Uusi strategia aktiivisten komponenttien seulomiseksi Cistanche Tubulosassa spektrivaikutussuhdeanalyysin ja verkkofarmakologian perusteella Ⅱ

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. HPLC-sormenjäljet

3.1.1. Menetelmän validointi

HPLC-menetelmän validointi osoitti, että suhteellinen standardipoikkeama (RSD) menetelmän tarkkuudelle, toistettavuudelle ja stabiiliudelle oli alle 2,85 prosenttia suhteelliselle piikin alueelle (n = 11) ja 0,77 prosenttia. suhteelliselle retentioajalle (n = 11). Saman näyteliuoksen tarkkuus oli välillä 0.05–{{10}},77 prosenttia suhteellisella ajalla ja 0,28– 2,70 prosenttia yhteisten piikkien suhteelliselle pinta-alalle. Kokeen toistettavuus oli välillä 0.03–0,20 prosenttia suhteellisella ajalla ja 0,23–2,59 prosenttia yhteisten piikkien suhteellisella alueella. Näytteen stabiilisuus oli 0,09–0,24 prosenttia suhteellisella retentioajalla ja 0,75–2,85 prosenttia yhteisten piikkien suhteellisella alueella. Nämä tulokset osoittivat, että määritetty sormenjälki oli tyytyväinen. Geniposidiinihapon lineaariset suhteet,ekinakosidi, akteosidi, tubulosidi A, jaisoakteosidion esitetty taulukossa S4. R-neliön arvo oli 1.0000, mikä osoittaa hyvää lineaarisuutta. Näytteenoton tulokset osoittivat, että geniposidiinihapon, ekinakosidin,akteosidi, tubulosidi A, jaisoakteosidiolivat 100,37 prosenttia , 103,59 prosenttia , 98,46 prosenttia , 100,81 prosenttia ja 101,19 prosenttia , ja näytteiden talteenoton RSD oli alle 2,68 prosenttia .

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja Cistanche Active Componentsista

3.1.2. Huippualue (PA) ja suhteellinen retentioaika (RRT)

HM:n, WE:n ja HR:n vertailusormenjäljet ​​ja sormenjäljet ​​11 C. tubulosa -erästä on esitetty kuvassa 2. Yksitoista piikkiä, joilla oli hyvä erotus ja erotuskyky, tunnistettiin yhteisiksi piikeiksi HM:iden, WE:iden ja HR:ien joukossa. Viisi standardiyhdistettä tunnistettiin geniposidiinihapoksi (A2),ekinakosidi(A8),akteosidi (A9), tubulosidiA (A10) jaisoakteosidi(A11). Standardiyhdiste,ekinakosidi, joka oli läsnä kaikissa kromatogrammeissa (keskimääräinen retentioaika 12.86 min) sopivalla piikin pinta-alalla ja hyvällä stabiiliudella, valittiin vertailuhuippuksi ja sitä käytettiin laskemaan muiden kymmenen suhteelliset retentioajat (RRT) yhteiset huiput. Näiden eri muotojen RRT:t ovat välillä 0.16–1.51. Näiden yhteisten piikkien PA ja varianssikerroin (CV prosenttia ) on lueteltu taulukoissa S5–S7. Tietojen perusteella PA:n CV-prosenttiarvot eri muodoissa ovat 25,78 prosenttia –142,02 prosenttia, 23,36 prosenttia –150,38 prosenttia ja 28,91 prosenttia –112,78 prosenttia HM:ille, WE:ille ja HR:ille. Nämä tulokset paljastavat merkittäviä eroja kunkin pitoisuudessaCistanche tubulosayhdiste eri muotojen joukossa. HM:n, WE:n ja HR:n sormenjäljet ​​on esitetty kuvassa 3.

