Tulehduksen vastaiset periaatteet Pinus Taiwanensis Hayatan neuloista ja In Silico -tutkimukset niiden mahdollisista ikääntymistä ehkäisevistä vaikutuksista

Abstrakti:Pinusneulatee on erittäin suosittu itämaissa, kuten Japanissa, Venäjällä, Koreassa ja Kiinassa. Männyn neulateen väitetään olevan merkittävääikääntymistä estävät vaikutukset,mutta selkeää näyttöä ei ole tähän mennessä tuettu. Tässä tutkimuksessa viisitoista kuvaamatonta yhdistettä (1–5) sekä 72 tunnettua yhdistettä puhdistettiin ja karakterisoitiin metanoliuutteiden bioaktiivisesta fraktiosta.P. taiwanensisneuloja.

Parhaat ikääntymistä estävät yrtit Cistanche-tuotteet

Suurin osa isolaateista tutkittiin niiden varaltatulehdusta estävä bioaktiivisuussoluneutrofiilimallilla ja kuudella yhdisteellä (45, 47, 48, 49, 50, ja51) esillä amerkittävä esto superoksidianionin muodostumiselleja elastaasin vapautuminen IC50-arvoilla välillä 3,3± 0.9–8.3± 0.8 µM. Nämätulehdusta ehkäiseviä aineosianiille tehtiin telakointilaskenta, jotta voidaan arvioida niiden sitoutumisaffiniteetti greliinireseptoriin, jolla oli tärkeä rooli aineenvaihdunnan säätelyssä.ikääntymistä estäviä vaikutuksia. Yhdisteet49, 50, ja51 muodostivat vakaan kompleksin greliinireseptorin kanssa vetysidosten ja erityyppisten vuorovaikutusten kautta.

1. Esittely

Pinussuvun (Pinaceae), johon kuuluu yli 100 lajia ja jotka ovat levinneet pääasiassa pohjoisella pallonpuoliskolla, ovat yleensä ikivihreitä puita, kun taas jotkut ovat pensaita [1]. Mänty on kevyttä ja sitä käytetään usein huonekaluina. Neulojen erilaisia ​​farmakologisia vaikutuksia männyn versoihin on kuitenkin kirjattu perinteisen kiinalaisen lääketieteen muinaisiin kirjoihin. "The Divine Husbandman's Herbal Foundation Canonissa" männynneulaset edistivät hiusten kasvua, pidensivät ikää ja sammuttivat janoa. Teoksessa "Taiping Shenghui Fang" tallennettiin, että männyn neuloja voitiin keittää alkoholilla ja niillä oli ikääntymistä estävä vaikutus. Nykyään männyn neulasia käsitellään teenä ja ne ovat suosittuja Aasiassa. Koreassa ainesosatP. densifloraneulatee sekä senantioksidanttisia ja antibakteerisia biologisia aktiivisuuksia on tutkittu laajasti [2,3]. Viime vuosisadan alusta lähtien on tunnistettu yli seitsemänsataa yhdistettäPinus neulat. Suurin osa raportoidusta kirjallisuudesta liittyy eteerisiin öljyihinP. densiflflora[4,5], P. halepensis[6,7], P. nigra[4,8] jaP. sylvestris[4,9]. Tunnustetut komponentitPinusneulat ovat enimmäkseen bentsenoideja, diterpenoideja, flavonoideja, lignaaneja, monoterpenoideja ja seskviterpenoideja [10]. NeulatP. densiflorajaP. morrisonicolaon raportoitu niiden antioksidanttisesta bioaktiivisuudesta [11–14]. Lisäksi neulojen etyyliasetaattiuuteP. morrisonicolainhiboivat NO:n proteiini- ja mRNA-ilmentymistä jaiNOS LPS-indusoidussa RAW 264.7 -makrofagissa, jolla on merkittävä anti-inflammatorinen bioaktiivisuus [13]. Ylikriittinen nestemäinen uuteP. densifloraneulat osoittivat estävän vaikutuksen LPS:n indusoimaan NO-tuotantoon alentamalla sen ekspressiotaiNOS ja vähentää IL-6 ja IL-1 ilmentymistä ja STAT1- ja STAT3-proteiinien aktivaatio LPS:n indusoimissa makrofageissa [15]. EtanoliuuteP. thunbergiineulat osoittivat merkittävää tulehdusta estävää vaikutusta makrofageissa ja tukahduttivat arakidonihapon aiheuttamaa korvan turvotusta ja estivät myeloperoksidaasin entsymaattista aktiivisuutta.16]. Lisäksi fermentoituP. morrisonicolaneulat osoittivat erinomaiset antioksidanttiset ja tulehdusta estävät bioaktiivisuutensa moduloimalla NF-κB-signalointireitti [17]. 

