Lämpökäsitellyn lakritsiuutteen (Wongam, Glycyrrhiza Glabra × G. Uralensis) antioksidantti- ja melanogeeniset vaikutukset
Mar 26, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
Min Hye Kang 1,2, Gwi Yeong Jang 1, Yun-Jeong Ji 1, Jeong Hoon Lee 1, Su Ji Choi 1, Tae Kyung Hyun 2,* jaHyung Don Kim 1,*
Abstrakti:Melaniini on ruskea tai musta pigmentti, joka suojaa ihoa ultraviolettisäteilyltä ja reaktiivisilta happilajeilta (ROS). Melaniinin ylituotanto liittyy kuitenkin lentigiiniin, melasmaan, pisamioihin ja ihosyöpään.Lakritsion osoittanutantioksidantti, kasvaimia, verihiutaleita, tulehdusta ja immunomoduloivia vaikutuksia, ja sitä käytetään luonnollisena ihonhoitonavalkaisuPyrimme vahvistamaan Wongamin, RuralDevelopment Administrationin (RDA) kehittämän uuden lakritsilajikkeen potentiaalin.valkaisuagentti kosmetiikassa. Lisäksi vahvistimme vertailulla lämpökäsittelyn vaikutuksen lakritsin bioaktiivisuuteenantioksidanttijaanti-melanogeeninenlakritsiuutteen aktiivisuus ennen ja jälkeen kuumentamisen (130 ◦C). Lämpökäsitelty lakritsiuute (WH-130) osoitti voimakkaampia radikaaleja poistavia aktiivisuuksia ABTS plus:ssa (2,20-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) happo) diammoniumsuola) ja DPPH (2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli) määritykset. Lisäksi WH-130 esti melanogeneesiä tehokkaammin B16F10-melanoomasolujen tyrosinaasin heikentymisen vuoksi kuin lämmittämättömät.lakritsiottaa talteen. Lisäksi lämpökäsittely lisäsi kokonaisfenolipitoisuutta. Erityisesti isoliquiritigenin, anantioksidanttijaanti-melanogeeninenlakritsiyhdiste, tuotettiin lämpökäsittelyllä. Yhteenvetona voidaan todeta, että WH{0}}, jossa on lisääntynyt bioaktiivisten fenolien, kuten isoliquiritigeniinin taso, voi kehittyä uudeksi ihoksivalkaisumateriaalia, jota käytetään kosmetiikassa.
Avainsanat: anti-melanogeeninentoiminta; lämpökäsittely;lakritsi; hiiren melanoomasolut (B16F10)
1. Esittely
Lakritsi(Glycyrrhiza-lajit), monivuotinen yrtti, jota käytetään lääketieteellisesti Leguminosae-heimoon, ja se on laajalti levinnyt Keski-Aasiassa, Kiinassa, Venäjällä, Mantsuriassa, Mongoliassa ja Euroopassa [1]. Sitä on käytetty pitkään maku- ja makeutusaineena. Lakritsin kuivattua juuria ja stolonia on käytetty lakritsin biologisista vaikutuksista johtuvien vilustumisen, yskän, astman, väsymyksen ja hengitystieinfektioiden hoitoon.antioksidantti,antimikrobinen, kasvainten vastainen, verihiutaleiden vastainen, anti-inflammatorinen ja immunomodulatorinen vaikutus [2,3]. Glycyrrhiza-sukuun kuuluu noin 22 lakritsilajia, mukaan lukien G. uralensisFisch, G. glabra L. ja G. inflata Batal.
RuralDevelopment Administration on kehittänyt Wongamin, uuden interspesifisen lakritsilajikkeen hybridilajikkeen Glycyrrhiza glabra x G. uralensis (G. korshinskiGrig). Wongamilla on korkeampi sato ja parempi taudinkestävyys kuin G. uralensis. G. uralensiksen biologisista vaikutuksista on tehty lukuisia tutkimuksia, kun taas nykyinen tutkimus Wongamista, uudesta lajikkeesta, rajoittuu sen allergiaa ehkäiseviin, immunomoduloiviin ja haavaumia ehkäiseviin vaikutuksiin [1,2]. Siksi on tarpeen tutkia Wongamin laajaa bioaktiivisuutta.
Tärkeimmät bioaktiiviset komponentitlakritsijuuret ovat flavonoideja ja triterpeenisaponiineja, mukaan lukien liquiritiin, liquiritigenin, isoliquiritigenin (ISL) ja glysyrritsiini (tai glysyrritsihappo) [4,5]. ISL on lakritsista löytyvä flavonoidi, jolla on erilaisia farmaseuttisia vaikutuksia, mukaan lukien verihiutaleita, allergiaa, kasvaimia, tulehdusta ja tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia.antioksidanttitoimintaa [6–8]. ISL on hydrolyysituote lakritsinjuuressa olevasta isoliquiritiinista. Se voi estää melanogeneesiä hajottamalla mikroftalmiaan liittyvää transkriptiotekijää (MITF) aktivoimalla solunulkoisen signaalin säätelemän proteiinikinaasin (ERK) signaalireitin. Tämän seurauksena MITF:n hajoaminen suppressoi tyrosinaasi(TYR)- ja tyrosinaaseihin liittyvien proteiinien (TRP-1 ja TRP-2) geenien ilmentymistä SK-MEL-2-soluissa [9,10].ISL voi estää sienten TYR:n mono- ja difenolaasiaktiivisuutta sekä melanosyyttien melanogeneesiä [11].
