Uusi netriini-1-johdettu peptidi tehostaa suojaa neuronaalista kuolemaa vastaan ​​ja vähentää aivoverenvuotoa hiirillä, osa 1

Abstrakti:

On raportoitu, että Netrin{0}} osallistuu hermosolujen suojaamiseen keskushermostovaurion jälkeen. Netrinin-1 minimaalista toiminnallista aluetta, joka voi säilyttää eurosuojan mutta välttää Netrinin suuret sivuvaikutukset, on kuitenkin edelleen vaikea löytää.

Keskushermosto on yksi tärkeimmistä ihmiskehon hermostojärjestelmistä, joka ohjaa ihmisten ajattelua, tunteita ja toimintaa. Kun keskushermosto vaurioituu, myös ihmisten muisti heikkenee. Mutta älä huoli, voimme ottaa joitakin positiivisia tapoja auttaa palauttamaan muistia.

Ensinnäkin sinun on ymmärrettävä muistivaurion vaikutukset. Keskushermoston vauriot voivat vaikuttaa ihmisten kognitiivisiin kykyihin, ajatteluprosesseihin ja huomiokykyyn, jotka kaikki vaikuttavat suoraan ihmisten muistiin. Lisäksi keskushermoston vaurioituminen voi myös aiheuttaa emotionaalista epävakautta, mikä tekee ihmisistä alttiimpia paniikkiin, ahdistukseen ja masennukseen, mikä vaikuttaa muistin palautumiseen.

Vaikka keskushermoston vaurioituminen voi tuoda mukanaan joitain kielteisiä vaikutuksia, voimme toteuttaa joitain myönteisiä toimenpiteitä muistin palautumisen edistämiseksi. Ensin voimme kokeilla kognitiivista koulutusta, kuten lukemista, kirjoittamista ja pulmien ratkaisemista. Nämä toiminnot voivat stimuloida aivoja tuottamaan uusia hermosoluja ja auttaa aivoja rakentamaan uusia muistoja ja ajattelutapoja.

Toiseksi voimme edistää muistin palautumista myös fyysisellä harjoituksella. Tutkimukset ovat osoittaneet, että oikea harjoittelu voi stimuloida aivoja tuottamaan uusia hermosoluja ja hermosolujen yhteyksiä ja edistää aivojen uuden tiedon käsittelyä. Tästä syystä jotkut ihmiset keksivät yhtäkkiä hyvän idean tai ratkaisevat vaikean ongelman juosten tai kävellessä.

Lopuksi meidän on kiinnitettävä huomiota oikean ravinnonsaannin rooliin muistissa. Aivojen normaali toiminta vaatii joitain välttämättömiä ravintoaineita, kuten proteiineja, vitamiineja ja hivenaineita. Jos ruoastamme puuttuu näitä ravintoaineita, se vaikuttaa muistiin ja ajattelukykyymme. Siksi meidän tulisi valita ruokavaliostamme joitain näitä ravintoaineita sisältäviä ruokia, kuten kalaa, vähärasvaista lihaa, vihanneksia ja hedelmiä.

Lyhyesti sanottuna keskushermoston vaurioilla on tietty vaikutus ihmisten muistiin, mutta voimme edistää muistin palautumista oikeanlaisen kognitiivisen harjoittelun, fyysisen harjoittelun ja ruokavalion hallinnan avulla. Toivon, että jokainen voi kohdata elämän haasteet positiivisesti, säilyttää optimistisen asenteen ja pyrkiä terveen keskushermoston ja hyvän muistin palauttamiseen. Voidaan nähdä, että meidän on parannettava muistia, ja Cistanche voi parantaa muistia merkittävästi, koska Cistanche on perinteinen kiinalainen lääketiede, jolla on monia ainutlaatuisia vaikutuksia, joista yksi on parantaa muistia. Cistanchen teho perustuu sen sisältämiin erilaisiin vaikuttaviin ainesosiin, mukaan lukien tanniinihappo, polysakkaridit, flavonoidiglykosidit jne., jotka voivat edistää aivojen terveyttä monin tavoin.