Kuva 2 HPLC-sormenjäljet ​​standardinäytteistä

3.1.3. HM:n, WE:n ja HR:n sisältö

Viisi vakioaineosaaC. tubulosamitattiin. Pääkomponenttien sisällöt on esitetty taulukossa 1. Vertailu HM:iden, WE:iden ja HR:ien välillä on esitetty taulukossa 2 ja kuvassa 4. PhG:t C. tubulosassa ovat biologisesti aktiivisia, mutta lämpöherkkiä. Veteen liukenevat lämpöherkät komponentit voidaan poistaa tehokkaasti järkevällä menetelmällä. Yleensä Cistanche herba uutetaan vedellä ja haihdutetaan sitten väkeväksi liuokseksi seuraavaa kemiallista analyysiä varten [26, 27, 30]. Uuton ja väkevöinnin jälkeen käytettiin sumutuskuivaustekniikkaa ja menetelmää muutettiin edellisestä artikkelista. Nestemäisestä höyrystä poistettiin nopeasti vesi ja sitten saatiin kasvien raaka-aineista kuivia uutteita. Tässä vaiheessa maltodekstriinin lisäämistä pidetään yleisenä kantajana dispersion parantamiseksi ja varastointiajan pidentämiseksi. Useiden valmistusprosessien kautta yrttikasvit puristettiin sitten lisäaineilla rakeiksi. Tätä apuaineiden lisäämisvaihetta ei sisällytetty kokeeseen. Yleisesti ottaen tuotantoprosessimme sisältää uuton, väkevöinnin ja suihkukuivauksen, kuten kohdassa 2.2 on kuvattu, rinnakkain kaavarakeiden valmistusprosessin kanssa. Näiden puolivalmiiden tuotteiden valmistamiseksi on noudatettava edellä mainittuja kolmea vaihetta. WE:iden muodostusmenettelyyn kuuluu väkevöinti ja suihkukuivaus, jotka aiheuttavat helposti lämpöherkkien komponenttien häviämisen, mutta HR:t saadaan HM:iden uuttamisen ja kuivaamisen jälkeen. Ihmettelemme, onko mahdollista, että aktiiviset komponentit jäävät HR:iin. Tulostemme mukaan verbaskosidin pitoisuus pieneni merkittävästi HM:istä WE:ihin ja HR:ihin (ja vastaavasti). Verbaskosidin lämpöstabiilisuutta tutkitaan tarkkailemalla piikin alueen muutoksia HPLC:llä kuumennusprosessin aikana. 4 tunnin kuumennuksen jälkeen verbaskosidista on jäljellä 41,6 prosenttia. Se osoittaa, että verbaskosidi on lämpöherkkä [31]. Isoakteosidi, tubulosidi A ja ekinakosidi WE:issä pysyivät vakaina monimutkaisten käsittelymenetelmien jälkeen. Pitkäaikaisen kuivausprosessin aikana PhG-yhdisteiden kerääntyminen väheni merkittävästi, mikä saattaa johtua näiden lämpöherkkien komponenttien lämpöhajoamisesta [32]. Muiden kohdekomponenttien osalta HR:t ja WE:t eivät eronneet merkittävästi verbaskosidia lukuun ottamatta. Ymmärrämme tästä erosta antaa meille mahdollisuuden kehittää tulevaisuudessa parempia laatustandardeja yrttijätteille ja kehittää niitä tuotteiksi.

Taulukko 1 11 C. tubulosa -erän sisältö

Taulukko 2 Pääkomponenttien (n = 11) sisällön vertailu.

,

Kuva 4 Viiden eri muodon komponentin sisällön määritys (n = 11). , ns: ei merkitsevä.

3.1.4. Sormenjälkien samankaltaisuusanalyysi

Samankaltaisuudet kolmen C. tubulosa -ryhmän välillä arvioitiin. Yrttimateriaali-vesiuutteen, yrttimateriaalin-yrttijäämän ja vesiuutteen ja yrttijäämän samankaltaisuusarvot olivat välillä 0.943–0.994, 0.847–{ {9}}.995 ja 0.938–1.000 (taulukko 3).

Taulukko 3 HM-WE:n, HM-HR:n ja WE-HR:n yhtäläisyydet 11 C. tubulosa -erälle.

3.2. Antioksidanttiaktiivisuustestin tulokset

C. tubulosan eri muotojen antioksidanttiset aktiivisuudet määritettiin käyttämällä DPPH-, ,- ja huuhtelukykymäärityksiä, ja asiaankuuluvat tulokset on esitetty kuvassa 5. Taulukossa S8 DPPH- ja huuhtelukapasiteettimäärityksen tulokset olivat { {2}}.04–37,80, 0,98–843,90 ja 0,32–27,65 mg/ml kolmelle eri muodolle 11 C. tubulosan erästä. Kolmessa antioksidanttiaktiivisuustestissä HM:t ja WE:t osoittivat läheistä estoaktiivisuutta, kun taas HR:t osoittivat heikointa estoa.

