Askorbiinihappo säätelee Abalone Haliotis Discus Hannai Inon immuniteettia, hapettumisen estoa ja apoptoosia, osa 1

Abstrakti: Tämä tutkimus suoritettiin askorbiinihapon (AA) osien tutkimiseksi immuunivasteessa, hapettumisen estossa ja apoptoosissa abalonissa (Haliotis discus hannai Ino). Abalonelle syötettiin seitsemän puolipuhdistettua ruokavaliota, joiden AA-tasot (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ja 5000 mg/kg) paino: 12,01 ± 0,001 g, kuoren alkupituus: 48,44 ± 0,069 mm) 100 päivän ajan. Ruokavalion AA ei vaikuttanut eloonjäämiseen, painonnousuun ja kuoren pituuden päivittäiseen lisäykseen. Ravinnon AA lisäsi merkittävästi abalonen kidusten, lihaksen ja ruoansulatusrauhasten AA-pitoisuutta. Immuniteetin kannalta ravinnon AA paransi merkittävästi hemosyyttien kokonaismäärää, hengityspursketta ja fagosyyttiaktiivisuutta hemolymfissä ja lysotsyymiaktiivisuutta soluttomassa hemolymfissä (CFH). Ruoansulatusrauhasessa TLR-MyD88-riippuvaiset ja TLR-MyD88-riippumattomat signaalireitit tukahdutettiin ravinnon AA-lisäyksellä. Ravinnon AA nosti merkittävästi -defensiini- ja arginaasi-I:n mRNA-tasoja ruoansulatusrauhasessa. Kiduksissa vain TLR-MyD{26}}riippuvainen signalointireitti vähensi ravinnon AA:ta abalonen tulehduksen vähentämiseksi. Ruokavalion AA säätelee merkittävästi myyttien tekoa 6 kiduksissa. Vibrio parahaemolyticus -infektion jälkeen TLR-signalointireitti ruoansulatusrauhasessa tukahdutettiin ravinnon AA:lla, mikä vähensi tulehdusta abalonissa. Mitä tulee hapettumisen estoon, superoksididismutaasin, glutationiperoksidaasin ja katalaasiaktiivisuudet sekä kokonaisantioksidanttikapasiteetti ja CFH:n alentunut glutationipitoisuus lisääntyivät kaikki merkittävästi. Ruokavalion AA alensi malondialdehydipitoisuutta merkittävästi. Antioksidanttikykyä parannettiin käynnistämällä Keap{31}}Nrf2-reitti abalonissa. Mitä tulee apoptoosiin, ravinnon AA voisi parantaa anti-apoptoosin kykyä JNK-Bcl-2/Bax-signalointikaskadin kautta abalonissa. Yhteenvetona voidaan todeta, että ravinnon AA osallistui immuniteetin, hapettumisen eston ja apoptoosin säätelyyn abalonissa.

Cistanchen glykosidi voi myös lisätä SOD:n aktiivisuutta sydämen ja maksan kudoksissa ja vähentää merkittävästi lipofussiinin ja MDA:n pitoisuutta kussakin kudoksessa, poistaen tehokkaasti erilaisia ​​reaktiivisia happiradikaaleja (OH-, H₂O₂ jne.) ja suojaamalla DNA-vaurioilta. OH-radikaalien toimesta. Cistanche-fenyylietanoidiglykosideilla on vahva vapaita radikaaleja poistava kyky, suurempi pelkistyskyky kuin C-vitamiini, ne parantavat SOD:n aktiivisuutta siittiösuspensiossa, vähentävät MDA-pitoisuutta ja niillä on tietty suojaava vaikutus siittiöiden kalvon toimintaan. Cistanche-polysakkaridit voivat lisätä SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuutta D-galaktoosin aiheuttamien kokeellisesti vanhenevien hiirten punasoluissa ja keuhkokudoksissa sekä vähentää MDA- ja kollageenipitoisuutta keuhkoissa ja plasmassa sekä lisätä elastiinipitoisuutta. hyvä huuhteluvaikutus DPPH:lle, pidentää hypoksian aikaa vanhenevilla hiirillä, parantaa SOD:n aktiivisuutta seerumissa ja viivyttää keuhkojen fysiologista rappeutumista kokeellisesti vanhenevilla hiirillä Solumorfologisen rappeutumisen yhteydessä kokeet ovat osoittaneet, että Cistanchella on hyvä antioksidanttikyky ja sillä on potentiaalia olla lääke ihon ikääntymisen sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Samaan aikaan Cistanchen ekinakosidilla on merkittävä kyky poistaa DPPH-vapaita radikaaleja ja kyky poistaa reaktiivisia happilajeja ja estää vapaiden radikaalien aiheuttamaa kollageenin hajoamista, ja sillä on myös hyvä korjaava vaikutus tymiinin vapaiden radikaalien anionien vaurioihin.