Napsauta Know-painiketta parantaaksesi lyhytaikaista muistia

Tässä tutkimme Netrin-10s EGF3-domeenista (tähteet 407–422) peräisin olevan peptidin E1:n europrotektiivista vaikutusta. Huomasimme, että se on vuorovaikutuksessa deletoidun kolorektaalisen karsinooman (DCC) kanssa aktivoidakseen fokaalisen adheesiokinaasifosforylaation, joka osoittaa hermostoa suojaa.

Peptidin E1 antaminen kykeni parantamaan toiminnallista palautumista vähentyneen apoptoosin kautta kokeellisessa aivoverenvuotojen (ICH) hiirimallissa.

Yhteenvetona paljastamme Netrinin-1 toiminnallisen sekvenssin, joka on mukana palautumisprosessissa ICH:n jälkeen, ja tunnistamme ehdokaspeptidin ICH:n hoitoon.

Avainsanat: aivoverenvuoto; hemiini; hermosolujen suojaus; Netrin-1; peptidi.

1. Johdanto

Aivoverenvuoto (ICH) on tuhoisa aivohalvauksen alatyyppi, jolla on korkea kuolleisuus ja sairastuvuus [1–3] ja johon liittyy aivoverisuonten epänormaali repeämä [4,5].

Hematoomien kirurginen poisto on edullinen hemostaasin saavuttamiseksi ja kallonsisäisen paineen lievittämiseksi [6]. Jäljelle jääneet hemaattiset jäännökset ja veren hajoamistuotteet voivat kuitenkin edelleen edistää sekundaarista aivovauriota ICH:n jälkeen, mikä aiheuttaa hermovaurioita ja viivästyttää toiminnallista palautumista [7–9].

Siten tehokkaiden strategioiden kehittäminen sekundaarisen aivovaurion aiheuttamaan hermosoluvaurioon olisi hyödyllistä aivohalvauksen hoidossa. Netriini-1 on yksi parhaiten tutkituista proteiineista, jotka säätelevät aksonin ohjausta ja synaptogeneesiä [10–12] vuorovaikutuksessa sen reseptorien kanssa. poistettu kolorektaalisyövästä (DCC) ja UNC5H (koordinoitumaton-5 homologi) aktivoimaan solujen eloonjäämistä, erilaistumista ja lisääntymistä [13–15].

Reseptorit indusoivat kuolemasignaalin välittääkseen apoptoosia, kun Netrin{0}} puuttuu [16]. Tiedetään, että Netrin-1:n sitoutuminen DCC:hen johtaa DCC:n dimerisoitumiseen ja käynnistää fokaaliadhesionkinaasin (FAK) tyrosiini-861-fosforylaation indusoimaan neuriittien kasvua ja aksonin ohjausta [17,18].

Netrin-1:n sitoutuminen DCC:hen sisältää Netrin-1:n EGF3-domeenin ja DCC:n FN5-domeenin Netrin-1-signalointireitin aktivoinnissa [19,20]. Äskettäin Netrin-1:lla on osoitettu olevan neuroprotektiivisia vaikutuksia iskeemisillä alueilla [21].

Seerumin Netrin{0}}, joka estää solujen apoptoosia ja edistää hermosolujen regeneraatiota, ekspressiotaso korreloi positiivisesti potilaan toipumisen kanssa iskeemisestä aivohalvauksesta [22,23].

Mielenkiintoista on, että Netriiniä -1 erittävien luuytimen mesenkymaalisten kantasolujen siirto vaurioituneeseen rotan iskiashermoon käynnistää aksonien regeneraation [24] ja vähentää motoristen hermosolujen kuolemaa [25]. Netrin-1-proteiinin stereotaksinen injektio kammioihin vähentää hermosolukuolemaa subarachnoidaalisen verenvuodon jälkeen aktivoimalla DCC/APPL1/AKT-signaloinnin [26].

Polypeptidi, joka on peräisin Netrin-1:n EGF3-domeenista (aminohapot 423–433), aktivoi merkittävästi ERK:n fosforylaatiota ja edistää NO:n tuotantoa, jolla on sydäntä suojaavia vaikutuksia [27,28]. Netrin-1 on kuitenkin tunnistettu mahdolliseksi kasvainten muodostumisen biomarkkeriksi [29–31], koska Netrin-1-statuksen säätely löytyy useista kudosperäisistä syövistä [32].