Suihkukuivattujen WE:iden havaittiin osoittavan merkittäviä aktiivisuuksia jopa alhaisilla pitoisuuksilla. Edellinen raportti osoitti, että sumutuskuivattu Vernonia amygdalina WE saavutti 50 prosentin huuhtelun eston pitoisuudella 0,17 mg/ml [33]. Pitkien uuttoaikojen ja korkeiden lämpötilojen käyttö on kaksiteräinen miekka. Toisaalta uuttoajan ja suihkukuivauksen tulolämpötilan lisääminen parantaa saantoa ja tehokkuutta. Lisäksi uutteet saavuttavat voimakkaan antioksidanttiaktiivisuuden ja korkeammat biologisten komponenttien pitoisuudet kuin kyseiset kasvit [34]. Toisaalta liian kuuma tuloilma hajottaa bioaktiivisia yhdisteitä. Tällaiset kohonneet ilman sisääntulon lämpötilat johtivat antioksidantti-Bidens pilosa -uutteen aktiivisuuden menetyksiin ja niiden katsottiin johtuvan fenoliyhdisteiden vähenemisestä [35]. Tämänhetkiset tulokset ovat yhdenmukaisia ​​edellä mainitun raportin kanssa. Esimerkiksi S6:n WE:llä oli heikompia radikaaleja estäviä kykyjä kuin sekä HM:llä että HR:llä. Lisäksi S5:n HR:llä oli vahvempi DPPH- ja superoksidianionien poistamiskyky kuin HM:llä ja WE:llä. PhG:iden rakenne koostuu glykosidisidoksista ja asetyyliryhmistä, jotka hydrolysoituvat helposti entsymaattisessa vaikutuksessa tai hajoavat korkeissa lämpötiloissa. Nämä reaktiot voivat aiheuttaa joidenkin pääkomponenttien vähenemistä laajamittaisen tuotannon aikana. Tiettyjen komponenttien hydrolyysi tai isomeroituminen saattaa kuitenkin kiihdyttää muiden komponenttien synteesiä. Tällaiset muutokset ovat yleisiä Cistanches-yrttien käsittelyssä [36–38]. PhG:iden vesiliukoisuus tarkoittaa, että useimpia biologisia komponentteja voidaan hyödyntää vesiuutolla. Väite siitä, että suurin osa aktiivisista komponenteista jää WE:iin, on jatkunut vuosikymmeniä, joten näyttää kohtuulliselta olettaa, että märät jäännösmateriaalit voidaan heittää pois uuttamisen jälkeen. On kuitenkin väärin pitää C. tubulosan HR:iä jätteenä. Tutkijat huomauttavat, että PhG:t ovat epästabiileja ja ovat herkkiä entsymaattiselle tai hydrolyyttiselle hajoamiselle [39]. Hydrolyysi- tai isomerointireaktiot, jotka myötävaikuttavat biologisten ainesosien vähenemiseen fytolääkkeissä käsittelyn aikana, voivat samalla tarjota uusia mahdollisuuksia HR:ien hyödyntämiseen. Perinteisiä uuttomenetelmiä muuttamalla lääkejäämiä voidaan kehittää ja hyödyntää tehokkaammin. Entsymaattinen hydrolyysi suoritettiin Panax-ginseng-jäännöksen muuttamiseksi monosokereiksi. Polysakkaridien ja ginsenosidien, kuten sokerin, meripihkahapon, ginsengpolysakkaridien ja ginsenosidien, saannot lisääntyivät [40]. Sophora flavescens -jäännökset uutetaan uudelleen ultraääniaaltojen avulla etyyliasetaatilla [41]. Huang et al. [42].

PLSR- ja BCA-tulosten perusteella eri muotojen viisi parasta piikkiä seulottiin käyttämällä DPPH-, superoksidianioni- ja hydroksyyliradikaalinpoistomäärityksiä tärkeimpien piikien tunnistamiseksi. Tulokset on havainnollistettu Venn-kaaviossa (kuva 7). A2, A6, A8 ja A10 ovat yhteisiä piikkejä, jotka HM, WE ja HR jakavat (kuvat 7(a) ja 7(c)) superoksidianionin ja hydroksyyliradikaalien poistomäärityksissä, kun taas HM, WE ja HR HR ei jaa DPPH-määrityksen huippuja. Sillä välin BCA-mallit osoittavat, että A1, A2, A3 ja A6 ovat HM:n, WE:n ja HR:n yhteisiä huippuja (kuvat 7(d)–7(f)). Erityisesti päällekkäisyydet Venn-kaaviossa osoittavat, että BCA-malli näyttää sopivammalta kuin PLSR-malli, jossa edellisessä on enemmän toistoa. BCA-mallin kertoimet ja antioksidanttikyvyn IC50-arvot analysoitiin RDA:n avulla. Kuten kuvassa 8 esitetyt RDA:t, A1, A3 ja A6 HM:stä ja HR:stä liittyvät positiivisesti antioksidantti-indekseihin, paitsi että A3 liittyy negatiivisesti hydroksyyliradikaalien sieppauskykyyn. WE:n A1:llä ja A6:lla on vahva korrelaatio DPPH:n ja superoksidianionin kanssa. Eri muodoista havaitut A6-huiput osoittavat vahvimman yhteyden DPPH-, superoksidi-anioniin ja hydroksyyliradikaaleihin. A1:llä ja A3:lla on myös samanlainen yhteys.