Melaniini, tärkein ihon väriä välittävä pigmentti, syntetisoituu epidermaalisissa melanosyyteissä ja varastoituu solunsisäisiin organelleihin, joita kutsutaan melanosomeiksi [12]. Melaniinipigmentit koostuvat kahdesta tyypistä: ruskea tai musta eumelaniini ja punainen tai keltainen pheomelaniini [12]. Melanogeneesiä voivat aiheuttaa ulkoiset ärsykkeet, mukaan lukien ultravioletti (UV) säteily, reaktiiviset happilajit (ROS) ja kemikaalit, kuten melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH) ja isobutyylimetyyliksantiini (IBMX), jotka nostavat syklisen adenosiinimonofosfaatin (cAMP) tasoja. Melaniini suojaa ihoa näiltä ärsykkeiltä, kun taas sen liikatuotanto aiheuttaa ihon hyperpigmentaatiota, joka voi johtaa sairauksiin, kuten ihosyöpään [13–17]. Ihovalkaisuaineita, kuten kojiinihappoa, hydrokinonia, arbutiinia ja askorbiinihappoa, jotka ovat TYR-estäjiä, on käytetty hyperpigmentaation hoitoon useissa kosmeettisissa valmisteissa [13,18]. Melanogeneesiä säädellään useiden signalointireittien kautta, ja nämä signaalit liittyvät MITF:n lisääntymiseen. MITF:n aktivointi edistää TYR:n ja TRP:iden (TRP-1, TRP-2) ilmentymistä. Sitten TYR katalysoi L-tyrosiinin hapettumista 3,4-dihydroksi-L-fenyylialaniiniksi (L-DOPA), joka hapetetaan myöhemmin DOPAkinoniksi. TRP-2 muuntaa dopakromin 5,6-dihydroksi-indoli-2-karboksyylihapoksi (DHICA) tai 5,6-dihydroksi-indoliksi (DHI). Lopuksi TRP-1 hapettaa DHICA:n ja DHI:n, mikä johtaa inmelanogeneesiin [19].
Lämpöprosessit vaikuttavat kasviuutteiden fysikaalis-kemiallisiin ja biologisiin ominaisuuksiin. Ne tuhoavat soluseiniä ja katkaisevat kovalenttisia sidoksia, mikä johtaa bioaktiivisten yhdisteiden vapautumiseen [20,21]. Panimoiden käytettyjen viljauutteiden lämpökäsittely yli 130 ◦ Nostaa kokonaisfenolipitoisuutta (TPC) ja kokonaisflavonoidipitoisuutta (TFC) ja lisää vastaavasti antioksidanttiaktiivisuutta [16,20,21]. Sitrushedelmien kuorien kuumennus voi johtaa fenoliyhdisteiden vapautumiseen ja lisääntymiseenantioksidanttitoimintaa [17].
Päätavoitteemme on vahvistaa Wongamin potentiaali luonnollisena ihonavalkaisumateriaali kosmetiikassa. Lisäksi tämän tutkimuksen tarkoituksena on myös osoittaa, voiko lämpökäsittely parantaa hapettumisenesto- ja melanogeenisia vaikutuksia.lakritsi. Me tutkimmeantioksidanttiyhdessä Wongam-otteiden TPC:n kanssa.Anti-melanogeeninenWongam-uutteiden vaikutukset varmistettiin TYR:n estoaktiivisuudella ja melaniinipitoisuudella inmelanoomasoluilla.
Cistanche on luonnollinenihovalkaisu yrtti
2. Materiaalit ja metodit
2.1. Näytteen valmistus
Näytteet valmistettiin aiemmin raportoidulla menetelmällä [22].Lakritsi(Wongam, Glycyrrhiza glabra x G. uralensis, jonka on tunnistanut Yun Ji Lee NIHHS:stä, RDA ja rekisteröity Korean lääkeresurssien herbaarioon tositenumerolla MPS006326) viljeltiin ja korjattiin yrttikasvien tutkimuksen osastolla (Eumsung,Chung-Korean ) vuonna 2018 ja kuivattiin 60 ◦C:ssa 20 tuntia. 10 kglakritsikorjattiin ja 1 kg jauhettiin. Niiden sekoittamisen jälkeen saatiin 3 näytettä WC:stä tai WH:sta, vastaavasti. Jauhettu lakritsi (5 g) laitettiin lasiastiaan, jossa oli 1 ml tislattua vettä, ja käsiteltiin autoklaavissa (Jisico, Soul, Korea) 1 tunnin ajan 130 ◦C:ssa (WH-130). Käsittelemätön kontrollilakritsi (WC) 5 g) ja WH-130 uutettiin erikseen käyttämällä 70-prosenttista etanolia (näyte: liuotin, 1:50, tilavuus:tilavuus) 24 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT). Suodatuksen jälkeen uutteet haihdutettiin tyhjössä, pakastekuivattiin ja säilytettiin -80 °C:ssa. Kaikki uutteet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) (Sigma, St. Louis, MO, USA) ja metanoliin (Sigma, St. Louis, MO, USA).
2.2. Browningin määrittäminen
Rusketusindeksilakritsiuutteet (WC ja WH-130) kirjattiin perustuen niiden absorbanssiarvoon 420 nm:ssä (A420) mitattuna mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, VT, USA). Suuremmat absorbanssiarvot aallonpituudella 420 nm vastaavat korkeampaa ruskeutumisindeksiä [23,24].
2.3. Kokonaisfenolipitoisuus (TPC)
Aikaisemmin raportoidulla menetelmällä [25] TPC mitattiin perustuen periaatteeseen, että Folin-Ciocalteun reagenssi pelkistyy siniseksi kromoforiksi, joka koostuu fosfovolframi-fosfomolybdeenikompleksista emäksisistä olosuhteista ja fenoliyhdisteiden pitoisuudesta riippuen. Kukin näyte (10 µl) sekoitettiin 2-prosenttiseen natriumkarbonaattiin (200 µl) ja sitten Folin-Ciocalteun reagenssiin (10 µl). Seosta aktivoitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Sitten absorbanssi mitattiin 750 nm:ssä käyttämällä mikrolevylukijaa (BioTek, Winooski, VT, USA). TPC laskettiin gallushapon standardikäyrästä ja tulokset ilmaistiin gallushapon ekvivalenttiarvoina, mg GAE g-1 uutetta.