Kun Netrin-1 sitoutuu DCC- tai Unc5H-reseptoriinsa, reseptorit välittävät positiivisen signaalin, joka johtaa eloonjäämiseen, tulehdukseen, angiogeneesiin ja anti-apoptoosiin, mikä puolestaan ​​säätelee kasvainten muodostumista [31].

Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa Netrinin-1 minimaalinen toiminnallinen domeeni, joka voi säilyttää hermosolujen suojauksen ja välttää Netrin-1 suurimmat sivuvaikutukset. Tässä havaitsimme, että peptidi E1 (tähteet 407–422), joka on peräisin Netrinin-1 EGF3-domeenista, on vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa suojellakseen hermosoluja hemiinin aiheuttamalta toksisuudelta.

ICH-hiirten kokeellisessa mallissa peptidin E1 käyttö paransi toiminnallista palautumista käyttäytymismäärityksillä määritettynä. Lisäksi peptidi E1 voi estää hermosoluja rappeutumasta ICH:n jälkeen.

Näiden tulosten perusteella tunnistimme Netrinin-1 funktionaalisen sekvenssin, joka osallistuu toipumiseen ICH:n jälkeen, ja päätimme, että tätä peptidiä voidaan käyttää ICH:n hoitoon.

2. Tulokset

2.1. EGF3-verkkotunnus on kriittinen Netrin-DCC-vuorovaikutukselle

Netrin-1 koostuu VI-alueesta, kolmesta EGF-toistosta ja C-terminaalisesta domeenista [33]. Ihmisen Netrin-1/DCC-kompleksin kristallirakenne paljastaa, että Netrin-1 EGF3-domeeni on ratkaiseva Netrin-1/DCC-vuorovaikutukselle, mutta ei EGF1- ja EGF2-domeenit [34].

Avainaminohappotähteiden (His407, Gln442 tai Gln443) mutageneesi EGF3-domeenissa häiritsi täysin Netrin-1/DCC-sitoutumisen [19]. EGF1/2-alueita tarvitaan houkuttelevan signaloinnin vaihtamiseksi hylkiväksi signaloinniksi, kun Unc5 on rinnakkain DCC:n kanssa [20].

Näin ollen loimme ensin täyspitkät ja EGF3-deletoidut (Netrin-1 ∆407–443) Netrin-1-konstruktit (kuva 1A) ja ekspressoimme väliaikaisesti näitä rakenteita viljellyissä HEK293T-soluissa GSTpulldownia varten. .

Sitoutumista havaittiin konstrukteille, jotka ilmensivät Netriini-1, mutta eivät Netrin-1(∆407–443) (kuva 1C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EGF3:n domeeni, joka sisältää aminohappoja 407–443, on vastuussa Netrin-1 ja DCC:n vuorovaikutuksesta. EGF3-domeenin roolin tutkimiseksi Netrin-DCC:ssä puhdistimme ensin myc-taggedNetrin{12 }} tai katkaistu Netrin-1 (∆407–443) (kuva 1B).

Seuraavaksi HEK293T-solut transfektoitiin plasmidilla, joka sisälsi DCC-cDNA:ta, ja inkuboitiin Netrin-1-proteiinin kanssa, ja sitten Netrin-1-sitoutuminen arvioitiin immunovärjäyksellä.

Havaitsimme, että täyspitkä Netrin-1, mutta ei katkaistu Netrin-1, kykeni sitoutumaan DCC:hen plasmamembraanissa (kuva 1D). Sen määrittämiseksi, voiko EGF3-domeeni olla vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa, loimme GST-EGF3-rakenteen purkamaan DCC:tä yli-ilmentäviä lysoituneita soluja. Havaitsimme DCC:n spesifisen sitoutumisen GST-EGF3:n kanssa (kuvio 1E).

Lisäksi syntetisoimme FITC-leimatun peptidinEGF3:n ja vahvistimme, että kuten täyspitkä Netrin-1, se kykeni sitoutumaan DCC:hen plasmakalvolla (kuva 1F). Yhdessä tietomme osoittavat, että EGF3-verkkotunnus on vastuussa Netrinin-1 ja DCC:n vuorovaikutuksesta.

