Poly(pro-17-estradiolin) akuutit annoksesta riippuvat neurosuojaavat vaikutukset selkärangan ruhjevaurioiden hiirimallissa

Abstrakti

17 -Estradioli (E2) antaa hermostoa suojaa selkäydinvaurion prekliinisissä malleissa, kun sitä annetaan systeemisesti. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli levittää E2:ta paikallisesti loukkaantuneeseen selkäytimeen pitkäkestoisesti käyttämällä poly(pro-E2)-kalvobiomateriaaleja.

Kun ihmiset oppivat enemmän selkäydinvammoista, alamme ymmärtää, miten se vaikuttaa ihmisten fyysiseen ja henkiseen terveyteen. Vaikka selkäydinvammat voivat aiheuttaa monia haittavaikutuksia, onneksi niiden vaikutusta muistiin voidaan hallita.

Ensinnäkin meidän on selvitettävä, mikä selkäydinvamma on. Selkäydin on selkärangassa suojattu hermo, joka vastaa ohjeiden välittämisestä aivoista eri kehon osiin. Jos selkäydin vaurioituu, jotkin kehon osat menettävät hyvän yhteyden aivoihin, mikä johtaa raajan liikkeisiin, tuntemuksiin ja autonomiseen hallintaan.

Selkäydinvammat voivat vaikuttaa jonkin verran ihmisten muistiin, erityisesti selkäydinvammapotilaiden kuntoutuksen alkuvaiheessa. Selkäydinvammat voivat heikentää huomiokykyä, työmuistia ja tunteiden prosessointikykyä, mikä vaikuttaa henkilön muistikykyyn.

Nämä negatiiviset vaikutukset kuitenkin vähenevät vähitellen, kun potilaat joutuvat kuntoutushoitoon. Potilaat voivat parantaa muistiaan osallistumalla muistipeleihin ja muihin kognitiivisiin harjoituksiin. Samalla fyysinen kuntoutus edistää myös kehon motoristen ja sensoristen toimintojen palautumista, mikä parantaa tunne- ja kognitiivisia toimintoja.

Selkäydinvammapotilaita tulee rohkaista osallistumaan aktiivisesti kuntoutushoitoon ja jatkamaan kuntoutusharjoituksia fyysisen ja henkisen terveyden parantamiseksi. Uskokaa, että oikean kognition ja postoperatiivisen hoidon avulla potilaat voivat voittaa selkäydinvamman vaikutuksen muistiin ja jatkaa aktiivista elämää. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche voi myös säädellä välittäjäaineiden tasapainoa, kuten nostaa asetyylikoliinin ja kasvutekijöiden tasoa, jotka ovat erittäin tärkeitä muistille ja oppimiselle. Lisäksi Cistanche voi myös parantaa verenkiertoa ja edistää hapen toimitusta, mikä voi varmistaa, että aivot saavat riittävästi ravintoa ja energiaa, mikä parantaa aivojen elinvoimaa ja kestävyyttä.

Napsauta tietää lisäravinteita parantaaksesi muistia

Aikuisten uroshiirten kontusiivisen selkäydinvaurion jälkeen poly(pro-E2)-kalvot istutettiin subduraalisesti, ja hermosuojaus arvioitiin immunohistokemian avulla 7 päivää vaurion ja implantoinnin jälkeen. Näissä tutkimuksissa poly(pro-E2)-kalvot paransivat hieman hermosolujen suojausta vaikuttamatta tulehdusvasteeseen. verrattuna loukkaantuneisiin kontrolleihin.

Vapautuneen E2-annoksen lisäämiseksi valmistettiin bolusta vapauttavia poly(pro-E2)-kalvoja sisällyttämällä sitoutumatonta E2:ta poly(proE2)-kalvoihin.

Vaurioituneisiin kontrolleihin verrattuna bolusta vapauttavat poly(pro-E2)-kalvot eivät kuitenkaan merkittävästi tehostaneet hermosolujen suojausta tai rajoittaneet tulehdusta 7 tai 21 päivää vamman jälkeen. Tulevassa työssä keskitytään poly(pro-E2)-biomateriaalien kehittämiseen, jotka pystyvät tarkemmin vapauttamalla terapeuttisia annoksia E2:ta.