Kuva 7

Venn-kaaviot PLSR- ja BCA-mallista: (a) DPPH-määritys. (b) huuhtelumääritys. (c) poistomääritys analysoitiin PLSR-mallilla. (d) DPPH-määritys. (e) huuhtelumääritys. (f) poistomääritys analysoitiin BCA-mallilla. Päällekkäinen osa oli HM:n, WE:n ja HR:n yhteinen piikin sirpale.

3.4. Verkkofarmakologiaan perustuva analyysi

3.4.1. CT-verkon rakentaminen

GeneCards-tietokannasta ja OMIM-tietokannasta saatiin yhteensä 4359 antioksidanttiaktiivisuuteen liittyvää kohdetta. Samaan aikaan aktiiviset komponentit seulottiin TCMSP-tietokannasta ja SwissTargetPrediction-tietokannasta. Sitten kerättiin 198 kohdetta ja standardisoitiin UniPort-tietokannan kautta. Aktiivisilla komponenteilla ja antioksidantteihin liittyvillä sairauksilla oli 159 kohdegeeniä (katso kuva S1). CT-verkko rakennettiin havainnollistamaan korrelaatiota yhdisteiden ja tärkeimpien geenikohteiden välillä (kuvio 9).

Kuva 9 CT-verkko. Verkosto osoitti korrelaation aktiivisten komponenttien ja keskeisten geenikohteiden välillä.

3.4.2. PPI-verkon rakentaminen ja tärkeimpien kohteiden seulonta

PPI visualisoitiin käyttämällä STRING-tietokantaa (kuva 10). Verkko sisälsi 159 solmua ja 2528 reunaa. Koko vuorovaikutusverkostossa yhdistävät komponentit tai solmut, joissa on enemmän kohdepisteitä, voivat olla avainkomponentti tai kohdegeeni, jolla on antioksidanttirooli C. tubulosa -bakteerissa. Tulokset ladattiin ja lisättiin Cytoscapeen visualisointia varten. Mitä suurempi DC-arvo, sitä tummempi väri ja mitä suurempi yhdistetty pistemäärä, sitä paksumpi reuna. Havaitsimme, että RAC-alfa-seriini/treoniiniproteiinikinaasi (AKT1), interlukiini-6 (IL6), tuumorinekroositekijä (TNF) ja verisuonten endoteelin kasvutekijä A (VEGFA) sijaitsivat keskeisesti (kuva 11), mikä osoittaa, että ne olivat keskeisiä kohteita, kun aktiiviset komponentit vaikuttivat antioksidanttisesti. On raportoitu, että ekinakosidi vähentää mitokondrioiden toimintahäiriöitä säätelemällä mitogeeniaktivoituja proteiinikinaaseja (MAPK) ja AKT:ta ja niiden fosforyloituja muotoja [43]. Tutkijat spekuloivat, että C. tubulosan glykosidien diabetesta ehkäisevä vaikutus saattaa johtua PhG:iden antioksidanttisesta aktiivisuudesta vähentämällä proinflammatorisia sytokiinejä, kuten IL-6 ja TNF- [44]. Lisäksi ekinakosidi voi heikentää munasarjasyöpäsolujen kasvua säätelemällä alas VEGFA:n ilmentymistä angiogeneesin estämiseksi [45], mikä korreloi läheisesti ROS-järjestelmän kanssa, sillä ROS indusoi VEGF-signaloinnin ilmentymistä [46].

Kuva 10 PPI-verkko.