2.2. EGF3-domeeni indusoi netriinin alavirran kulkureittien fosforylaatiota-1

Netrin-1 ja DCC:n vuorovaikutus aktivoi useita signalointireittejä, mukaan lukien FAK, SFK ja ERK [16,35]. Fokaalinen adheesion kinaasi (FAK) on yksi tärkeimmistä tyrosiinifosforylaatiotoiminnoista, jotka liittyvät Netrin-1/DCC-signalointiin.

Netriini-1 aktivoi FAK-fosforylaation ja Src-perheen proteiinityrosiinikinaasien (SFK) fosforylaation [17]. Sekä FAK- että SFK-signalointireiteillä on keskeinen rooli hermoston kehitysvaiheessa ja vamman korjaamisessa [36,37]. Lisäksi Netrin-1 voi aktivoida solunulkoisten signaalien säätelemän kinaasin-1/2 (ERK1/2), joka välittää mitogeenin aktivoiman proteinkinaasireitin (MAPK) toimintaa [38–40].

Sen tutkimiseksi, onko EGF3-domeeni kriittinen alavirran signalointireittien aktivoimiseksi Netrin-1:n sitoutumisen kautta DCC:hen, tutkimme ensin EGF3-domeenin vaikutusta FAK:n tyrosiinin 861-fosforylaatioon (kuva 2A) . Havaitsimme, että EGF3:n deleetio esti FAK-fosforylaatiota viljellyissä aivokuoren neuroneissa (kuvio 2B, C), mikä vahvistaa EGF3:n olennaisen roolin Netrin-1-signalointireitillä.

Seuraavaksi viljeltyjä aivokuoren neuroneja stimuloitiin GST-EGF3-fuusioproteiinilla 20 minuutin ajan, ja Western blot -testi vahvisti edelleen, että käsittely GST-EGF3-fuusioproteiinilla indusoi FAK-, ERK- ja SFK-fosforylaatiota (kuva 2D-G).

Nämä tulokset viittaavat siihen, että Netrin-1 EGF3-domeeni toimii potenttistimulaattorina, joka aktivoi alavirran signalointireittejä.

Kuva 1. Netrin-1 EGF3-alue on Netrin-1/DCC-vuorovaikutuksen kriittinen alue. (A) Netrin-1-konstruktien kuvat. Netrin-1-konstruktit ovat Netrin-1 täyspitkä, Netrin-1-(∆407–443) ja GST-EGF3. (B) Puhdistettu Netrin-1-(∆407–443)-Myc/His kvantifioitiin vertaamalla BSA-standardikäyrään. (C) Immunoblottaus alasvetofraktiosta GST-DCC FN5-domeenifuusioproteiinilla ja pelkällä GST:llä. (D) Immunofluoresenssikuvat Flag-DCC:tä ilmentävistä 293T-soluista, joita inkuboitiin kontrolliväliaineen, Netrin-1-myc/his:n ja Netrin-1-(∆407–443) -Myc/his:n kanssa 30 minuutin ajan, vastaavasti, ja kvantitatiivinen analyysi. Mittakaava, 10 µm. (E) Immunoblottaus alasvetofraktiosta GST-EGF3-fuusioproteiinilla ja GST:llä. (F) Immunofluoresenssikuvat Flag-DCC:tä ilmentävistä 293T-soluista, joita inkuboitiin kontrolliväliaineen ja FITC-leimatun Pep EGF3:n kanssa 30 minuuttia, vastaavasti, ja kvantitatiivinen analyysi. Mittakaava, 10 µm.

Kuva 2. EGF3-domeeni aktivoi Netrinin-1 alavirran reittejä. (A) Kokeellinen menettely. (B) Kortikaalisia hermosoluja (E17 ja DIV3) stimuloitiin Netrin-1, Netrin-1-(∆407–443) tai kontrolliväliaineella 20 minuutin ajan. Solulysaatteja inkuboitiin anti-p-FAK-861-vasta-aineen kanssa Netrin-1-aktiivisuuden varmistamiseksi. (C) Western blot -tulosten kvantitatiivinen analyysi on esitetty kohdassa (B). n=3. (D) Kortikaalisia hermosoluja (DIV3) käsiteltiin 1,5 µM GST:llä (+), 1,5 µM GST-EGF3-fuusioproteiinilla (+) tai 1,5 µMNetrin-1 (+) -väliaineella 20 minuutin ajan. Solulysaatteja inkuboitiin anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ja anti-p-ERK-202/204 kanssa. (E–G) Länsisolujen kvantitatiivinen analyysi blot-tulokset esitetään kohdassa (D). n=3. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin kaikkiin tässä kuvassa esitettyihin tilastollisiin analyyseihin (* p < 0,05, ** p < 0,01; ns, ei merkitsevä). Tietojen analyysin yksityiskohdat näkyvät lisätaulukossa S1.