Napsauta Cistanche Tubulosaa

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

Avainsanat: abalone; askorbiinihappo; immuuni; hapettumisen esto; apoptoosi

1. Esittely

Askorbiinihapon (AA), joka tunnetaan myös nimellä C-vitamiini, tiedetään olevan välttämätön hivenravinne, joka toimii kofaktorina, joka liittyy useiden ihmisen entsyymien toimintaan ja edistää immuunivastetta ja hermoston kehitystä ihmisillä [1,2 ]. Koska AA:n kyky säilyä organismissa on rajallinen, säännöllinen ja riittävä saanti on välttämätöntä AA-puutoksen estämiseksi. AA:ta tarvitaan pieninä määrinä ulkoisista lähteistä useimpien nisäkkäiden keskimääräiseen kasvuun, fysiologisiin aktiviteetteihin, lisääntymiseen ja terveyteen [3–5]. Mitä tulee immuunitoimintoihin, AA edistää immuuniesteen eheyden ylläpitämistä ja haavan paranemista [1]. Se voi tehostaa fagosyyttien toimintaa, kuten parantaa niiden liikkuvuutta, kemotaksista, fagosytoosia ja mikrobien tappamista [6–9]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet AA:n erilaisista immuunivaikutuksista B-soluihin, T-soluihin ja NK-soluihin nisäkkäillä [10–12]. Samaan aikaan AA liittyy myös apoptoosiin. Se estää sydänlihaksen apoptoosia estämällä Baxia (BCL-2 liittyvä X-proteiini) ja lisää Bcl-2:n (apoptoosin säätelijä bcl-2) kykyä estää sytokromi-C:n vapautumista mitokondrioista sytoplasmaan ja sen jälkeen vähentää kaspaasia-3, joka käynnistää apoptoosin [13]. Luonnollisena antioksidanttina AA vähentää reaktiivisia happilajeja (ROS) ja reaktiivisia typpilajeja (RNS) antamalla niille elektroneja ja estämällä muiden yhdisteiden hapettumista [14–17]. AA voi myös mahdollistaa muiden antioksidanttimolekyylien, kuten glutationin (GSH), -karoteenin, uraatin ja -tokoferolin, regeneroitumisen vastaavista vapaista radikaaleistaan ​​[18,19].

Toisin kuin maaeläimillä, vesieläinten immuunivasteesta ja apoptoosista on suhteellisen vähän raportteja. Ruokavalion mukaan sopivat AA-määrät voivat optimoida vesieläinten kasvun, terveyden ja stressinkeston [20]. Useimmat vesieläinten AA-tutkimukset keskittyvät arvioimaan AA:n vähimmäisvaatimuksia maksimaaliselle kasvulle ja laatimaan edullisimman ruokavalion. AA-vaatimukset vaihtelevat lajin, koon, ruokavalion ja viljelyolosuhteiden mukaan. Suositeltu ravinnon AA:n määrä vaihtelee välillä 10-10,000 mg/kg [21]. Ruokavalion AA:n vähimmäistarve maksimikasvunopeuden (WG) tukemiseksi oli 53–186 mg/kg Niilitilapialla (Oreochromis niloticus), 1200 mg/kg Tyynenmeren tonnikalalla (Thunnus orientalis) ja 5000–1000 mg/kg kuruma-katkarapu (Marsupenaeus japonicas) [22–24]. Ruokavalion AA ei kuitenkaan vaikuttanut merkittävästi WG:hen tai spesifiseen kasvunopeuteen (SGR) joidenkin kalalajien, kuten siperian sammen (Acipenser baerii), punaahven (Pagrus major) ja japanilaisen ankeriaan (Anguilla japonica) osalta [25–27 ].