JOHDANTO

Traumaattinen selkäydinvamma (SCI) on heikentävä sairaus, joka vaikuttaa yli 18,{1}} ihmiseen joka vuosi Yhdysvalloissa, kun taas SCI:n maailmanlaajuisen esiintyvyyden arvioidaan olevan 236–1009 miljoonaa kohden.2

Potilailla, joilla on SCI .

Ajan myötä nämä astrosyytit muodostavat gliaarven, joka estää aksonien leviämisen vaurion reunan ulkopuolelle.5 Tähän mennessä ei ole olemassa FDA:n hyväksymiä hermosoluja suojaavia lääkkeitä SCI:n hoitoon.

Useita vuosikymmeniä kestänyt tutkimus on keskittynyt biomolekyylien systeemiseen antamiseen sekundaarisen vaurion aiheuttaman hermosolujen häviämisen estämiseksi ja/tai aksonien regeneraation edistämiseksi, mikä lopulta johtaa menetettyjen toimintojen palautumiseen.6 Yksi biomolekyyli, joka on osoittanut merkittävää lupausta SCI:n prekliinisissä malleissa, on naispuolinen molekyyli. sukupuolihormoni, 17 -estradioli (E2).

E2:n antaminen on laajalti hyödyllistä keskushermostolle vähentämällä tulehdusta,7–9 lievittää gliasolujen reaktiivisuutta,10 rajoittaen oksidatiivista stressiä,11–14 ja lieventää glutamaatin aiheuttamaa eksitotoksista hermosolujen kuolemaa.15 E2 parantaa toiminnallista palautumista erilaisissa SCI:n jyrsijämalleissa.10, 16,17 Mielenkiintoista on, että E2:n systeeminen usean annoksen antaminen indusoi toiminnallista palautumista nopeammin18,19 verrattuna eläimiin, jotka saavat vain yhden annoksen.17

Koska E2 edistää toiminnallista palautumista tehokkaammin useiden annosten avulla, tavoitteemme oli vapauttaa E2:ta vakaasti paikallisesti vauriokohdassa (estääksemme mahdolliset sivuvaikutukset) kiertääksemme useista E2:n annoksista/systeemisistä injektioista aiheutuvia ongelmia.

Tätä varten käytimme poly(etyleeniglykoli)biomateriaalistrategiaa, jossa natiivi lääkeaine (E2) ensin funktionalisoitiin reaktiivisilla allyyliryhmillä ja polymeroitiin sitten fotoinitioidulla tioli-eeniradikaaliadditiolla joustavalla oligo-(etyleeniglykoli)ditiolilla, kuten aiemmin on kuvattu. .20 Saimme korkeamolekyylipainoisia polymeeriketjuja, jotka koostuvat E2-aihiolääkeestä toistuvana yksikkönä polymeerissä.

Hydrolyyttisessä hajoamisessa polymeeri vapauttaa asteittain E2:ta ympäröivään väliaineeseen. Ainoat muut vapautumisen sivutuotteet ovat hiilidioksidi ja oligo(etyleeniglykoli) (oEG) (kuva 1). Kalvoiksi tai mikrokuiduiksi valmistetut poly(pro-E2)-ketjut voivat vapauttaa E2:ta nanomolaarisina pitoisuuksina in vitro kuukausista vuosiin. .20

Näistä poly(pro-E2)-telineistä vapautuva E2 on bioaktiivista, ja nämä telineet edistävät neurotrofiaa ja hermosolujen suojaamista in vitro suojaamalla hermosoluja vetyperoksidin aiheuttamalta oksidatiiviselta stressiltä. Tässä käytimme poly(pro-E2) -kalvoja ruhje SCI:n hiiren mallissa välittömästi vamman jälkeen ja arvioimme niiden hermostoa suojaavan kyvyn in vivo.

Alkuperäinen poly(pro-E2)-kalvosuunnittelumme lisäsi hermosolujen suojaa akuutisti (7 päivää vaurion jälkeen) vauriokohdassa vaikuttamatta tulehdusvasteeseen. Koska poly(pro-E2)-kalvot vapauttavat nanogrammaa E2:ta päivässä, kehitimme toisen vapautumisstrategian, jossa sitoutumatonE2 sisällytettiin poly(pro-E2)-matriisiin. Oletimme, että sitoutumattoman E2:n bolusvapautus voi tarjota lisää hermostoa suojaavia etuja.