2.4. Antioksidanttikapasiteetin määritys
Radikaalia poistava aktiivisuus mitattiin käyttämällä 2,20-atsino-bis-(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo) diammoniumsuolaa (ABTS) aiemmin kuvatun menetelmän mukaisesti, jossa on hieman modifikaatioita [19, 26]. ABTS-radikaalikationiliuos valmistettiin sekoittamalla 2,6 mM kaliumpersulfaattia ja 7,4 mM ABTS:ää ja antamalla niiden reagoida 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten ABTS-liuos laimennettiin tislatulla vedellä absorbanssin säätämiseksi alueelle 1.{15}}–1,500. Seuraavaksi 20 ui näytettä saatettiin reagoimaan 180 ul:n ABTS plus -liuosta, joka oli suojattu valolta, ja näytteen ja liuoksen seosta inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Absorbanssi mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa (BioTek, Winooski, VT, USA) 735 nm:ssä. Trolox-standardikäyrästä, Trolox-vastineantioksidanttikapasiteetti (TEAC) laskettiin ja ilmaistiin milligrammoina trolox-ekvivalenttia (TE) grammaa kuivaa näytettä kohti.
2,2-difenyyli-1-pikryylihydratsyyli (DPPH) -radikaaliliuos valmistettiin liuottamalla 0,2 mM DPPH:ta 99-prosenttiseen etanoliin. DPPH-liuos laimennettiin tislatulla vedellä absorbanssiin 520 nm:ssä 1000-1500. Sitten 50 ui näytettä sekoitettiin 200 ul:aan DPPH-liuosta ja annettiin reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Reaktion jälkeen seoksen absorbanssi määritettiin 520 nm:ssä. Trolox-standardikäyrästä TEAC laskettiin ja ilmaistiin mg:na TE:ta per g kuivaa näytettä.
2.5. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC) -analyysi
Käytettiin modifioitua HPLC-menetelmää [22]. Kohteen ISL-sisältölakritsiuutteet analysoitiin HPLC:llä UV-näkyvällä detektorilla (HPLC: 1200-sarja, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA; kolonni: SynergiTM, 250 × 4,6 mm, 4 µm, Fusion-RP 8{{40}} Å, Phenomenex, Torrance, CA, USA). Liikkuva faasi koostui liuottimesta A (0,1 % muurahaishappoa vedessä) ja liuottimesta B (0,1 % muurahaishappoa asetonitriilissä). Liikkuvan vaiheen gradienttiohjelmaa ajettiin seuraavan gradientin alla: 0–8 min (20–20 prosenttia B), 8–30 min (20–38 prosenttia B), 30–42 min (38–50 prosenttia) B), 42–47 min (50–90 prosenttia B), 47–53 min (90–90 prosenttia B), 53–54 min (90–20 prosenttia B) ja 54–60 min (20–20 prosenttia B) . Virtausnopeus, detektioaallonpituus ja injektiotilavuus asetettiin arvoon 1,0 ml/min, 360 nm ja 10 ui, vastaavasti. ISL-standardiliuokset analysoitiin neljällä eri pitoisuudella (0,05, 0,1, 0,2, 0,4 mg/ml). Kalibrointikäyrää (y=ax plus b) käytettiin ISL:n sisällön määrittämiseen. Regressioyhtälössä x viittaa ISL:n pitoisuuteen (mg ml-1) ja y tarkoittaa piikin pinta-alaa.
2.6. Sienityrosinaasia inhiboivan aktiivisuuden määritys
TYR-inhibiittoriaktiivisuuden määritys suoritettiin käyttämällä TYR-inhibiittoriseulontapakkausta (BioVision, Milpitas, CA, USA). Jokainen uute (WC ja WH-130) liuotettiin DMSO:hon lopulliseen pitoisuuteen 250 µg/ml. Kojihappo, jota käytettiin positiivisena kontrollina, laimennettiin myös 250 ug/ml:aan DMSO:ssa. Lyhyesti sanottuna 20 µl uutetta tai kojiinihappoa yhdistettiin 50 µl:aan TYR-entsyymiliuosta. 10 minuutin huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 30 ui TYR-substraattiliuosta. Uutteiden ja kojiinihapon lopullinen konsentraatio oli 50 ug/ml. Kuoppien optinen tiheys mitattiin sitten 510 nm:ssä kineettisessä tilassa 1 tunnin ajan mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, VT, USA).
cistanche-jauhe: antioksidantti
2.7. Soluviljely
Hiiren melanooma B16F10 -solut saatiin American Type Culture Collectionista (ATCC, Manassas, VA, USA). B16F10-soluja viljeltiin Dulbeccon modifiedEagle-elatusaineessa (DMEM), jota oli täydennetty 10 prosentilla naudan sikiön seerumilla (FBS), 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 µg/ml streptomysiiniä (Gibco, Grand Island, NY, USA), joka sisälsi 5 5 kosteaa ilmakehää. CO2-prosenttia 37 ◦C:ssa.
2.8. Solujen elinkelpoisuusmääritys
SytotoksisuuslakritsiB16F10-solujen uutteet (WC ja WH-130) määritettiin käyttämällä MTT:tä [3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,{{8 }}difenyylitetratsoliumbromidi] -määritys. B16F10-soluja viljeltiin 4 × 103 solua/kuoppa 96-kuoppalevyllä 24 tuntia. Sen jälkeen soluihin lisättiin uutteita pitoisuuksina 50, 100 ja 200 ug/ml ja inkuboitiin 37 °C:ssa 48 tuntia. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin MTT-liuosta (500 ug/ml) ja levyä inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa. Jokaisessa kuopassa oleva väliaine heitettiin pois ja lisättiin 100 ui DMSO:ta. 30 minuutin ravistelun jälkeen absorbanssi mitattiin 540 nm:ssä mikrolevylukijalla. Kaikki testit suoritettiin kolmena kappaleena.