Ruokavalion AA-lisän on osoitettu tehostavan monien kalalajien immuunitoimintoja, kuten fagosytoosia ja lysotsyymiaktiivisuutta [28–30]. Patogeeneille (esim. bakteereille ja loisille) altistumisen lisääntyneen selviytymisen on raportoitu Niilin tilapiassa, aasialaisissa monissa (Clarias batrachus) ja tyynenmeren valkoisissa katkarapuissa (Litopenaeus vannamei) AA:n saannin jälkeen [31–34]. AA-puutos vähensi lysotsyymin (LZM) aktiivisuutta, komplementtikomponentin 3 (C3) ja C4-pitoisuutta heinäkarppissa (Ctenopharyngodon idella) [35]. Se voi myös alentaa antimikrobisten peptidien, kuten -defensiinin ja hepsidiinin, ja anti-inflammatoristen sytokiinien, mukaan lukien interleukiini (IL) 4/13A, IL-10 ja transformoivan kasvutekijän (TGF) 1/2, tasoja; samalla kun se lisää tulehdusta edistäviä sytokiinejä, mukaan lukien IL-1 ja tumatekijä κB (NF-κB) ruohokarpilla [35]. Lisäksi AA-puutos lisäsi apoptoottisen proteaasin aktivaatiotekijän -1, kaspaasin-3 ja kaspaasin-7–9 toiminnan pahentamiseksi ruohokarpin solujen apoptoosia [35,36].

Abalone on yksi tärkeimmistä kaupallisista lajeista Archaeogastropoda-nilviäisluokassa. Se on tärkeä mallieläin kotijalkaisten (nilviäisten) ekologisen ja kehitysbiologian tutkimuksessa [37,38]. Viljellyistä abalone-lajeista Tyynenmeren abaloni (H. discus hannai Ino) on suosituin viljelty laji Kiinassa. Mai raportoi, että AA:n ravintolisä 0 - 8000 mg/kg ei merkittävästi vaikuttanut nuorten abalonin SGR:ään tai eloonjäämisasteeseen (SR) [39]. Wu et ai. raportoi, että ravinnon AA vaikutti antioksidanttisiin vasteisiin liittyvien geenien ilmentymiseen abalonen ruuansulatusrauhasessa parantaakseen sen stressinkestoa [40]. Lisäksi tautien puhkeaminen voi aiheuttaa valtavia taloudellisia tappioita abaloniteollisuudelle [41,42]. Nilviäisillä ei ole adaptiivista immuniteettia ja ne luottavat synnynnäiseen immuniteettiin [43]. Tästä syystä tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia AA:n rooleja immuniteetin, antioksidantin ja apoptoosin säätelyssä abalone H. discus hannaissa ja antaa tieteellistä ohjausta abalonen ravinnon formuloinnin terveelliselle säätelylle.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Eettinen lausunto

Kaikki tässä tutkimuksessa suoritetut eläinten hoito- ja käsittelytoimenpiteet ovat Kiinan Ocean Universityn eläintenhoitokomitean hyväksymiä (hyväksyntänumero SPXY2020012).