2.3peptidi E1 ja E2 ovat vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa aktivoidakseen Netriinin alavirran signaalireitin-1

Kuten aiemmin on kuvattu, pieni peptidi, joka oli peräisin Netrin-1:n EGF3-domeenista (aminohapot 423–433), indusoi ERK-fosforylaation [27]. Syntetisoimme peptidit E1 (tähteet 407–422) ja E2 (tähteet 423–433), jotka olivat peräisin Netrin-1 EGF3-domeenista (kuva 3A).

Havaitsimme, että peptidin El inkubointi lisäsi fosforyloidun FAK:n ja SFK:n (kuvio 3B, D, E) tasoja viljelysoluissa annoksesta riippuvaisella tavalla, mutta ei muuttanut fosforyloidun ERK:n tasoja (kuvio 3B, F).

Toisin kuin peptidiE1, peptidi E2 ei ainoastaan ​​indusoinut FAK:n tyrosiinifosforylaatiota (kuvio 3C, G) ja SFK:n tyrosiinifosforylaatiota (kuvio 3C, H), vaan myös indusoi ERK:n tyrosiinifosforylaatiota (kuvio I) hermosoluviljelmässä corns, 3C.

Kontrollipeptidillä (Pep Ctrl) ei ollut havaittavissa olevaa vaikutusta FAK:n, SFK:n ja ERK:n tyrosiinifosforylaatioon (kuva S1). Lisäksi havaitsimme, että peptidin E1 indusoima FAK-signalointireitin komponenttien fosforylaatio oli ajasta riippuvaista (kuva). S2). Nämä tulokset osoittavat, että E1 ja E2 ovat Netrinin-1 minimaaliset toiminnalliset peptidit.

Kuva 3. EGF3-alueen minimaaliset sekvenssit aktivoivat Netrinin-1 alavirran reittejä. (A) Kuvat peptideistä. (B) Aivokuoren hermosoluja (DIV3) stimuloitiin peptidin El gradienttipitoisuuksilla. Solulysaatteja inkuboitiin anti-p-FAK-861, anti-p-SFK-418 ja anti-p-ERK-202/204 kanssa. (C) Viljeltyjä aivokuoren neuroneja käsiteltiin peptidi E2:n gradienttipitoisuuksilla.

Lysaatit kerättiin ja niitä inkuboitiin osoitettujen vasta-aineiden kanssa FAK:n, SFK:n ja ERK:n fosforylaation mittaamiseksi. (D-F) Peptidin E1 aiheuttaman FAK-, SFK- ja ERK-fosforylaation määrän kvantifiointi neuroneissa on esitetty kohdassa (B). n=3. (G-I) Peptidin E2:n aiheuttaman FAK-, SFK- ja ERK-fosforylaation laajuuden kvantifiointi on esitetty kohdassa (C). n=3. (J) DCC-villityypin ja homotsygoottimutanttebryoista peräisin olevia aivokuoren hermosoluja stimuloitiin Netriini-1- tai Netrin-1--peräisillä peptideillä ja hajotettiin.

Saaduille lysaateille tehtiin immunoblottaus. (K) FAK PY{{0}}- ja DCC-tasojen kvantifiointi DCC-mutanttihermosoluissa on esitetty kohdassa (J). n=3. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin kaikkiin tässä kuvassa esitettyihin tilastollisiin analyyseihin (* p < 0,05;ns, ei merkitsevä). Tietojen analyysin yksityiskohdat näkyvät lisätaulukossa S1.

Sen määrittämiseksi, onko FAK-signalointireitin aktivaatio DCC-riippuvainen, mittasimme näiden peptidien indusoiman FAK:n tyrosiinifosforylaation laajuuden DCC+/+- ja DCC-/--neuroneissa. Havaitsimme, että molemmat peptidit E1 ja E2 eivät onnistuneet indusoimaan FAK:n fosforylaatiota DCC-/- neuroneissa (kuvio 3J, K).