2.9. Solujen melaniinipitoisuuden mittaaminen
Solunsisäinen melaniinipitoisuus mitattiin käyttämällä hieman modifioitua versiota aiemmin kuvatusta menetelmästä [27]. B16F10-melanoomasoluja kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 8 × 104 solua/kuoppa ja inkuboitiin 24 tuntia. Solut altistettiin uutteille (WC ja WH-130, 100 µg/ml), kojiinihapolle (100 µg/ml) tai ISL:lle (10 µM, Millipore Sigma, Burlington, MA, Yhdysvallat) 48 tunnin ajan 100 µM 3-isobutyyli-1-metyyliksantiinia (IBMX). Käsittelyn jälkeen solut pestiin Dulbeccon fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (DPBS) ja liuotettiin 200 ul:aan 1 N NaOH:ta 2 tunnin ajan 90 °C:ssa. Absorbanssi aallonpituudella 405 nm mitattiin käyttämällä mikrolevylukijaa.
2.10. Solujen tyrosinaasin aktiivisuusmääritys
Solunsisäinen TYR-aktiivisuus mitattiin käyttämällä hieman modifioitua versiota aiemmin kuvatusta menetelmästä [27]. B16F10-melanoomasoluja (8 x 104 solua/kuoppa) käsiteltiin uutteilla (100 ug/ml) tai kojiinihapolla (100 ug/ml) 100 uM IBMX:n läsnä ollessa 48 tunnin ajan, kerättiin ja pestiin DPBS:llä. Proteiininäytteet hajotettiin 1-prosenttisessa TrionX{10}}:ssa (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) natriumfosfaattipuskurilla (pH 6,8) ja sentrifugoitiin sitten 15, 000 rpm 10 minuuttia. Supernatanttifraktio kerättiin ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttämällä bikinkoniinihappo (BCA) -määrityssarjaa (Waltham, MA, USA). Reaktioseos, joka koostui 30 µg:sta proteiinia (säädetty 100 µl:aan 1 prosentin Trion X:llä-100) ja 100 µl:sta 10 mM L-DOPA:ta, lisättiin kuhunkin 96-kuoppalevyn kuoppaan. 37 °C:ssa 1 tunnin inkuboinnin jälkeen dopakromia tarkkailtiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 490 nm käyttäen mikrolevylukijaa. TYR-aktiivisuus laskettiin seuraavalla kaavalla:
Tyrosinaasiaktiivisuus (prosenttia)=(näytteen OD405/kontrollin OD405) × 100
2.11. Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR)
Melanogeneesiin liittyvien geenien, mukaan lukien MITF, TYR, TRP-1 ja TRP-2, mRNA:n ilmentymistasot määritettiin käyttämällä modifioitua RT-PCR-määritystä [28]. Lyhyesti sanottuna B16F10-soluja kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 8 × 104 solua per kuoppa ja viljeltiin 24 tuntia. Sitten soluja käsiteltiin uutteilla (100 ug/ml), kojiinihapolla (100 ug/ml) tai ISL:llä (10 uM) 48 tunnin ajan. Kokonais-RNA eristettiin soluista käyttämällä TRIzol-reagenssia (Ambion, Austin, TX, USA) ja sitten RNA:n konsentraatio määritettiin käyttämällä mikrolevyn lukulaitetta. Kun cDNA (2 µg) oli valmistettu Reverse Transcriptase Premix Kit -sarjalla (ElpisBiotech, Daejeon, Korea) valmistajan ohjeiden mukaisesti, suoritettiin reaaliaikainen PCR käyttämällä MITF:ää, TYR:ää, TRP:tä-1, TRP:tä-2 ja -aktiinialukkeet (taulukko 1, Bioneer, Daejeon, Korea) SYBR Green -pakkauksella (ProGEN, Heidelberg, Saksa) CFX96 Real Time PCR-instrumentissa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Kaikki tiedot normalisoitiin -actinmRNA:n tasoille referenssitalousgeeninä.
2.12. Solulysaattien valmistus ja Western blot -analyysi
B16F10-solut kylvettiin 6-kuoppalevyille tiheydellä 8 × 104 solua per kuoppa, inkuboitiin 24 tuntia ja sitten altistettiin uutteille (100 µg/ml), kojiinihapolle (100 µg/ml) ) tai ISL (10 uM) 48 tunnin ajan. DPBS:llä pesun jälkeen solut kerättiin ja hajotettiin Triton X{10}}-puskurissa (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA), joka sisälsi 1 % proteaasia ja fosfataasi-inhibiittoriseosta. Kokosolulysaattien proteiinipitoisuudet mitattiin käyttämällä aBCA-määrityspakkausta (Waltham, MA, USA). Samat määrät proteiinia (20 ug) ladattiin 10-prosenttisille natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeeleille, joita ajettiin 4 tuntia 70 V:ssa. Sitten proteiinit siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF) -kalvolle. Kalvo pestiin kolme kertaa Tris-puskuroidulla suolaliuoksella [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl], joka sisälsi 0,1 prosenttia Tween 20:tä (TBST) ja blokattiin 2 prosentilla naudan seerumialbumiinilla (GenDEPOT) 1 tunnin ajan. Seuraavaksi kalvoja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa primääristen vasta-aineiden kanssa (laimennus 1:1000) 4 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. MITF, TYR, TRP-1, TPR-2 ja -aktiini havaittiin kanin polyklonaalisella anti-MITF-vasta-aineella (Abcam, Cambridge, UK); vuohen polyklonaalinen anti-TYR-vasta-aine (Santa Cruz, Dallas, TX, USA); ja hiiren monoklonaaliset antiTRP-1-, anti-TRP-2- ja anti- --aktiinivasta-aineet (Santa Cruz, Dallas, TX, USA). Sen jälkeen kalvot pestiin useita kertoja TBST:llä. ja inkuboitiin toissijaisten vasta-aineiden (laimennos 1:2000) kanssa 1 tunnin ajan, nimittäin kanin anti-hiiri-IgG:n, hiiren anti-vuohen IgG:n ja vuohen anti-hiiri-IgG:n kanssa (Santa Cruz, Dallas, TX, USA), mitä seurasi useita pesuja TBST:llä. Kohdeproteiinit havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssireagenssia (ECL) (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ChemiDoc Imaging Systemillä (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Proteiinikaistan kvantifiointi suoritettiin käyttämällä ImageJ-ohjelmistoa (versio 1.52a Windowsille; NIH, Rockville, MD, USA) [28].