2.2. Kokeellinen ruokavalio

Perusruokavalio (AA{{{{10}}}}) valmistettiin puhdistetuista ainesosista sisältämään noin 30 prosenttia ravinnon proteiinia ja 3,5 prosenttia ravinnon lipidejä (taulukko 1). Proteiinilähteinä käytettiin kaseiinia (vitamiinitonta) ja gelatiinia ja lipidilähteinä soijaöljyä ja menhaden-kalaöljyä (1:1), mikä saattaa riittää ylläpitämään H. discus hannain optimaalista kasvua [44–46 ]. Asteittain määritellyt AA-tasot (0, 50, 100, 200, 500, 1000 ja 5000 mg/kg) lisättiin perusruokavalioon seitsemän kokeellisen ruokavalion muodostamiseksi. AA lisättiin ruokavalioon L-askorbyyli-2-monofosfaatin muodossa. Nämä ruokavaliot nimettiin AA0, AA50, AA100, AA200, AA500, AA1000 ja AA5000, vastaavasti. Analysoidut AA-pitoisuudet ruokavaliossa olivat 0,00, 47,31, 78,25, 189,05, 451,73, 919,99 ja 4821,17 mg/kg, vastaavasti. Ruoan AA-pitoisuuden analysoinnissa käytettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografiamenetelmää [40]. Ruoan raakaproteiini, raakalipidi ja tuhka mitattiin Association of Analytical Chemists [47] standardimenetelmien mukaisesti.

2.3. Liuotustesti

Ravinnon AA:n huuhtoutuminen esitettiin retention tehokkuuden (RE) avulla. Kolmen rinnakkaisannoksen kokeelliset ruokavaliot upotettiin meriveteen lämpötilassa 23.0 ± 0,5 ◦C. Upotetut ruokavaliot otettiin ulos määrättynä aikana (1, 3, 6 ja 12 tuntia, vastaavasti) ja lyofilisoitiin AA-sisällön analysointia varten.

RE ( prosenttia )=(AA, joka säilyy ruokavaliossa upotuksen jälkeen)/(AA, joka sisältyy ruokavalioon ennen upottamista) × 100.

2.4. Ruokintakoe

Abalone-poikaset hankittiin kalastusyritykseltä Fuzhousta (Fujian, Kiina) ja niitä sopeutettiin laboratorio-olosuhteisiin kahdeksi viikoksi perusravinnolla kiertovesijärjestelmässä, jossa oli säiliöitä (10{{1{{21 }}}} × 50 × 40 cm). Tämän jälkeen samankokoiset abalonit (alkupaino: 12,01 ± 0,{16}}1 g, kuoren alkupituus: 48,44 ± 0,069 mm) jaettiin satunnaisesti 21 säiliöön (45 abalonia per säiliö). Jokaista kolmea tankkia pidettiin yhtenä käsittelynä. Kaikki säiliöt pidettiin hämärässä mustilla muoviverhoilla. Abaloneja ruokittiin käsin kerran päivässä klo 17:00. Ulosteet ja syömättömät ruokavaliot poistettiin joka aamu klo 8.00. 100-päiväruokintakokeen aikana veden lämpötila oli 23,0 ± 0,5 ◦C, suolapitoisuus 30–33 ‰, pH 7,4–7,9 ja liuennut happi oli suurempi tai yhtä suuri kuin 7,0 mg/l.

2.5. Vibrio Parahaemolyticus -haastetesti

Ruokintakokeen jälkeen viisitoista abalonia kustakin säiliöstä käytettiin altistuskokeeseen patogeenisen V. parahaemolyticuksen kanssa. Abalonit altistettiin 100 µl:lla V. parahaemolyticusta (1,2 × 106 pmy/ml) lihasinjektiolla in vivo. Ruoansulatusrauhanen kerättiin 0, 6, 12, 24, 48 ja 72 tunnin kohdalla, vastaavasti, ja säilytettiin -80 ◦C:ssa qPCR-analyysiä varten.

2.6. Näytekokoelma

Ruokintakokeen päätyttyä abaloneja paastottiin kolme päivää ennen kuin ne laskettiin ja punnittiin. Kaikki abalonit nukutettiin 5-prosenttisella etyylialkoholilla ennen näytteenottoa. Hemolymfi kerättiin neljästä abalonista kussakin säiliössä hemosyyttien kokonaismäärän (THC), hengityskatkoksen (RB) ja fagosyyttisen aktiivisuuden (PA) analysoimiseksi. Entsyymiaktiivisuuden analysoimiseksi soluttomassa hemolymfissä (CFH) hemolymfi kerättiin toisesta kymmenestä abalonista kussakin säiliössä ja sentrifugoitiin (3000 x g 4 °C:ssa) 10 minuuttia; CFH säilytettiin -80 ◦C:ssa käyttöön asti. Ruoansulatusrauhanen, kidukset, lihakset ja vaippa otettiin näytteitä kymmenestä hemolymfistä otetusta abalonesta tankkia kohti ja säilytettiin -80 ◦C:ssa käyttöön asti.