Havaitsimme myös, että syntetisoidut N-terminaalisesti Flag-merkityt peptidit E1 ja E2 (Flag-E1 ja Flag-E2) sitoutuvat suoraan DCCFN5-domeeniin (kuvio S3).

2.4. Peptidi E1 suojaa neuroneja hemiinin aiheuttamalta solukuolemalta in vitro

Osoittaaksemme suojan peptidin E1 hermosoluvauriota vastaan, käytimme Heminin indusoituvaa toksisuusreaktiota jäljittelemään sekundaarista aivovauriota aivoverenvuodon jälkeen [41,42].

Viljeltyjä GnRH:ta ekspressoivia hermosoluja (NLT) [43–45] inkuboitiin hemiinin kanssa eri pitoisuuksina ja kestoina. NLT-solujen inkubointi hemiinin kanssa keskimääräisellä tappavalla annoksella (60 uM) johti ajasta riippuvaiseen laskuun solujen eloonjäämisasteessa, mikä viittaa siihen, että hermosolut ottivat hemiinin ja metaboloituivat (kuva S4).

Sen tutkimiseksi, vastasiko Netrin{0}} ja DCC:n ilmentyminen hemiinin aiheuttamaan hermosolukuolemaan, viljeltyjä NLT-soluja inkuboitiin hemiinin kanssa eripituisia kestoja. Western blot -tulokset osoittivat, että Netrin-1 ja DCC:n ilmentymistasot nousivat merkittävästi 6 tuntia hemiinin inkubaation jälkeen ja laskivat sitten vähitellen (kuvio 4A, B).

Tutkiaksemme, pystyivätkö peptidit E1 ja E2 vaimentamaan hemiinin aiheuttamaa hermosolujen kuolemaa, suoritimme CCK-8-määrityksen Netrin-1:lla, PepCtrl:llä, peptidillä E1 ja peptidillä E2.

Havaitsimme, että näillä peptideillä ei ollut havaittavaa vaikutusta solujen elinkelpoisuuteen (kuvio 4C ja kuvio S5). Verrattuna inkubaatioon Pep Ctrl:n ja peptidiE2:n kanssa, peptidi E1 ja Netrin-1 paransivat hemiinin aiheuttamaa hermosolukuolemaa (kuva 4D). Värjäsimme myös kalseiini-AM:lla ja PI:llä erottaaksemme eläviä ja kuolleita soluja.

Tulokset osoittivat, että sekä Netrin-1 että peptidi E1 suojasivat hemiinin aiheuttamalta kuolemalta in vitro (kuvat 4E–G). Lisäksi 1,5 uM peptidi E1 lievitti hemiinin aiheuttamaa kuolemaa primaariviljeltyissä hermosoluissa (kuvio 4H, I). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittivat, että peptidi E1 suojaa neuroneja hemiinin aiheuttamalta solukuolemalta.

2.5. Netriini-1-Johdettu peptidi E1 edistää toiminnallista palautumista ICH:n jälkeen

Tutkiaksemme, onko Netrin-1:sta johdetulla peptidillä E1 tärkeä rooli epätoiminnallisessa toipumisessa verenvuotohalvauksen jälkeen, perustimme kokeellisen ICH-mallin hiiren ruiskuttamalla musteeseen sekoitettua kollagenaasia striatumiin (kuva S6A).

Kolmen päivän kuluttua aivoviipaleesta otettujen kuvien osoitettiin seuraavan injektiokohtaa ja kollageenin kehitystä musteella (kuva S6B, C). Hiirillä, joilla oli aivojuovion verenvuoto, esiintyi heikkoutta ipsilateraalisella puolella aivovaurion vuoksi (kuva S7A–C).

ICH:ta seuraavan aivojuovion hematooma oli näkyvissä verrattuna suolaliuoksen injektioon (kuva S7D). Netrin-1:n ja DCC:n suhteelliset proteiinitasot perihematomaalisessa aivokuoressa nousivat ICH-hiirissä verrattuna kontrollihiiriin päivänä 2, ja Netrin-1 oli edelleen merkittävästi korkeampi päivänä 3, mikä osoittaa, että Netrin-1 on tärkeä aivovamman toipumiselle (kuva S7E, F).