Greliini on 28 aminohaposta koostuva peptidihormoni, joka löydettiin alun perin mahalaukusta.18,19]. Se on endogeeninen ligandi kasvuhormonin eritystä lisäävälle aineelle (GHSR), joka on jäsen -haara luokan A GPCR:issä (G Protein Coupled Receptors) [18,19]. Greliini on ainoa peptidihormoni, joka saa nälän lisäämään ruokahalua [20]. Monet tutkimukset ovat ehdottaneet, että greliinillä on tärkeä rooli aineenvaihdunnan, energiatasapainon, muistin, sydän- ja verisuonijärjestelmän sekä ruoansulatuskanavan toimintojen säätelyssä ihmiskehossa.21–23]. Ghreliini osallistuu myös erilaisiin ihmiskehon fysiologisiin ja patofysiologisiin mekanismeihin, kuten ikääntymiseen.24,25], ja se voi liittyä anti-inflammatoriseen vaikutukseen [26,27]. Ryhmämme tunnisti vuonna 2014 ainutlaatuiset asyloidut flflavonoiditetraglykosidit, nimeltään teaghrelins, Chin-shin oolong -teetä ja osoittivat niiden edistävän kasvuhormonin (GH) vapautumista.28]. Kaksi muuta samanlaista yhdistettä puhdistettiin Shy-jih-chuen oolong teessä ja niiden bioaktiivisuus greliinireseptoriin myös varmistettiin [29]. Neljä teaghreliiniä aiheuttivat näläntunnetta saman säätelyreitin kautta kuin greliini. Ei rajoitu teehen, vaan myös yhdisteitä, joilla on samanlainen rakenne tai biologinen aktiivisuus kuin teaghreliinit, on tutkittuPolygonum multiflflorum(Hes houwu) [30], Ginkgo biloba[31], Morus alba[32] jaCistanche tubulosa [33]. Nämä tulokset auttavat meitä etsimään luonnollisia ikääntymistä estäviä periaatteita seulomalla teen greliinin kaltaisia ​​yhdisteitä, joilla on tulehdusta estäviä vaikutuksia. Sen lisäksi, että se suorittaa suoraan edistävän toiminnan kasvuhormonin vapautumisessa solumalleissa, joidenkin potentiaalisten yhdisteiden molekyylimallinnus olisi tehokkaampaa mahdollisten ehdokkaiden tutkimisessa.34]. Laskennallisia menetelmiä on sovellettu farmakologisten hypoteesien kehittämiseen ja arviointiin. Molekyylitelakka on yksi yleisimmin käytetyistä tekniikoista, ja se ennakoi ligandin aktiiviseen taskuun sitoutumisen konformaatiota ja affiniteettia suurella tarkkuudella [35,36]. Telakointimenetelmät etsivät tehokkaasti korkean ulottuvuuden tiloja mahdollista vuorovaikutusta varten ja käyttävät pisteytysfunktiota, joka asettaa ehdokkaat oikein [37]. 

Vuonna 2018 neuloista puhdistettiin kolme yhdistettäP. morrisonicolaja osoitti merkittävää verisuonia relaksoivaa aktiivisuutta, ja näiden aineosien joukossa yhdellä oli teagreliinin kaltainen rakenne.38]. Taiwanissa,P. taiwanensisneulat yleensä kuivataan ja paistetaan ja käsitellään sitten teenä niiden kuuluisien bioaktiivisuuksien vuoksi.P. taiwanensisHayata on yksi Taiwanin kotoperäisistä ja endeemisistä lajeista. Sitä kutsutaan myös Taiwanin punaiseksi männyksi tai huangshanin männyksi. 8–11 cm pituisessa, hieman jäykkässä ja suorassa ketjussa on kaksi neulasta, jotka kasvavat koko saaren halki matalasta korkeaan ja muodostavat usein puhdasta metsää [39]. Alustavassa tutkimuksessa metanoliuutteiden etyyliasetaattikerros uutettiinP. taiwanensisneulat osoittivat merkittävää estoa superoksidianionin muodostukselle ja elastaasin vapautumiselle IC:n kanssa50 arvot 0.8± {{0}}.2 ja 1.0± 0.1 µg/ml, vastaavasti (taulukko S1). Siksi tässä tutkimuksessa bioaktiiviset ainesosatP. taiwanensisneuloja tutkittiin ja puhdistettujen yhdisteiden anti-inflammatorinen vaikutus arvioitiin bioaktiivisuus solun neutrofiilimallissa. Lisäksi eristetäänP. taiwanensisneulat, joilla oli anti-inflammatorista bioaktiivisuutta, alistettiin telakointilaskentaan jatutkittiin niiden vuorovaikutusta greliinireseptorin kanssa.