2.7. Askorbiinihappopitoisuus

AA-pitoisuus CFH:ssa, lihaksessa, vaipassa, kiduksissa ja ruuansulatusrauhasessa havaittiin käyttämällä rautapitoisuutta vähentävää askorbaattimäärityssarjaa (BioVision, Milpitas, CA, USA). CFH:ta voidaan käyttää suoraan AA-pitoisuuden mittaamiseen valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lihas-, vaippa-, kidus- ja ruoansulatusrauhasen 0,1 g:n näytteet homogenisoitiin 1 ml:ssa esijäähdytettyä tislattua vettä. AA-pitoisuus mitattiin absorbanssilla 593 nm:ssä.

2.8. Immuuniparametrit hemolymphissa

Hemolymfi sekoitettiin perusteellisesti käyttämällä yhtä suurella tilavuudella esijäähdytettyä antikoagulanttia (100 mmol/l EDTA Na2, 450 mmol/l NaCl, 10 mmol/l KCl, 10 mmol/l HEPES, pH 7,3, 850 mOs mol/kg) laimentaa hemolymfiä.

THC laskettiin käyttämällä hemosytometriä mikroskoopin alla (CX31, OLYMPUS, Tokio, Japani).

Nitrosinisen tetratsoliumin (NBT) vähentyminen hemosyyteissä, jota voidaan edustaa RB-aktiivisuudella, mitattiin Andersonin et al.:n menetelmien mukaisesti, joihinkin muutoksiin [48]. Lyhyesti sanottuna hemolymfi säädettiin arvoon 5 × 106 solua/ml käyttämällä antikoagulanttia ja sentrifugoitiin 3000 × g:llä 4 ◦C:ssa 10 minuuttia. Solusakka värjättiin 100 µl:lla 1 µg/ml PMA:ta (forbolimyristaattiasetaatti, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) liuotettuna DMSO:lla (dimetyylisulfoksidi, Solarbio, Peking, Kiina) ja inkuboitiin 37 ◦C:ssa 30 min. Inkuboinnin jälkeen soluihin lisättiin 100 µl 0,3-prosenttista NBT:tä Hank's Balanced Salt Solutionilla (Solarbio, Peking, Kiina) liuotettuna ja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia ennen sentrifugointia (560 x g 4 °C:ssa 10 minuuttia). . Supernatantti poistettiin varovasti ja reaktio lopetettiin käyttämällä 200 ui metanolia 10 minuutin ajan. Sen jälkeen kenno pestiin kolme kertaa 70-prosenttisella (v/v) metanolilla ennen ilmakuivausta. Formatsaanisininen kide liuotettiin käyttämällä 120 ui 2 M KOH:ta ja 140 ui DMSO:ta. Optinen tiheys (OD) luettiin spektrofotometrillä 630 nm:ssä KOH/DMSO nollakoetta vastaan.

Hemolymfin PA määritettiin noudattaen aiemmin kuvattuja menetelmiä, jotka ovat kuvanneet Xue et ai. [49]. Lyhyesti sanottuna 50 µl laimennettua hemolymfiä asetettiin lasilevylle ja inkuboitiin 25 °C:ssa 20 minuuttia kiinnittymisen edistämiseksi. Sitten 50 ui hiivaa (Saccharomyces cerevisiae), jossa oli 1 x 106 solua/ml, lisättiin hemosyyttien yksikerroksiseen kerrokseen ennen inkubaatiota (25 °C 30 minuuttia). Objektilasi pestiin varovasti kahdesti steriloidulla fosfaattipuskurisuolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin metanolilla 5 minuutin ajan. Tämän jälkeen objektilasia värjättiin Giemsa-liuoksella 20 minuutin ajan. Solut laskettiin öljyimmersiolinssin alla. Fagosyyttinopeus osoitti fagosyyttisen aktiivisuuden.