2.13. Tilastollinen analyysi Tiedot analysoitiin käyttämällä Microsoft Excel 2016:ta ja kaikki kokeelliset tulokset esitetään kolmen riippumattoman mittauksen keskiarvona ± keskihajonta (SD). Opiskelijan kahden näytteen t-testiä käytettiin arvioimaan vertailun ja näytteiden välisiä eroja. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja Duncan-testi suoritettiin Rsoftwarella (versio 3.6.3) kunkin vertailun merkityksen määrittämiseksi klo. tasot p < 0.05="" (*),="" p="">< 0,01="" (**)="" ja="" p="">< 0,001="" (***).="" korrelaatioanalyysi="" suoritettiin="" käyttämällä="" prism5.02:ta="" (graphpad="" software,="" san="" diego,="" ca,="">
3. Tulokset
3.1. Lakritsiuutteiden ruskistumisindeksi
Ruskistusastelakritsiotteet on esitetty kuvassa 1a. Nämä tulokset vahvistivat, että lämpökäsitellyllä uutteella (WH-130, 0.965 ± 0.025 AU [absorbanssiyksikköä]) oli paljon korkeammat ruskistumisindeksiarvot kuin kuumentamattomalla. ote (WC, 0,758 ± 0,005 AU). Odotamme, että lämpökäsittely lisää melanoidiinin muodostumista WH:ssa-130 ja että tämä muutos voi olla yhteydessä erilaisiin biologisiin toimintoihin.
3.2. Lakritsiuutteiden fenolipitoisuus (TPC).
Kuva 1b esittää TPC:nlakritsiotteita. Löysimme eron TPC:ssä WC:n ja WH{{0}} välillä, koska WC:n TPC oli 12.093 ± 0,061 mg GAE/g uutetta, kun taas WH-130 oli TPC 14,098 ± 0,781 mg GAE/g uutetta. Lämpökäsittely nosti lakritsiuutteiden TPC:tä.
3.3. Lakritsiuutteiden radikaaleja poistava vaikutus
Theantioksidanttitoimintalakritsiotteet on esitetty kuvassa 1c,d. ABTS plus -radikaalienpoistokyky oli suurempi WH-130-uutteella (6.086 ± 0.304 mg TEAC/geuote) kuin WC-uutteella (3,542). ± 0,093 mg TEAC/g uutetta). DPPH-määrityksessä havaittiin samanlainen taipumus. WH-130 (7,442 ± 0,292 mg TEAC/g-uutetta) -uute osoitti suurempaa DPPH-radikaaleja poistavaa aktiivisuutta kuin WC-uute (4,033 ± 0,160 mg TEAC/g-uutetta). Nämä tulokset osoittavat, että kuumennus voi lisätä uutteiden antioksidanttiaktiivisuutta.
3.4. Lakritsiuutteiden isoliquiritigenin-pitoisuus
Tulokset osoittivat, että WC:n ISL-pitoisuus nousi merkittävästi lämpökäsittelyn jälkeen (taulukko 2, kuva 2), mikä viittaa siihen, että lämpökäsittely voi vaikuttaa tämän sisältöön.antioksidanttijaanti-melanogeeninenyhdiste.
cistanche tubolosa
3.5. Solujen elinkelpoisuus
Kuten kuvasta 3 näkyy,lakritsiuutteet eivät vaikuttaneet solujen elinkelpoisuuteen pitoisuuksilla 50 tai 100 ug/ml suhteessa IBMX-käsiteltyyn kontrolliin. Kaikkien uutteiden 50 ja 100 µg/ml käsittelyissä solujen elinkelpoisuus pysyi yli 100 prosentissa. Siksi suoritettiin lisäkokeita käyttämällä lakritsiuutteen pitoisuuksia aina 100 ug/ml asti.
3.6. Lakritsiuutteiden vaikutukset melaniinin tuotantoon B16F10-melanoomasoluissa
B16F10-solujen pigmentaatio ja melaniinipitoisuus on esitetty kuvassa 4a,b. B16F10-solujen melaniinipitoisuus nousi jopa 34--kertaiseksi IBMX-käsittelyllä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin. WC ja WH-130 osoittivat merkitsevästi vähentynyttä pigmentaatiota ja melaniinipitoisuutta IBMX-käsiteltyyn ryhmään verrattuna (kuva 4a,b). Sekä WC että WH{{10}} osoittivat alhaisempaa melaniinipitoisuutta kuin KA-käsitellyt solut. Melaniinin synteesin estovaikutus WH-130:lla käsitellyissä B16F10-soluissa oli suurempi kuin WC. Melaniinin määrä 100 µg/ml WC- ja WH{16}}-käsittelyn jälkeen pieneni noin 059--kertaiseksi ja 051--kertaiseksi IBMX-käsitellyn tasoon verrattuna. group.ISL (10 µM) ja KA (100 µg/ml) tukahduttivat melaniinin tuotannon 059--kertaiseksi ja 067--kertaiseksi IBMX-käsiteltyjen solujen tasosta riippuen.
Tämä tulos osoittaa, että lämpökäsiteltylakritsiuute (WH-130) voi estää melaniinin tuotantoa tehokkaammin kuin kuumentamaton uute (WC). Lisäksi havaitsimme, että käsittely WH-130-uutteella pitoisuuksilla 25, 50 ja 100 µg/ml (kuva 4c) johti pitoisuudesta riippuvaiseen B16F10-melanoomasolujen melaniinipitoisuuden laskuun. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lämmitys paransianti-melanogeeninenlakritsiuutteen aktiivisuus.