Poly(pro-E2)-kalvot vapauttavat E2:ta räjähdysmäisesti, mitä seuraa E2:n jatkuva vapautuminen polymeeristä pienemmillä pitoisuuksilla. Immunohistologinen värjäys arvioi neuronit, astrosyytit ja makrofagit/mikrogliat vauriokohdassa akuutisti (7 päivää vaurion jälkeen) ja kroonisesti (21 päivää vaurion jälkeen) SCI:n jälkeen näiden bolusta vapauttavien poly(pro-E2)-kalvojen läsnä ollessa.

TULOKSET JA KESKUSTELU

Poly(pro-E2)-kalvot vapauttavat E2:ta nanomolaarisina pitoisuuksina, edistävät hermosolujen uloskasvua takajuuren ganglionista ja suojaavat hermosoluja vetyperoksidin aiheuttamalta oksidatiiviselta stressiltä in vitro.20 Tässä esitellyssä tutkimuksessa pyritään määrittämään poly(pro-E2:n) kyky kalvoja neurosuojauksen aikaansaamiseksi in vivo käyttämällä ruhje-SCI:n hiiren mallia.

Kohtalainen ruhje SCI indusoitiin aikuisilla uroshiirillä, ja välittömästi vaurion jälkeen poly(pro-E2)-kalvot asetettiin suoraan vaurion yläpuolelle (kuvio 2A). Sen varmistamiseksi, että poly(pro-E2)-kalvot pysyivät paikoillaan implantaation jälkeen, rodamiini B:llä ladattuja poly(pro-E2)-kalvoja istutettiin loukkaantuneiden eläinten selkäytimeen. Seitsemän päivää istutuksen jälkeen selkäytimet kerättiin ja kuvattiin valomikroskoopilla (kuva 2B). Kaikissa eläimissä implantoidut rodamiini B:llä ladatut poly(pro-E2)-kalvot pysyivät paikallaan vahvistaen implantaatioprotokollan.

Poly(pro-E2)-kalvojen kyvyn testata hermosolujen suojauksen ja tulehduksen lievittämiseksi poly(pro-E2)-kalvoja (ilman rodamiini B:tä) istutettiin selkärangan ruhjevaurion jälkeen, ja selkäytimet kerättiin 7 päivää vamman ja implantoinnin jälkeen. Pitkittäisiä leikkeitä (10 μm paksu) leikattiin, keskitettiin vamman episentrumin ympärille ja immunomerkittiin selkäytimen neuronien ja makrofagien visualisoimiseksi (kuva 3).

Leikkeet merkittiin NeuN:lle hermosolujen läsnäolon arvioimiseksi, ja värjäyksen kvantitatiivinen analyysi paljasti, että poly(pro-E2)-kalvot lisäsivät merkittävästi NeuN-positiivista aluetta vamman episentrumin ympärillä verrattuna loukkaantuneisiin kontrolleihin, jotka eivät saaneet kalvo-implantteja (kuva 3A; p=0.0002). Lisävärjäys aksoneille käyttäen NFH:ta (neurofilamenttiraskasketju) paljasti myös istutettujen poly(pro-E2)-kalvojen akuutin hermostoa suojaavan vaikutuksen (kuvio 3B; p=0.0017).

Havaitsimme, että tämä muutos hermosuojassa ei johtunut vauriokohdan apoptoosin (kaspaasi 3) muutoksesta (tukikuvaa S1; p=0.9966). Aktivoitujen makrofagien (CD68) värjäys ei myöskään paljastanut mitään merkittäviä eroja poly(pro-E2)-kalvolla käsiteltyjen eläinten ja käsittelemättömien eläinten välillä (kuvio 3C; p= 0.7207).

Kaiken kaikkiaan poly(pro-E2)-kalvot lisäävät vaatimattomasti hermosolujen suojausta akuutisti muuttamatta tulehdusvastetta. Poly(pro-E2)-kalvot lisäsivät hermosolujen tiheyttä akuutisti lähes 20 %, mutta kalvoilla ei ollut ilmeisiä tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia (perustuu aktivoitujen makrofagien miehittämä alue) (kuva 3).