2.9. Biokemialliset parametrit CFH:ssa

Antioksidatiiviset entsyymiaktiivisuudet (kuten SOD, katalaasi (CAT) ja glutationiperoksidaasi (GPX)), kokonaisantioksidanttikapasiteetti (T-AOC) ja malondialdehydin (MDA) ja GSH:n pitoisuus CFH:ssa määritettiin käyttämällä kaupalliset määrityssarjat (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, luettelo: T-AOC, A015-2-1; SOD, A001-3-2; CAT, A007- 1-1; GSH, A006-2-1; GPX , A005-1-2; MDA, A003-1-2). T-AOC perustui vihreiden ABTS-radikaalien (2, 20 -atsino-bis (3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo)) syntymiseen ABTS:n hapettuessa. SOD, GSH ja GPX mitattiin absorbanssilla aallonpituudella 450 nm, 405 nm ja 421 nm, vastaavasti, käyttämällä ultraviolettispektrofotometriä (Ultrospec 2100 pro, Biochrom, Holliston, MA, USA). CAT ja MDA määritettiin käyttämällä ammoniummolybdaatti- ja TBA-menetelmiä (tiobarbituurihappo) [50,51].

LZM-aktiivisuus ja C3- ja C4-pitoisuus CFH:ssa mitattiin kaupallisilla määrityssarjoilla (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kiina. Luettelo: LZM, A050-1-1; C3, E032-1-1; C4 , E033-1-1). LZM mitattiin läpäisyllä 530 nm:ssä. C3 ja C4 määritettiin 340 nm:ssä.

2.10. RNA:n kokonaisuutto ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

Ruoansulatusrauhasen ja kiduksen kokonais-RNA uutettiin käyttämällä kudoksen kokonais-RNA:n eristyspakkausta (Vazyme, Nanjing, Kiina) ja TRIzol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Uutetun kokonais-RNA:n pitoisuus ja puhtaus määritettiin käyttämällä Nanodrop 2000 -laitetta (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Komplementaarinen DNA (cDNA) syntetisoitiin käyttämällä käänteistranskriptiopakkausta (PrimeScript® RT -reagenssipakkaus, jossa on gDNA Eraser, Takara, Japani).

Kaikki alukkeet suunniteltiin käyttäen Primer Premier 6:ta.{1}} (lisätaulukko S1) ja syntetisoi Sangon Biotech (Shanghai, Kiina). Amplifikaatioreaktio suoritettiin 25 µl:n kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 0,5 µl eteenpäin ja käänteisiä alukkeita, 12,5 µl 2 × SYBR Green Realtime Master Mixiä (Vazyme), 1 µl cDNA:ta ja 10,5 µl. steriloidusta ddH2O:sta. Kunkin geenin ilmentymisprofiilien määrittämiseen käytettiin seuraavia lämpösykliolosuhteita: 95 ◦C 30 s; 40 sykliä 95 ◦C 10 s ja 60 ◦C 30 s; seuraavilla inkubaatioilla 95 ◦C:ssa 15 sekuntia, 60 ◦C:ssa 1 minuutin ajan ja 95 ◦C:ssa 1 sekunnin ajan fluoresenssin havaitsemiseksi. Kohdegeenin ilmentymistasot normalisoitiin kahden stabiilimman vertailugeenin (-aktiini ja gapdh) yhdistelmän tasoille, jotka validoitiin käyttämällä geNormia ja NormFinderiä [52,53]. Suhteelliset geeniekspressiot laskettiin käyttämällä 2−∆∆CT-menetelmää [54].