3.7. Lakritsiuutteiden vaikutukset tyrosinaasiaktiivisuuteen
3.7.1. Sienityrosinaasiaktiivisuus
VaikutuslakritsiSienen TYR-aktiivisuuden uutteet on esitetty kuvassa 5a. Vahvistimme, että uutteiden (WC ja WH-130) vaikutus substraattien hapettumiseen sieni-TYR:n vaikutuksesta tapahtui soluttomissa olosuhteissa. Konsentraatiolla 50 µg/ml WC-uute esti entsyymiaktiivisuutta 81,33 prosenttiin, kun taas WH-130 supisti TYR-aktiivisuuden 65,95 prosenttiin EC-tasosta. Samaan aikaan kojiinihappo (KA), TYR-estäjä, aiheutti entsyymitoiminnan eston 47,09 prosenttiin EY-tasosta. TYR-aktiivisuuden esto oli suurempi lämpökäsitellyssä lakritsissa (WH-130) kuin kuumentamattomassa lakritsissa (WC).
3.7.2. Solujen tyrosinaasiaktiivisuus
Kuten kuviossa 5b esitetään, IBMX-käsiteltyjen solujen TYR-aktiivisuus nousi 233 prosenttiin verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (100 %). WC alensi TYR-aktiivisuutta 82,17 prosenttiin IBMX:llä hoidettuun ryhmään verrattuna. WH-130-uute esti solujen TYR-aktiivisuutta 59,88 prosenttiin verrattuna IBMX-käsiteltyihin soluihin. KA vähensi solujen TYR-aktiivisuutta 74,07 prosenttiin IBMX-käsiteltyjen solujen tasosta. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lakritsiuutteet (WC ja WH-130) estävät TYR-aktiivisuutta ja että WH-130:lla on voimakkaampi TYR:ää estävä vaikutus kuin WC:llä ja KA:lla.
Seuraavaksi tutkimme korrelaatioita TPC:n, ISL:n sisällön,antioksidanttiaktiivisuus ja anti-melanogeeninen aktiivisuus (taulukko 3). TPC korreloi positiivisesti ISL-sisällön (0.827) sekä ABTS plus- ja DPPH-radikaaleja poistavien toimintojen kanssa (0.886 ja 0.896, vastaavasti), kun taas TPC korreloi käänteisesti melaniinipitoisuuden kanssa (-0.859). ISL-sisältö korreloi positiivisesti ABTS plus- ja DPPH-radikaalienpoistotoimintojen kanssa (0.977 ja 0.985, vastaavasti), kun taas ISL-sisältö korreloi käänteisesti TYR-aktiivisuuden kanssa (-0). 834) ja melaniinipitoisuus (–0.995). Antioksidanttiaktiivisuus (ABTS plus ja DPPH) korreloi käänteisesti TYR-aktiivisuuden (–{{20}}.879 ja –0.856) ja melaninpitoisuuden (–0) kanssa. 974 ja -0,984). Nämä tulokset osoittavat, että lakritsissa olevat fenoliyhdisteet, kuten ISL, liittyvät läheisesti antioksidanttiin jaanti-melanogeeninenlakritsiuutteiden toiminta.
3.8. Lakritsiuutteiden vaikutukset melanogeneesiin liittyvien geenien mRNA-ilmentymiseen
Tutkimme melanogeneesiin liittyvien geenien ilmentymistä B16F10-soluissa selvittääksemme lakritsiuutteiden vaikutukset melanogeneesiin. Sekä WC että WH-130 suppressoivat MITF:n, TYR:n, TRP-1 ja TRP-2 mRNA-ilmentymistä (kuva 6). WC esti MITF:n, TYR:n, TRP-1 ja TRP-2 mRNA:n ilmentymisen tasolle 0.{{10}}kertaiseksi, 0.{101} {12}}fold, 0.71-fold ja 0.65-fold, vastaavasti IBMX-käsiteltyjen solujen soluista. WH-130 esti MITF:n, TYR:n, TRP-1:n ja TRP{{20}} mRNA:n ilmentymistä 0.43-kertaiseksi, {{33 }}.60-fold, 0.62-fold ja 0.49-fold, vastaavasti IBMX-käsitellyistä ryhmätasoista. WH{{30}}-uutteella oli voimakkaampi estävä vaikutus mRNA:n ilmentymiseen kuin WC-uutte. ISL tukahdutti myös MITF:n, TYR:n, TRP-1 ja TRP-2 (042-kertainen, 059-kertainen, 068-kertainen) ilmaisun ja 0.{40}}kertaisesti IBMX-käsiteltyihin soluihin verrattuna). WH-130--käsitellyssä ryhmässä melanogeneesiin liittyvien geenien mRNA-ilmentymisen väheneminen oli suurempi kuin WC:llä hoidetussa ryhmässä, mikä osoittaa, ettälakritsiuutteet estävät melanogeneesiä estämällä melanogeneesiin liittyvien geenien transkription ja että lämpökäsittely parantaaanti-melanogeeninenlakritsiuutteen aktiivisuus.