2. Materiaalit ja metodit

2.1. Yleiset kokeelliset menettelyt

ultravioletti (UV) spektrit saatiin Hitachin U-2001 UV/V on spektrometri. Theinfrapunaspektrit (IR) tutkittiin Jasco FT/IR-4100 -spektrofotometrillä.1H-, 13C-, ja 2D ydinmagneettinen resonanssi (NMR) spektrit tallennettiin Bruker AV-400NMR-spektrometri. Kemialliset siirtymät näytetäänδ arvot (ppm) tetrametyylisilaanillasisäisenä standardina. TheδH jaδC arvot olivat signaalien kemiallisia siirtymiä,vastaavasti. Korkean erotuskyvyn sähkösumutusionisaatiomassaspektrometria (HR-ESI-MS) olisuoritettu JEOL JMS-700 -spektrometrillä (käytetään negatiivisen ionin tilassa).

2.2. Kasvimateriaali

NeulatP. taiwanensiskerättiin Pulissa, Nantoussa, Taiwanissa ja tunnistettiinProf. Sheng-Yang Wang (metsätalouden laitos, National Chung-Hsing University,Taichung, Taiwan). Lahjakorttinäyte (PCKuo_2016003) talletettiin yrttipuuhunFarmasian korkeakoulu, National Cheng Kung University, Tainan, Taiwan.

2.3. Poisto ja eristäminen

2.4. Spektri- ja fyysiset tiedot 1-5

2.4.2. 1-[(70 R,80 S)-70 ,90 -dihydroksi-70 -(4-hydroksi-3-metoksifenyyli)propaani-80 -yylioksi]-2-hydroksibentsoehappo (2)Väritön siirappi; [ ]25 D plus 5,3 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(Hirsiε) 284 (3.59), 253 (3,80) nm; ECD (c 3.51 × 10−4 M, MeOH)λmax(∆ε) 248 ( plus 1,33), 224 ( plus 1,03),214 (plus 1,10) nm; IR (siisti)νmax3425% 2c 2927% 2c 1541% 2c 1384% 2c 1271 cm−1;1H ja13C NMR; HRESIMSm/z 349.0936 ([M − H]− laskettu C:lle17H17O8, 349.0923).

2.4.3. (13E,12R)-12-Hydroksiagaattihappo (3)

Väritön jauhe; sp: 263◦C (hajoaa); [ ]25 D plus 30,8 (c 0.1, MeOH); UV (MeOH)λmax(Hirsiε225 (sh) (3,83) nm; IR (siisti)νmax3450, 2937, 1648, 1252 cm−1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) δ 0,63 (3H, s, CH3-20), 1,09 (1H, ddd,J = 13,6, 13,6, 3,6 Hz, H-3a), 1,21 (3H, s, CH3-18), 1.21 (1H, m, H-1a), 1.42 (1H, m, H-5), 1.51 (1H, m, H-2a), 1.59 (2H, m, H-11),1.79 (1H, m, H-1b), 1.91 (1H, m, H-2b), 1.91 (1H, m, H-6a), 1.98 (1H, m, H-7a), 2.01 (1H, m,H-6b), 2,08 (3H, s, CH3-16), 2.12 (1H, m, H-9), 2.14 (1H, m, H-3b), 2.43 (1H, m, H-7b), 4.03 (1H, dd,J = 9,2, 2,8 Hz, H-12), 4,53 (1H, s, H-17a), 4,91 (1H, s, H-17b), 5,88 (1H, br s, H-14);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 13,5 (CH3-20), 14,9 (CH3-16), 21.2 (C-2), 27.6 (C-6), 29.6 (CH3-18), 31.5 (C-11), 39.4 (C-3), 40.0 (C-7), 40.3 (C-1), 41.2 (C-10), 45.3 (C-4), 53.1 (C-9), 57.6 (C-5), 75.5 (C-12), 106.9 (C-17), 117.8 (C-14), 150.2 (C-8), 159.5 (C-13), 167.2 (C-15), 181.5 (C-19); HRESIMSm/z 349.2024 ([M − H]− laskettu C:lle20H29O5, 349.2015).