Tämä tulehduksen vähenemisen puute voi viitata siihen, että E2:n anti-inflammatoriset ja hermostoa suojaavat annokset ovat erilaisia ​​ja että kumpaakaan ei saavutettu nykyisellä kalvoformulaatiolla.20 Oletimme, että lisääntyvä E2:n vapautuminen poly(pro-E2)-kalvoista akuutisti voi vähentää tulehdusta. ja mahdollistaa tehokkaamman neuroprotektiivisen vasteen.

Akuutisti vapautuvan E2:n annoksen lisäämiseksi poly(pro-E2)-kalvoja muunnettiin siten, että bolus E2:n vapautuminen tapahtuisi välittömästi implantaation jälkeen. E2:n bolusvapauttamisen jälkeen seuraisi polymeerin hajoaminen, jolloin E2 vapautuisi samassa pitoisuudessa kuin ennen. Yllä kuvattu koe toistettiin käyttämällä näitä bolusta vapauttavia poly(pro-E2)-kalvoja, ja hermosolujen suojaus ja tulehdus arvioitiin 7 päivää vaurion jälkeen (dpi).

Lisäedun sijaan bolusta vapauttavat poly(pro-E2)-kalvot eivät kuitenkaan lisänneet merkittävästi NeuN-positiivista aluetta verrattuna loukkaantuneisiin, hoitamattomiin kontrolleihin (kuvio 4A; p=0.6770). Bolusta vapauttavat poly(proE2)-kalvot lisäsivät CD68:n ilmentymistä, mutta kasvu ei ollut tilastollisesti erilainen (p= 0.1780).

Lisääntyviä suuntauksia gliareaktiivisuudessa ja mikrogliatulehduksessa havaittiin myös bolusta vapauttavien poly(pro-E2)-kalvojen läsnä ollessa johtuen GFAP:n (astrosyytit) ja Iba1:n (mikroglia) ilmentymisen lisääntymisestä; nämä lisäykset eivät kuitenkaan olleet tilastollisesti suurempia kuin mitä havaittiin loukkaantuneissa, hoitamattomissa kontrolleissa (p=0.3233 ja p=0.3053, vastaavasti). Kaiken kaikkiaan bolusta vapauttavat poly(pro-E2)-kalvot eivät tehostaneet hermosolujen suojausta, eivätkä astrosyyttien reaktiivisuus ja makrofagien/mikroglioiden esiintyminen vähentyneet, kuten alun perin oletettiin.

Koska eroja loukkaantuneiden, hoitamattomien eläinten ja loukkaantuneiden, bolusta vapauttavien poly(proE2)-kalvolla käsiteltyjen eläinten välillä ei havaittu akuutissa 7 dpi:n aikapisteessä, jatkotutkimuksia varten valittiin krooninen aikapiste, koska poly(pro-E2)-kalvot voi vapauttaaE2:ta pitkällä aikavälillä.20 Yllä kuvattu koe toistettiin bolus-releasingpoly(pro-E2)-kalvoilla, mutta eläimet arvioitiin kroonisesti 21 dpi:llä (kuvio 5).

Selkäytimet leimattiin samoille solutyypeille, jotka mainittiin aiemmin. Analyysin jälkeen NeuN:n pinta-ala lisääntyi bolusta vapauttavissa poly(pro-E2)kalvolla istutetuissa eläimissä verrattuna loukkaantuneisiin, hoitamattomiin eläimiin (kuva 5A; p=0.0897) .Lisäksi havaittiin suuntauksia, joissa bolusta vapauttavat poly(pro-E2)-kalvot vähensivät CD68- ja GFAP-ekspression pinta-alaosuutta verrattuna käsittelemättömien loukkaantuneiden eläinkontrollien tietoihin (kuva 5B, C; p=0.0859 ja p=0.2780).