3.9. Lakritsiuutteiden vaikutukset melanogeneesiin liittyvien geenien proteiiniekspressioon
Kuten kuvasta 7b näkyy, hoito WC:llä ja WH-130:lla vähensi merkittävästi MITF:n, TYR:n, TRP-1- ja TRP-2-proteiinien ilmentymistasoja. MITF:n, TYR:n, TRP-1 ja TRP-2 ilmentymistasot vaimenivat WC:llä käsitellyissä soluissa (0.79-fold, 0.{{9) }}fold, {{10}.89-fold and 0.67-fold, vastaavasti suhteessa IBMX-käsiteltyihin soluihin). WH-130 osoitti alentuneita MITF:n, TYR:n, TRP-1- ja TRP-2-proteiinien ilmentymistasoja ({{20}}.74-kertainen, {{24) }}.73-fold, 0.80-fold ja {{30}.48-fold, vastaavasti suhteessa IBMX-käsiteltyihin soluihin) . ISL alensi MITF:n, TYR:n ja TRP-2 proteiinien ilmentymistasoja (076--kertainen, 0{31}}-kertainen ja 0{33}}-kertainen verrattuna IBMMX-käsiteltyyn. solut). WH-130 tukahdutti melanogeneesiin liittyvien geenien proteiiniekspressiota voimakkaammin kuin WC, mikä osoittaa, ettälakritsiuutteet estävät melanogeneesiä estämällä melanogeneesiin liittyvien geenien translaation ja että lämpökäsittely parantaaanti-melanogeeninenlakritsiuutteen aktiivisuus.
ihoa valkaiseva jauhe
4. Keskustelu
Tämän tutkimuksen tulokset osoittavat, että lämpökäsittelylakritsivaikuttaa TPC:hen, antioksidanttiaktiivisuuteen jaanti-melanogeeninentoiminta. WH{0}}:lla oli korkeampi ruskenemisindeksi ja TPC-arvot kuin WC:llä. Käsittelyolosuhteet, mukaan lukien lämpötila ja paine, vaikuttavat näytteiden ainesosiin. [29]. Kuumentaminen voi edistää Maillardin reaktioita, jotka liittyvät melanoidiinin tuotantoon [23]. Melanoidiineilla on joitain biologisia vaikutuksia, mukaan lukienantioksidantti, kasvainten vastainen ja verenpainetta alentava vaikutus sekä verensokerin modulaatio [30]. Nämä yhdisteet ovat ruskeanvärisiä polymeerisiä makromolekyylejä, jotka muodostuvat Maillard-reaktion kautta sokerien ja aminohappojen välisistä vuorovaikutuksista korkeissa lämpötiloissa [21]. Siten mitä enemmän melanoidiineja kuumennetussa uutteessa on, sitä korkeampi on rusketusindeksi. Kuumentamattoman lakritsiuutteen (WC) väri oli vaaleanruskea, mutta väri tummeni vähitellen korkeassa lämpötilassa (130 astetta). Kuumennusprosessi voi myös aiheuttaa joitakin muutoksia fenoliyhdisteiden kemiallisiin rakenteisiin ja aiheuttaa kasvien soluseinien hajoamisen, jolloin fenoleja vapautuu, mikä johtaa antioksidanttiseen toimintaan [31]. Siten lakritsiuutteiden fenolipitoisuus voi nousta lämpökäsittelyn myötä [21]. Aiemmat raportit osoittivat, että hunajan lämpökäsittely lisäsi melanoidiinin muodostumista ja ruskeamisaste osui samaan aikaan antioksidanttiaktiivisuuden lisääntymisen kanssa [24]. Siksi WH-130 osoitti suurempaa antioksidanttikapasiteettia kuin WC ABTS plus- ja DPPH-radikaaleja poistavissa määrityksissä, joita on käytetty laajasti näytteiden antiradikaalisten aktiivisuuksien määrittämiseen perustuen niiden kykyyn siirtää elektroneja tai vetyatomeja [32].
Yleisin luonnollinenantioksidanttija anti-melanogeeniset yhdisteet ovat fenoleja. Trisiini ja 9-hydroksioktadekadieenihappo tunnistettiin Sorghum bicolorin pääfenoliksi. Lisäksi näillä komponenteilla oli antioksidanttisia ja melanogeenisiä vaikutuksia estämällä tyrosinaasiaktiivisuutta [19]. Lisäksi p-kumaarihapon, Sasa quelpaertensis Nakain anaktiivisen yhdisteen, on osoitettu, että tämä yhdiste esti voimakkaasti tyrosinaasiaktiivisuutta ja vähensi melaniinin tuotantoa melanoomasoluissa [27]. Aiempien tutkimusten mukaan ISL, tunnettu flavonoidiyhdiste lakritsinjuuren hydrolyysituotteessa [6–8], osoittaa antioksidanttista ja antimelanogeenista aktiivisuutta estämällä TYR-aktiivisuutta, melanosomin kuljetusta ja indusoimalla melaniinin hajoamista [10,31] Joten keskityimme otteiden ISL-sisältöön ja ISL:n toimintaan melanogeneesiin liittyvissä mekanismeissa. ISL:ää käytetään terapeuttisena aineena moniin sairauksiin sen lukuisten biologisten vaikutusten vuoksi, mukaan lukien anti-inflammatoriset, antimikrobiset, antioksidantit, syöpää ehkäisevät, immuunisäätelyt, maksan ja sydäntä suojaavat vaikutukset [33]. Tässä tutkimuksessa korkeampi ISL-sisältö mitattiin WH-130:ssa kuin WC:ssä. Ihon hyperpigmentaatio liittyy oksidatiiviseen stressiin. Vapaiden radikaalien poistajilla on raportoitu olevan tärkeä rooli hyperpigmentaation estämisessä [17,34]. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että lakritsin lämpökäsittely voi parantaa sen radikaaleja poistavaa toimintaa jaanti-melanogeeninenantioksidanttisten fenoliyhdisteiden, kuten ISL:n, lisääntymisen kautta. Aiemman kirjallisuuden mukaan lakritsissa (Glycyrrhiza uralensis, G. glabra) on glabreenia, glabridiinia, glabrolia, liquiritigeniiniä, jotka osoittavat tyrosinaasin estoa. Joten näillä yhdisteillä voi myös olla vaikutusta melanogeeniseen toimintaan [10,11,15,35]. Niitä koskevat lisätutkimukset ovat tärkeitä lakritsin melanogeenisten vaikutusten selvittämiseksi.