Seuraavaksi FITC-leimattu TAT-peptidi E1 (FITC-Pep TE1), joka lisäsi TAT-sekvenssin peptidin E1 N-päähän, injektoitiin ICH-hiiriin ja FITC-Pep TE1:n osoitettiin ylittävän veri-aivoesteen ( Kuva S8).

ICH- ja kontrollihiirille injektoitiin intraperitoneaalisesti peptidiä (12 mg/kg) päivittäin tai yhtä suuri määrä suolaliuosta (kuvio 5A). Havaitsimme, että antaminen peptidin TE1 kanssa paransi eloonjäämisastetta ja pelasti ruumiinpainovirheitä ICH:n jälkeen (kuvio 5B, C).

Havaitsimme myös, että kollagenaasin kehitysmäärä, joka oli jäljitetty yhtä suurella mustesuhteella kussakin ryhmässä, oli samanlainen, mikä vahvistaa, että tämä kollagenaasin standardi ICH-malli johti toistettaviin striataalisiin hematoomeihin (kuva 5D). Peptidi TE1 paransi ICH-hiirten käyttäytymispisteitä teipinpoistotestissä (kuva 5E). ) ja sylinteritesti (kuva 5F).

Kuten odotettiin, peptidi TE1 vähensi infarktin määrää ICH:n jälkeen (kuvio 5G, H). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että peptidi E1 pystyi vähentämään hematooman tilavuutta ja parantamaan toiminnallista palautumista ICH:n hiirimallissa.

Kuvio 4. Peptidi E1 parantaa hemiinin aiheuttamaa solukuolemaa in vitro. (A) Netrin-1:n ja DCC:n Western blot viljellyissä NLT-soluissa, jotka on altistettu hemiinille (60 µM). (B) Western blot -tulosten kvantitatiivinen analyysi on esitetty kohdassa (A). n=3. (C) CCK-8-määritykset osoittivat, että sarjapeptidit eivät muuttaneet solujen elinkelpoisuutta. n=4. (D) 1,5 µM Pep E1 säilytti NLT-solujen elinkelpoisuuden, kun se lisättiin hyvin hemiinille altistuksen jälkeen (60 µM). n=4. (E) Hemiinille (60 µM, 6 h) altistettujen NLT-solujen elävä (vihreä)/kuollut (punainen) määritys. Mittakaava, 50 µm. (F, G) Kvantitatiivinen analyysi elävä/kuollut määrityksestä (E). n=9. (H) CCK-8-analyysit osoittivat, että Pep E1 voi vähentää hemiinin aiheuttamaa solukuolemaa primaariviljelmän hermosoluissa. n=8.(I) Primaariviljelmän neuronien elävä/kuollut määrityskuvaus (50 µM, 6 h). Mittakaava, 50 µm. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Yksisuuntaista ANOVAa tai kaksisuuntaista ANOVAa käytettiin kaikkiin tässä kuvassa esitettyihin tilastollisiin analyyseihin (* p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ei merkitsevä). Tietojen analysoinnin yksityiskohdat näkyvät lisätaulukossa S1.

Kuva 5. Netriini-1-peräinen peptidi E1 edistää toipumisprosessia ICH:n jälkeen. (A) Kaavio TE1-peptidin intraperitoneaalisen (IP) injektion kokeellisesta paradigmasta hiirten ICH-mallinnus. (B) Kunkin ryhmän eloonjäämissuhde ICH:n jälkeen kirjattiin ja käytettiin Kaplan-Meier-menetelmää. n=10. (C) Ruumiinpaino muuttuu 5 päivää ICH:n jälkeen. n=6.(D) Kollaasi/suolaliuosseos, jossa on yhtä suuri suhde mustetta (yhteensä 0,6 µL) injektoituna C57-hiirten striatumiin, edustavat kuvat, joissa musteen pinta-ala oli samanlainen hiirillä, joita hoidettiin/ ilman peptidiä TE1 5 päivää ICH:n jälkeen. (E, F) TE1-peptidin (12 mg/kg) IP-injektio, mutta ei TAT:n (12 mg/kg) kontrolli, parannettu käyttäytyminen nauhanpoistotehtävän (E) tai kulmatehtävän (F) seurannassa.