2.11. Western Blot

Ruoansulatusrauhasen ja kidusten kokonaisproteiini uutettiin RIPA-menetelmällä (Solarbio) [55] proteaasin ja fosfataasin estäjien cocktaileilla (Roche, Basel, Sveitsi). Käsikirjan mukaan ruuansulatusrauhasen ja kiduksen ydinproteiini uutettiin käyttämällä Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit -sarjaa (Beyotime, Shanghai, Kiina). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä BCA Protein Quantification Kit -sarjaa (Vazyme, Nanjing, Kiina), ja kaikki proteiininäytteet laimennettiin vastaavaan konsentraatioon 1,5 ug/ul käyttämällä RIPA-reagenssia. Ruoansulatusrauhasesta ja kiduksista saadut proteiininäytteet erotettiin SDS-PAGE:lla ja siirrettiin sen jälkeen 0,45 µm PVDF-kalvolle. PVDF estettiin käyttämällä 5-prosenttista rasvatonta maitojauhetta (Beyotime, Shanghai, Kiina) valmisteltaessa TBST:tä huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Kalvo pestiin kolme kertaa TBST:llä ennen inkubointia käyttämällä primääristä vasta-ainetta yön yli 4 °C:ssa 60 rpm:llä. Tämän jälkeen inkuboitu kalvo pestiin kolme kertaa TBST:llä ja inkuboitiin käyttämällä vuohen anti-kanin piparjuuriperoksidaasilla konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Beyotime, Shanghai, Kiina) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. PVDF-kalvo visualisoitiin käyttämällä ECL-kemiluminesenssipakkausta (Vazyme, Nanjing, Kiina). GAPDH:ta (1:500, AB-P-R001, Goodhere Biotechnology, Hangzhou, Kiina) ja Lamin B:tä (1:500, WL01775, Wanleibio, Shenyang, Kiina) käytettiin vertailuproteiineina. Ensisijaiset kohdevasta-aineet olivat myelooinen erilaistumisen primaarinen vaste 88 (MyD88, 1:500, WL02494, Wanleibio, Shenyang, Kiina), c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK, 1:500, WL01295, Wanleibio, Shenyang, Kiina), kypsä -IL-1 (1:500, WL00891, Wanleibio, Shenyang, Kiina), NF-κB p65 (1:500, WL01980, Wanleibio, Shenyang, Kiina), kelchin kaltainen ECH:ta yhdistävä proteiini 1 (Keap1, 1) :1000, WL03285, Wanleibio, Shenyang, Kiina) ja pilkottu kaspaasi3 (1:500, WL02117, Wanleibio, Shenyang, Kiina). Western blotin kvantifiointi laskettiin käyttämällä ImageJ:tä (versio 1.53, Wayne Rasband ja avustajat, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA).

2.12. Laskelmat ja tilastollinen analyysi

Tilastollisiin analyyseihin käytettiin SPSS 24 -ohjelmistoa (IBM, Armonk, NY, USA). Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin Tukeyn usean alueen testin kanssa tilastollisten erojen havaitsemiseksi näiden ryhmien välillä merkitsevyystasolla 0,05. Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SE (standardivirhe).

SR, WGR (painonnousuaste) ja DISL (päivittäinen kuoren pituuden lisäys) laskettiin seuraavasti:

SR ( prosentti )=(eloonjääneiden abalon määrä / alkuperäisen abalon lukumäärä) × 100;

WGR ( prosenttia )=[(lopullinen paino (g) − alkupaino (g))/alkupaino (g)] × 100;

DISL (µm/päivä)=[kuoren lopullinen pituus (mm) − kuoren alkuperäinen pituus (mm)]/vrk × 1000.

3. Tulokset

3.1. Askorbiinihapon säilyttämistehokkuus ruokavaliossa

Meriveteen upotetun ruokavalion AA:n RE eri aikavälein on esitetty lisäkuvassa S1. Yleensä AA:n RE-arvo ruokavaliossa väheni meriveteen upotuksen keston myötä. Ruokintakokeen aikana ravintoa pidettiin merivedessä noin 12 tuntia. Siksi liuotuskoe kesti 12 tuntia merivedessä samoissa ruokintaolosuhteissa. Kolmen tunnin upotuksen jälkeen AA:n RE-arvo ruokavaliossa vaihteli 95,25 prosentista 97,43 prosenttiin. AA:n RE pidettiin yli 95 prosentissa 6 tunnin upotuksessa. 12 tunnin upotuksen jälkeen AA:n RE-arvo AA50:ssä, AA100:ssa, AA200:ssa, AA500:ssa, AA1000:ssa ja AA5000:ssa oli 89,78 prosenttia, 90,88 prosenttia, 89,38 prosenttia, 91,03 prosenttia, 87,4 prosenttia, 87,4.