Yksikään trendeistä ei kuitenkaan ollut tilastollisesti erilainen. Toisaalta Iba1-leimatut kudosleikkeet bolusta vapauttavista poly(pro-E2)-käsitellyistä eläimistä osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä verrattuna käsittelemättömien, loukkaantuneiden kontrollien tietoihin (p < 0,0001). Aiempi työmme osoittaa, että poly(pro) -E2) kalvot, jotka on valettu 15 mm × 15 mm:n peitelaseille, vapauttavat noin 266 ng E2:ta päivässä20, mikä tarkoittaa noin 2 ng E2:ta päivässä tässä käytetyistä kalvoista (1 mm × 1,8 mm). Bolusta vapauttavat poly(pro-E2)-kalvot vapauttavat lisäksi 40 ug sitoutumatonta E2:ta akuutisti implantoinnin jälkeen.

Tutkimus, joka keskittyy E2:n käyttöön jyrsijän SCI-malleissa, osoittaa, että laskimonsisäisesti annettu pieniannoksinen estrogeeni (10 ug/kg) heikentää reaktiivista glioosia ja tarjoaa hermosuojan samalla kun se vaimentaa tulehdustapahtumia, estää apoptoosia ja lisää angiogeneesiä.21 Sitä vastoin suurilla systeemisillä estrogeeniannoksilla on haittavaikutuksia, joita ovat syvän laskimotromboosin ja syövän lisääntyminen22,23 ja naisten fyysisten ominaisuuksien kehittyminen miehillä. Tämä on huomionarvoista, koska suurin osa E2-tutkimuksesta on keskittynyt E2:n antamiseen systeemisesti joko suonensisäisesti tai intraperitoneaalisesti.

Kun otetaan huomioon turvallisuuteen liittyvät huolenaiheet, jotka liittyvät suurten E2-annosten systeemiseen käyttöön, on tärkeää optimoida E2-pitoisuus paikallista kuljettamista varten loukkaantuneeseen selkäytimeen sivuvaikutusten estämiseksi. Tähän mennessä vain yksi tutkimus on tuonut E2:ta biomateriaalista käyttämällä nanopartikkeleita E2:n fokusoimiseen (2,5 ug tai 25 ug). Vapautuminen nanopartikkeleista vähensi nopeasti tulehdusta akuutisti ruhje SCI:n rottamallissa.9Tiedoissamme olevan tilastollisesti merkitsevän vasteen puuttuminen (kuvat 4 ja 5) voi johtua epätasapainosta E2:n määrässä, jonka toimitamme paikallisesti selkäytimeen. Liian paljon E2:ta (40 ug) vapautuu akuutisti, kun taas hyvin vähän (2 ng) vapautuu kroonisesti.

Vaikka näiden tietojen perusteella havaitsemamme ovat vaatimattomia suuntauksia, tämä tutkimus korostaa E2-annostelun tärkeyttä hermosolujen suojauksen edistämisessä in vivo. E2:n alkuannoksen pienentäminen ja poly(pro-E2)-biomateriaalin hajoamiskinetiikan säätäminen voisi auttaa lievittämään tätä ongelmaa ja mahdollisesti tarjota parempia hermostoa suojaavia tuloksia.

Vaikka tämä tutkimus suoritettiin vain miehillä, on ratkaisevan tärkeää arvioida näiden poly(pro-E2)-kalvojen vaikutus molemmissa sukupuolissa tämän biomateriaalin pätevän translaatiopotentiaalin määrittämiseksi. Tutkimukset ovat osoittaneet, että SCI:n jälkeen naisten kohonneet estrogeenitasot saattavat olla osittain vastuussa heidän parantuneista toiminnallisista tuloksistaan ​​miehiin verrattuna.24Koska estrogeenin esiintyminen naisilla on lisääntynyt, minkä tahansa estrogeeniä käyttävän biomateriaalistrategian on otettava tämä lisääntynyt taso huomioon ja muutettava materiaalia. Vapauta kinetiikkaa vastaavasti varmistaaksesi, että annettu annos pysyy samana miehille ja naisille.

MENETELMÄT

Poly(pro-E2) -kalvojen valmistus.

