C., Stowe, J., Tessier, E., ... & Ramsay, M. (2021). Pfizer-BioNTech- ja Oxford-AstraZeneca-rokotteiden tehokkuus covid-19-oireisiin, sairaalahoitoon ja iäkkäiden aikuisten kuolleisuuteen Englannissa: testinegatiivinen tapauskontrollitutkimus. BMJ, 373.
15 Parham, P. (2014). Immuunijärjestelmä. Garland Science.
16 Maailman terveysjärjestö. (2020). WHO:n kansainvälisen standardi- ja vertailupaneelin perustaminen antiSARS-CoV-2-vasta-aineille. Biologisen standardoinnin asiantuntijakomitea, Geneve, 9-10.
17 Khoury, DS, Cromer, D., Reynaldi, A., Schlub, TE, Wheatley, AK, Juno, JA, ... & Davenport, MP (2021). Neutraloivat vasta-ainetasot ennustavat hyvin immuunisuojaa oireellista SARS-CoV-2-infektiota vastaan. Luonnonlääketiede, 1-7.
18 Feng, S., Phillips, DJ, White, T., Sayal, H., Aley, PK, Bibi, S., ... & Voysey, M. (2021). Korreloi suojan oireellista ja oireetonta SARS-CoV-2-infektiota vastaan. Luonnonlääketiede, 1-9.
19 Dolscheid‐Pommerich, R., Bartok, E., Renn, M., Kümmerer, BM, Schulte, B., Schmithausen, RM, ... & Hartmann, G. (2021). Korrelaatio kvantitatiivisen anti-SARS-CoV-2 IgG ELISA:n ja neutralointiaktiivisuuden välillä. Journal of Medical Virology, 94(1), 388-392.
Javier T. Garza1*, Jacob Quick1*, Dev Chatterjee1*, Robert P. Garr1, Atul Varadhachary1, Leo Linbeck III1* 1Brevitest Technologies, Inc., Houston, TX. *Nämä kirjoittajat osallistuivat yhtä paljon
Vastaavat kirjoittajat:
Javier Garza: javierg@fannininnovation.com
Dev Chatterjee: dev@fannininnovation.com
Kilpailevat kiinnostuksen kohteet:
JTG, JQ, DC, AV ja LL ovat Brevitest Technologies, Inc:n työntekijöitä.
Tutkimustuki:
Brevitest-alustan kehittämistä tukivat National Institute on Drug Abuse (NIDA) ja National Institute on Minority Health and Health Disparities (NIMHD) National Institutes of Healthissa (NIH), apurahanumerot: 1 R43 DA{{2} }; 1 R43 MD013409-01A1; 1 R43 DA043325-01, 2 R44 DA043325-02, 5 R44 DA043325-03; 3 R43 DA041966-01S1, Vijay ja Marie Goradia Foundation ja Fannin Innovation Studio.
Tekijän panokset:
Kaikki kirjoittajat osallistuivat teoksen suunnitteluun, suunnitteluun tai toteutukseen. Kaikki kirjoittajat ovat arvioineet käsikirjoituksen kriittisesti ja hyväksyneet käsikirjoituksen lopullisesti.
For more information:1950477648nn@gmail.com