3.2. Kasvukyky ja askorbiinihapon jakautuminen kudoksissa

The SR and growth performance of abalone-fed gradient levels of AA supplementation are shown in Table 2. The SR (%), WGR (%), and DISL (µm/day) were not significantly affected by dietary AA levels (p>0.05). SR vaihteli 80,74 prosentin ja 88,15 prosentin välillä, ja WGR ja DISL vaihtelivat 29,32 prosentista 31,52 prosenttiin ja 17,92 - 20,01 µm/vrk.

The AA distribution in tissues, including CFH, muscle, mantle, gill, and digestive gland, is shown in Figure 1. No significant differences in AA content in CFH and mantle of abalone after dietary AA were observed (p>0.05). AA-pitoisuus CFH:ssa ja vaipassa vaihteli välillä 2,89 ug/ml - 4,52 ug/ml ja 81,63 ug/g - 103,08 ug/g, vastaavasti. Lihasten, kidusten ja ruuansulatusrauhasten AA-pitoisuus lisääntyi merkittävästi (s<0.05) and reached their peak at the AA5000 group. The AA content in the muscle, gill, and digestive gland was 64.88–128.20 µg/g, 308.98–382.19 µg/g, and 130.08–206.09 µg/g, respectively.

3.3. Hemolymfin immuuniparametrit

Hemolymfin THC, RB ja PA on esitetty taulukossa 3. THC nousi merkittävästi ravinnon AA:n lisääntyessä, vaihteluvälillä 1,07 × 107–1,65 × 107 solua/ml, ja saavutti huippunsa AA1000-ryhmässä.

Abalonen hemosyyttien RB lisääntyi merkittävästi ja saavutti korkeimman tasonsa AA10{{10}}{{20}}-ryhmässä (0 .35 OD630/107 solua · ml-1). Kun ravinnon AA:n lisäys nousi arvosta 189,05 mg/kg arvoon 919,99 mg/kg, RB kasvoi merkittävästi arvosta 0,20 OD630/107 solua·mL-1 arvoon 0,35 OD630/107 solua·mL-1 (p < 0,05). Ruokavalion AA voi vaikuttaa abalonen hemosyyttien PA-arvoon (p < 0,05). Abalonen PA AA1000- ja AA5000-ryhmissä oli merkittävästi korkeampi kuin AA0-, AA50- ja AA100-ryhmissä ja saavutti maksiminsa (48,92 prosenttia) AA5000-ryhmässä.

Abalonen CFH:n immuunijärjestelmään liittyvät parametrit, mukaan lukien LZM-, C3- ja C4-pitoisuus, on esitetty taulukossa 4. LZM-aktiivisuus oli merkittävästi kohonnut (p < 0.{{10} }5) ja saavutti korkeimman tason AA1000-ryhmässä, jossa sen aktiivisuus oli 56,25 U/ml. Tiedot eivät paljastaneet merkittäviä vaikutuksia C3-pitoisuuteen kaikkien hoitojen välillä (p > 0,05); C3-pitoisuus kuitenkin pysyi nousussa ravinnon AA:n täydennyksen myötä. Ruokavalion AA ei vaikuttanut merkittävästi C4-pitoisuuteen (p > 0,05).

3.4. Hapettumisenestoparametrit CFH:ssa

SOD:ta, CAT:ta ja GPX:tä sisältävän abalonin CFH:n antioksidatiiviset entsyymiaktiivisuudet sekä T-AOC-kapasiteetti ja MDA:n ja GSH:n pitoisuus on esitetty taulukossa 5. Ruokavalion AA vaikutti merkittävästi SOD:n, CAT:n, ja GPX sekä T-AOC ja GSH:n ja MDA:n sisältö. SOD:n, CAT:n ja GPX:n aktiivisuudet sekä T-AOC- ja GSH-pitoisuudet olivat merkittävästi ylössäänneltyjä (p < 0.05), kun taas MDA-pitoisuus oli abalonissa merkittävästi alentunut (p < 0,05). ). Näissä antioksidanttiparametreissa ei havaittu merkittäviä eroja abalonen CFH:ssa AA1000- ja AA5000-ryhmien välillä.

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】