Poly(pro-E2)-polymeeri P1 syntetisoitiin ja karakterisoitiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti aiemmin.20 Polymeerin painokeskimääräinen molekyylipaino on MW ~ 80 kDa ja dispergointi Ð ~ 3 geelipermeaatiokromatografian (GPC) mukaan. Poly(pro-E2)kalvot valmistettiin liuottamalla polymeeri kloroformiin (5 paino-%/paino; polymeeri/kloroformi), pisarottamalla liuos 15 mm × 15 mm:n lasisille peitelasiille (100 µl liuosta per peitelasi) ja jättämällä ne. kuivua yön yli tyhjiössä (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Poly(pro-E2)-kalvojen luomiseksi sitoutumattoman E2:n kanssa kalvot valmistettiin lisäämällä sitoutumatonta E2:ta (Abcam, Cambridge, MA) polymeeriliuokseen (0,0625 paino-%/paino; E2/kloroformi) ennen pisaravalua. liuos peitinlasien päälle. Ennen implantointia kalvolla varustetut peitelasit steriloitiin ultraviolettisäteilyllä (UV) 30 minuutin ajan ja kalvot irrotettiin peitelaseista steriilissä bioturvallisuuskaapissa. Poly(pro-E2)-kalvot leikattiin sitten 1 mm × 1,8 mm:n paloiksi, jotka sopivat istutettavaksi aikuiseen hiireen alla kuvatulla tavalla.

Ruhjeselkäydinvamma ja poly(pro-E2)-kalvojen istutus.

Rensselaer PolytechnicInstitute ja Ohio State University Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) hyväksyivät kaikki kirurgiset ja postoperatiiviset hoitotoimenpiteet. SCI:n indusoimiseksi aikuiset urospuoliset C57BL/6-hiiret (10-–12-viikon ikäiset), jotka ostettiin Jackson Laboratorysta (varastonumero 000664; Bar Harbor, ME), nukutettiin vatsaontelonsisäisellä injektiolla. ketamiinia (80 mg/kg) ja ksylatsiinia (10 mg/kg). Eläinten takapinnat ajeltiin ja valmistettiin aseptisesti käyttäen 70 % etanolia ja betadiinia.

Eläimen asettamisen jälkeen lämmitystyynylle, jota pidettiin 37 asteessa, iho- ja lihaskerrokset avattiin selkärangan paljastamiseksi, ja rintakehän yhdeksännelle (T9) nikamalle tehtiin dorsaalinen laminektomia selkäytimen paljastamiseksi. Kohtalainen (75 kdyn) ruhje SCI indusoitiin tällä tasolla käyttämällä Infinite Horizons -iskulaitetta (Precision Systems andInstrumentation, Lexington, KY).

Kun hemostaasi oli saavutettu, kovakalvo avattiin (kuva 2) ja poly(pro-E2)-kalvo tai bolusta vapauttava poly(pro-E2)-kalvo (1 mm × 1,8 mm) asetettiin kovakalvon alle ja selkäytimen yläpuolelle peittäen. loukkaantumiskohtaa. Kontrollieläimillä kovakalvo avattiin, mutta poly(pro-E2)-kalvoja ei istutettu. Lihaskerrokset suljettiin sitten steriileillä ompeleilla ja iho suljettiin steriileillä metallisilla haavaklipsillä.

Hiiret saivat 2 ml steriiliä suolaliuosta injektoituna ihonalaisesti ja palautettiin häkkeihinsä ja asetettiin objektilasien lämmittimelle, joka oli asetettu 37 asteeseen yön yli. Oikean nesteytyksen varmistamiseksi ja infektioiden estämiseksi hiirille injektoitiin ihon alle 1–2 ml steriiliä suolaliuosta ja Gentocinia (1 mg/kg) päivittäin ensimmäisten 5 päivän ajan vaurion jälkeen (dpi). Virtsarakkoja ekspressoitiin manuaalisesti kahdesti päivässä kokeiden ajan. Kaikki eläimet pidettiin tavanomaisissa olosuhteissa 12-tunnin valo-pimeä-jaksolla, jolloin ruokaa ja vettä oli saatavilla ad libitum.

Kudosten kerääminen.

Määritetyissä 7 tai 21 dpi:n päätepisteissä hiirille injektoitiin tappava annos ketamiinia/ksylatsiinia (1,5-kertainen kirurginen annos) ja perfusoitiin transkardiaalisesti 0,1 M fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS; pH 7,4). sen jälkeen 4 % paraformaldehydiä (PFA; pH 7,4). Selkäytimet poistettiin, jälkikiinnitettiin 2 tuntia 4 % PFA:ssa ja siirrettiin sitten 0,2 M fosfaattipuskuriin (PB; pH 7,4) yön yli.