2.4.4. 5-Isopropyyli-3-oksosykloheks-1-eeni-1-karboksyylihappo (4)

Väritön taulukkomainen kristalli; sp: 235◦C (hajoaa); [ ]25 D plus 28,6 (c 0.3, MeOH); UV (MeOH)λmax(Hirsiε) 237 (sh) (3,40) nm; IR (siisti)νmax3456% 2c 2925% 2c 1635% 2c 1395 cm-1;1H-NMR (CD3OD,400 MHz) 0,88 (3H, d,J = 6,8 Hz, CH3-9), 0.98 (3H, d, J = 6,8 Hz, CH3-10), 1.84 (1H, m, H-4a), 2,02 (1H, m, H-4b), 2,09 (1H, m, H-5), 2,31 (1H, hept,J = 6,8 Hz, H-8), 2,50 (1H, dddd,J = 19,2, 9,2, 4,8, 2,4 Hz, H-6a), 2,70 (1H, dddd,J = 19,2, 5,2, 5,2, 1,2 Hz, H-6b), 6,32 (1H, dd,J = 2,4, 1,2 Hz, H-2);13C-NMR (CD3OD, 100 MHz)δ 19.0 (C-9), 20.9 (C-10), 24.3 (C-4), 27.0 (C-6), 27,1 (C-8), 53,7 (C-5), 128,7 (C-2), 160,6 (C-1), 174,8 (C-7), 205,7 (C-3); HRESIMSm/z 181.0855 ([M − H]− laskettu C:lle10H13O3, 181.0865).

2.4.5. Styraksinoliinihappo (5)

Väritön siirappi; UV (MeOH)λmax(Hirsiε) 308 (2,89), 237 (sh) (3,37), 222 (sh) (3,70) nm;IR (siisti)νmax3421% 2c 2926% 2c 1572% 2c 1395% 2c 1268 cm-1;1H-NMR (CD3OD, 400 MHz) 1,82 (2H, tt,J {{0}},0, 6,8 Hz, H-8), 2,61 (2H, t,J {{0}},0 Hz, H-7), 3,56 (2H, t,J = 6,8 Hz, H-9), 3,83 (3H, s, OCH3-3), 6.86 (1H, d, J = 2,4 Hz, H-4), 7,31 (1H, d,J = 2,4 Hz, H-6);13C-NMR (CD3OD,100 MHz)δ 32,7 (C-7), 35,6 (C-8), 56,6 (OCH3-3), 62.3 (C-9), 116.3 (C-4), 120.1 (C-1), 122.8 (C-6), 131,9 (C-5), 149,2 (C-3), 150,7 (C-2), 176,2 (C-10); HRESIMSm/z 225.0767 ([M − H]−laskettu C:lle11H13O5, 225.0763).

2.5. Tulehduksen vastainen bioaktiivisuustutkimus

2.5.1. Ihmisen neutrofiilivalmiste

Tutkimus suoritettiin Chang Gung Memorial Hospitalin (IRB-nro 201800369A3) Institutional Review Boardin hyväksynnällä. Verinäytteet otettiin terveiltä ihmisluovuttajilta (20–30-vuotiaat), ja neutrofiilit eristettiin ja puhdistettiin aiemmin kuvattujen käytäntöjen mukaisesti [40]. 

2.5.2. Superoksidianionien sukupolvi

Mittaus Testi superoksidianionin muodostumisen mittaamiseksi perustui ferrisytokromin SOD:n estävään pelkistykseenc kuten aiemmin on kuvattu [40].

2.5.3. Elastaasin vapautumismääritys

Atsurofiilisten rakeiden degranulaatio määritettiin mittaamalla elastaasin vapautuminen aiemmin kuvatulla tavalla [40]. 

2.5.4. Tilastollinen analyysi Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona± keskiarvon standardivirhe (SEM). 50 prosentin estopitoisuuden laskeminen (IC50) suoritettiin PHARM/PCS v.4.2 -ohjelmistolla. Tilastolliset vertailut tehtiin ryhmien välillä Studentin avullat-testata. Arvotp < 0.05 were considered to be statistically significant. 

2.6. Molecular Docking Study

Thein silicoarviointi suoritettiin AutoDock Vina -ohjelmistolla [41]. Greliinireseptorin kiderakenne on karakterisoitu [42] ja a. PDB-tiedosto ladattiin Protein Databankista (PDB ID: 6KO5). Ligandien 3D-rakenteet rakennettiin Chem3D-ohjelmalla. Vetylisä, Gasteiger-varauksen mittaus proteiiniatomeille ja joustavien vääntöjen valinta ligandeille suoritettiin. AutodockTools (ADT versio 1.5.6). Ristikon kooksi on suunniteltu 18,5 Å× 18.5 Å × Määritettiin 18,5 Å ja ruudukon keskipiste mitoissa (x, y ja z, vastaavasti): 9,7, -19,2, 14,6. Sitoutumisaffiniteettienergia annettiin telakointipisteinä ja ilmoitettiin kcal/mol. Parhaaksi vuorovaikutukseksi pidettiin vain eniten pisteitä saanut asento. Parhaiden telakointivuorovaikutusten visualisointi analysoitiin Biovia Discovery Studio -asiakasohjelmassa 2020 [43].