Melaniinin synteesiä säätelevät TYR, TRP-1, TRP-2 (dopakromitautomeraasi) ja MITF (kuva 8). TYR, kuparia sisältävä glykoproteiini, toimii nopeutta rajoittavana entsyyminä ja sillä on ratkaiseva rooli melaniinin tuotannossa. TYR katalysoi tyrosiinin hydroksylaatiota 3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (DOPA). TYR katalysoi myös DOPA:n hapettumista dopakinoniksi ja dopakinonin muuttumista dopakromiksi. Sitten dopakromi muuttuu dihydroindolitsiiniksi (DHI) tai indoli-5-6-kinoni-2-karboksyylihapoksi (DHICA) [36–38]. Tässä reitissä TRP-2 katalysoi dopakromin muuttumista DHICA:ksi, jonka TRP-1 hapettaa muodostaen eumelaniinia. MITF on spesifinen transkriptiotekijä, jolla on kriittinen rooli melanogeneesissä TYR-, TRP-1- ja TRP-2-ilmentymisen pääsäätelijänä (Kuva 8) [28,37]. Melanogeneesin kemiallinen indusoija on 3-isobutyyli-1-metyyliksantiini (IBMX), joka lisää TYR-aktiivisuutta cAMP-signalointireitin kautta [13]. IBMX lisää solunsisäistä cAMP-pitoisuutta estämällä cAMP-fosfodiesteraasia. cAMP-tasojen nousu aktivoi proteiinikinaasi A:ta (PKA) ja aktivoitu PKA parantaa cAMP:hen liittyvän sitovan proteiinin (CREB) aktiivisuutta ja ilmentymistä [39]. CREB sitoutuu MITF-promoottoriin, mikä johtaa MITF-geeniekspression lisääntymiseen. MITF:n aktivointi edistää TYR:n ja TRP:iden ilmentymistä [13,19]. Siksi MITF:n vaimeneminen johtaa hypopigmentaatioon.
Kuumennettu lakritsiuute (WH-130) esti sienten TYR:n ja solujen TYR:n aktiivisuutta tehokkaammin kuin lämmittämätön lakritsiuute (WC). Lakritsiuutteiden solujen TYR-aktiivisuuden estyminen voi johtua TYR:n heikkenemisestä. Nämä tulokset liittyvät B16F10-melanoomasolujen melaniinipitoisuuteen. B16F10-soluissa WH-130-hoito esti IBMX-indusoidun melaniinin tuotannon paremmin kuin WC-hoito. Lisäksi WH 130 vähensi melanogeneesiin liittyvien markkerien (MITF, TYR, TRP-1, TRP-2) transkriptiota ja translaatiota B16F10-soluissa enemmän kuin WC. Nämä merkit voivat yhdessä vaikuttaa kokonaisuuteenanti-melanogeeninentoimintaa [40].
Lämmityslakritsiuute lisäsi antioksidanttifenoliyhdisteiden, kuten ISL:n, runsautta, ja tämä lisäys liittyi lisääntyneeseenantioksidantti(ABTS plus ja DPPH). Kuumennettu lakritsiuutte (WH-130) osoitti myös lisääntynyttä TYR:ää estävää aktiivisuutta ja vähentynyt melaniinin synteesi. Luonnonmateriaalien kehityksessä on uusi suuntaus turvallisuuspotentiaalin vuoksi. Lakritsia on käytetty kosmeettisissa voiteessa hyperpigmentaatioon [41]. Osoitimme Wongamin potentiaalin uutenaihon valkaisuunkosmetiikassa käytettäväksi ja on todettu, että lämpökäsittely voi parantaa sen mahdollisuuksia.
Glycyrrhiza uralensis Fischer (lakritsi) on antioksidanttinen ja UV-valoa suojaava vaikutus ihmisen ihon fibroblasteissa [22]. Wongamin (lakritsin) ja muiden kotoperäisten lajien vertailututkimukset on kuitenkin suoritettava myöhemmin. Lisäksi lisätutkimuksia Wongamin tunnistamattomista komponenteista, kuten glabreenista, glabridiinista, jotka liittyvät sen melanogeeniseen vaikutukseen, tulisi suorittaa sopivilla menetelmillä. On välttämätöntä tutkia synergistisiä tai antagonistisia vaikutuksia fenoliyhdisteiden välillä lakritsiuutteen ainesosien analyysin jälkeen [40]. Tutkia, miten nämä aineet vaikuttavatantioksidanttija anti-melanogeeniset mekanismit, vetyatomin siirto- tai yksielektronisiirtojärjestelmät ja mitogeenin aktivoimat proteiinikinaasin signalointireitit tulisi arvioida [32,37].
5. Johtopäätökset
Tässä tutkimuksessa tutkimme Wongam-uutteiden potentiaalia, joka on uusi lajikelakritsi, kuten avalkaisukosmetiikassa käytettävä aine ja lämpökäsittelyn vaikutus niiden bioaktiivisuuteen. Wongam-uutteet (WC ja WH-130) osoittivat korkeita radikaaleja poistavia aktiivisuuksia ja estivät melaniinin synteesiä IBMX-indusoiduissa melanosyyteissä estämällä TYR:n aktiivisuutta. Lämpökäsittely lisäsiantioksidanttija Wongamin melanogeenisiä vaikutuksia. Tämän seurauksena WH-130 osoitti ylivoimaista antioksidanttista jaanti-melanogeeninenaktiviteetteja kuin WC. Tuloksemme viittaavat siihen, että lämpökäsitelty Wongam-uute (WH-130) on tehokas pigmenttiä vähentävä aine, jota voidaan käyttää erilaisissa dermatologisissa hyperpigmentaatiohäiriöissä, mukaan lukien ruskeat täplät, pisamiat ja melasma, ja osoittavat, että lämpökäsittelyä voidaan käyttää parantamaan lakritsin melanogeeninen vaikutus.
cistanche tubolosan edut: ihon valkaisu