Selkäytimet kylmäsuojattiin 30-prosenttisessa sakkaroosissa 48 tuntia 4 asteessa ja suljettiin sitten 10 mm:n segmenteiksi, jotka oli keskitetty vauriokohdan ympärille selkäpylväät ylöspäin. Nämä leikkeet upotettiin Tissue-Tek optimaalisen leikkauslämpötilan väliaineeseen (VWR International, Radnor, PA) ja jäädytettiin nopeasti kuivajäällä. Kaikki selkäytimet leikattiin 10 μm:n pituiseksi Microm HM505E -kryostaatilla, joka asetettiin ColorFrost Plus -levyille (The ScientermoFisher Scientific Waltham, MA) ja säilytettiin sitten -20 asteessa, kunnes sitä käytettiin immunovärjäykseen.

Immunohistokemia ja kvantifiointi.

Objektilasit sulatettiin objektilasien lämmittimessä 1 tunnin ajan ja huuhdeltiin sitten 3 kertaa 0,1 MPBS:ssä. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus sammutettiin inkuboimalla objektilaseja 6-prosenttisessa H202:ssa, joka oli laimennettu metanoliin, 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen 3 kertaa 0,1 M PBS:ssä, leikkeitä inkuboitiin 4 % BSA:n ja 0,1 % Triton X-100 kanssa 0,1 M PBS:ssä 1 h, minkä jälkeen primaaristen vasta-aineiden inkubointi yön yli 4 asteessa tai huoneenlämpötilassa (taulukko 1).

Objektilaseja inkuboitiin sopivien biotinyloitujen sekundaaristen vasta-aineiden kanssa (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) huoneenlämpötilassa 1 tunti. Sitoutuneen vasta-aineen visualisoimiseksi objektilaseja inkuboitiin Vectastain Elite-ABC:n (Vector Laboratories) kanssa 1 tunnin ajan ja kehitettiin ImmPACT3,3'-diaminobentsidiinin (DAB) tai Vector SG -substraatin (Vector Laboratories) kanssa 10 minuuttia.

Näistä leikkeistä kuivattiin peräkkäisiä 2 × 2 minuutin inkubaatioita 70-prosenttisessa ja 90-prosenttisessa etanolissa, 2 × 3 minuuttia 100-prosenttisessa etanolissa, mitä seurasi 3 × 3 minuuttia Histoclearissa, ja lopuksi peitettiin Permountilla (ThermoFisher Scientific). Kvantitointianalyysiin käytettiin kuutta leikettä per eläin, jotka olivat 100 μm:n etäisyydellä vaurioituneesta selkäytimestä.

Immuunimerkityt osat kuvattiin käyttämällä Axioplan 2 -kuvausmikroskooppia, joka oli varustettu AxioCamdigital-kameralla ja AxioVision-versiolla 4.8.2 -ohjelmistolla (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Saksa) ja 5×-objektiivilla.

Positiivisten pikselien lukumäärä kussakin osiossa laskettiin käyttämällä MIPAR-kuvaanalyysiohjelmistoa (MIPAR, Worthington, OH) positiivisen alueen prosenttiosuuden laskemiseksi leikettä kohti. Kuuden osan positiivisen alueen keskimääräinen prosenttiosuus eläintä kohti laskettiin kullekin tahralle ja raportoitiin.

Tilastollinen analyysi.

Kaikki tiedot ilmoitetaan keskiarvona ± standardipoikkeama. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 9 Statistical Software -ohjelmistoa (GraphPad Software, San Diego, CA). Kaikissa kokeissa käytettiin 5–6 eläintä ryhmää kohden, jotka olivat peräisin vähintään kahdesta eri eläinerästä. Kontrolli- ja poly(pro-E2)-kalvoryhmien välisten erojen testaamiseksi käytettiin Studentin t-testiä (kuviot 3, 4 ja 5). Merkitys määritettiin arvoon p Pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05.

Täydentävä materiaali

Katso PubMed Centralin verkkoversiosta lisämateriaalia.

KIITOKSET

Kirjoittajat kiittävät Wenmin Laita avusta hiirileikkauksissa.