3.4.3. Rikastusanalyysi ja CTP-verkon perustaminen

Mahdolliset antioksidanttiyhdisteet vaikuttivat lukuisiin biologisiin toimintoihin, mukaan lukien BP, CC ja MF. Kuvassa 12(a) on esitetty 10 parasta reittiä. PPI-verkon ennustetut kohteet reagoivat pääasiassa moniin biologisiin prosesseihin, kuten orgaanisiin syklisiin yhdisteisiin, ksenobioottisiin ärsykkeisiin, epäorgaanisiin aineisiin, happitasoihin ja solukomponenttien liikkeen positiiviseen säätelyyn. Solukomponenttianalyysi osoitti, että geenit liittyivät pääasiassa kalvolautaan, solunulkoiseen matriisiin, erittyvän rakeen luumeniin, transkription säätelijäkompleksiin ja solun apikaaliseen osaan. Nämä kohteet osallistuvat myös moniin molekyylitoimintoihin, mukaan lukien DNA:ta sitova transkriptiotekijän sitoutuminen, proteiinin homodimerisaatioaktiivisuus, proteiinidomeenispesifinen sitoutuminen ja sytokiinireseptorin sitoutuminen.

Kuva 12 Rikastusanalyysi: (a) GO-rikastusanalyysi. (b) KEGG-rikastusanalyysi.

Näiden suurten keskusten biologisten toimintojen tutkimiseksi suoritettiin reitin rikastusanalyysi. KEGG-rikastustuloksista piirrettiin kuplakaavio, joka näyttää 20 parasta reittiä. Mitä suurempi kohta oli, sitä enemmän geenejä sisältyi reittiin. Kuten kuviossa 12(b) esitetään, C. tubulosan avainreitit liittyivät syövän, lipidin ja ateroskleroosin reitteihin, AGE-RAGE-signalointireittiin diabeteksen komplikaatioissa, kemialliseen karsinogeneesiin – reseptoriaktivaatioon ja MAPK-signalointireittiin. C. tubulosan vaikutuksia apoptoosiin ja solujen redox-homeostaasiin tutkittiin. Tiedot viittaavat siihen, että C. tubulosa voi olla lupaava ehdokas paksusuolen syövän vastaisessa hoidossa [47]. C. deserticola -uutetta löytyy iäkkäiltä ihmisiltä [48].

Kuvio 13 havainnollistaa polkujen ja niihin liittyvien kohteiden välistä korrelaatiota sekä suhdetta päällekkäisten kohdegeenien ja C. tubulosan biologisesti aktiivisten komponenttien välillä. CTP-verkostosta luotiin globaali näkymä, joka koostui 12 ainesosasta, 159 kohteesta ja 20 reitistä. Suurin osa kohteista jaettiin ehdokkaiden aktiivisten yhdisteiden kesken. Nämä aktiiviset kandidaattiaineet, joilla on korkea yhteenliittämisaste, olivat vastuussa CTP-verkon korkeasta yhteenliittävyydestä, erityisesti kversetiini (aste = 131). Suurin osa kohteista, kuten AKT1, IL6, TNF ja VEGFA, kartoitettiin syövän reitteihin liittyviin KEGG-reitteihin.

Kuva 13 CTP-verkko.

4. Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa tutkimme ensisijaisesti monimutkaisia ​​tilanteita, kun pohdimme HM:n, WE:n ja HR:n spektri-vaikutussuhteita.C. tubulosa. HPLC-sormenjäljet ​​jaantioksidanttitestitkäytettiin tunnistamaan erot H:iden, WE:iden ja HR:ien välilläC. tubulosa. HPLC-sormenjälkien mukaan 11 huippua oli yleisiä 11 Hs-, WE- ja HR-erässä. Geniposidiinihappo,ekinakosidi, verbascoside, tubulosidi A, jaisoakteosiditunnistettiin näiden huippujen joukosta. Näiden viiden komponentin sisällöt määritettiin. Lisäksi antioksidanttiset vaikutuksetC. tubulosaHs, WE ja HR vaihtelivat monimutkaisten valmistusolosuhteiden aiheuttamien kemiallisten koostumusten muutosten vuoksi. Monipuolisiin tilastomalleihin perustuva spektri-vaikutussuhdetutkimus osoitti, että huippu A6 saattaa olla ratkaisevin komponentti kolmestaC. tubulosa. Tutkimus perustui verkkofarmakologiaan tutkimaan mahdollisia mekanismejaC. tubulosapäälläantioksidanttiyhdisteiden seulonnan, tärkeimpien kohteiden ennustamisen, verkkojen rakentamisen ja rikastusanalyysin suorittamisen kautta. Tuloksemme tarjoavat teoreettisen perustan yrttijäämien ja niiden mahdollisuuksien kierrättämiselleC. tubulosahoidossaantioksidantteihin liittyvät sairaudet.