Rahoitus

Tämä työ sai tukea Craig H. Neilsen -säätiön apurahalta (apuraha 468116) ja halvaantuneiden veteraanien tutkimussäätiön apurahalta (apuraha 3171) MKG:lle ja NIH R01:ltä (apuraha NS092754) ja New Yorkin osavaltion selkäydinvamman arviointilautakunnan instituutioiden tukiapurahalle C32J245GGG5. Kaikki eläintyöt suoritettiin Ohion osavaltion yliopiston neurotieteen osaston kirurgisen ydinosan avustuksella, jota tukee NINDS Grant P30NS104177.

VIITTEET

(1). National Spinal Cord Injury Statistical Center. (2020) Selkäydinvamman tosiasiat ja luvut yhdellä silmäyksellä, Alabaman yliopisto Birminghamissa, Birmingham, AL.

(2). Cripps RA, Lee BB, Wing P, Weerts E, MacKay J ja Brown D (2011) Maailmanlaajuinen kartta traumaattisten selkäydinvaurioiden epidemiologiaan: Kohti elävää tietovarastoa vammojen ehkäisyyn. Selkäydin. 49, 493–501. [PubMed: 21102572]

(3). Donovan WH (2007) Selkäydinvamma - menneisyys, nykyisyys ja tulevaisuus. Journal of Spinal CordMedicine 30, 85–100.

(4). Pickelsimer E, Shiroma EJ ja Wilson DA (2010), osavaltion laajuinen tutkimus lääkinnällisesti hoidetuista haitallisista terveydellisistä olosuhteista selkäydinvammaisilla henkilöillä. J. Spinal Cord Med. 33 (3), 221–231. [PubMed: 20737795]

(5). Silver J ja Miller JH (2004) Regeneraatio gliaarven ulkopuolella. Nat. Rev. Neurosci. 5 (2), 146–156. [PubMed: 14735117]

(6). Varma AK, Das A, Wallace G, Barry J, Vertegel AA, Ray SK ja Banik NL (2013) Spinal Cord Injury: A Review of Current Therapy, Future Treatments and Basic Science Frontiers.Neurochem. Res. 38, 895–905. [PubMed: 23462880]

(7). Zendedel A, Mönnink F, Hassanzadeh G, Zaminy A, Ansar MM, Habib P, Slowik A, Kipp M ja Beyer C (2018) Estrogeeni heikentää paikallista tulehduksellista ilmentymistä ja aktivaatiota selkäydinvamman jälkeen. Mol. Neurobiol. 55 (2), 1364–1375. [PubMed: 28127698]

(8). Lee JY, Choi HY, Ju BG ja Yune TY (2018) Estrogeeni lievittää neuropaattista kipua selkäydinvaurion jälkeen estämällä mikrogliaa ja astrosyyttien aktivaatiota. Biochim. Biophys. Acta, Mol. Basis Dis. 1864 (7), 2472–2480. [PubMed: 29653184]

(9). Cox A, Varma A, Barry J, Vertegel A ja Banik N (2015) Nanoparticle Estrogen in Rot Spinal Cord Injury saa aikaan nopeita tulehdusta ehkäiseviä vaikutuksia plasmassa, aivo-selkäydinnesteessä ja kudoksissa.J. Neurotrauma 32 (18), 1413–1421. [PubMed: 25845398]

(10). Sribnick EA, Samantaray S, Das A, Smith J, Matzelle DD, Ray SK ja Banik NL (2010) Kroonisen selkäydinvamman jälkeinen estrogeenihoito parantaa rottien liikuntatoimintoja. J. Neurosci. Res. 88 (8), 1738–1750. [Julkaisu: 20091771]

(11). Honda K, Shimohama S, Sawada H, Kihara T, Nakamizo T, Shibasaki H ja Akaike A (2001) Nongenomic Antiapoptotic Signal Transduction by Estrogen in Cultured Cortical Neurons. J. Neurosci. Res. 64 (5), 466–475. [PubMed: 11391701]

(12). Sribnick EA, Wingrave JM, Matzelle DD, Ray SK ja Banik NL (2003) Estrogen as a neuroprotective Agent in the Treatment of Spinal Cord Injury. Ann. NY Acad. Sci. 993 125–133. [PubMed: 12853305]

For more information:1950477648nn@gmail.com