Suolaliuos,n=10 yksittäisiä eläimiä; ICH, n=6 yksittäiset eläimet; ICH + TAT, n=6 yksittäistä eläintä; ICH + TE1, n=8 yksittäistä eläintä. (G) Edustavia hematoksyliini- ja eosiinivärjättyjä leikkeitä hiirissä, joita on käsitelty TE-peptidillä tai ilman sitä 1 5 päivää ICH:n jälkeen. Mittakaava, 1 mm. (H) Verenvuototilavuuden kvantifiointi aivoleikkeissä (G).

Suolaliuos, n {{0}} yksittäistä eläintä; ICH, n=6 yksittäiset eläimet; ICH + TAT, n=6 yksittäistä eläintä; ICH + TE1, n=8 yksittäistä eläintä. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM. Yksisuuntaista ANOVAa tai kaksisuuntaista ANOVAa käytettiin kaikkiin tässä kuvassa esitettyihin tilastollisiin analyyseihin (* p < 0.05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; ns, ei merkittävä). Tietojen analyysin yksityiskohdat näkyvät lisätaulukossa S1.

2.6. Netriini-1-johdettu peptidi E1 vähentää neuronaalista apoptoosia ICH:n jälkeen

Selvittää peptidi E1:n taustalla olevia mekanismeja ICH:n toiminnallisessa palautumisprosessissa. Havaitsimme hermosolujen rappeutumisen perihematomaalisella alueella fluoro-jade C (FJC) -värjäyksellä.

Havaitsimme, että TE1-peptidin antaminen vähensi merkittävästi FJC-positiivisten solujen lukumäärää perihematooma-alueilla, mikä osoittaa, että pep TE1 esti hermosolujen rappeutumista ICH:n jälkeen (kuvio 6A, B). Suoritimme TUNEL-värjäyksen ja havaitsimme, että TE1-peptidi vähensi merkittävästi TUNEL-positiivisten hermosolujen määrää (kuvio 6C, D).

TUNEL-positiivisten astrosyyttien määrässä ei ollut havaittavissa olevaa muutosta TE1-peptidikäsittelyn jälkeen (kuvio 6E, F). Lisäksi käyttämällä FITC-leimattua 4 kDa:n dekstraania merkkiaineena osoittamaan veri-aivoesteen (BBB) ​​läpäisevyyttä, havaitsimme, että peptidi TE1 ei vaikuttanut BBB:n läpäisevyyden palautumiseen (kuvio S9A, B).

Seerumin raakafluoresenssiyksiköiden (RFU) tasot olivat samanlaiset, mikä vahvisti injektoidun merkkiaineen läsnäolon kaikissa analysoiduissa eläimissä (kuva S9C). Käytimme myös fluoreseiinileimattua lektiiniä mikroverisuonten leimaamiseen, mutta emme havainneet parannusta TE1-hoidon jälkeen (kuva S9D, E). Ennen kaikkea nämä havainnot viittaavat siihen, että peptidi E1 edistää hermosolujen palautumista ICH:n jälkeen estämällä hermosolujen apoptoosia.

Kuva 6. Netriini-1-peräinen peptidi E1 voi suojata hermosolujen kuolemaa ja rappeutumista vastaan, mutta ei astrosyyttejä ICH:n jälkeen. (A) Edustavia fluori-jade C-värjättyjä leikkeitä hiirissä, joita on käsitelty TE1:llä tai ilman sitä 5 päivää ICH:n jälkeen. Mittakaavapalkki, 50 µm ja 10 µm, vastaavasti. (B) Fluori-jade C -positiivisten solujen kvantifiointi perihematomaalisella alueella (n=4). (C) TUNEL-värjäys, joka osoittaa TE1:n vaikutukset sekundaariseen aivovaurioon (SBI) 5 päivää ICH:n alkamisen jälkeen. Edustavia kuvia Saline-, ICH-, ICH + TAT- ja ICH + TE1-ryhmistä.

Jokainen ryhmä altistettiin ICH:lle paitsi suolaliuosryhmälle. Mittakaavapalkki, 50 µm ja 10 µm. (D) Kvantitatiiviset analyysit TUNEL-positiivisten neuronien prosenttiosuudelle on esitetty kohdassa (C). n=4. (E) TUNELin kolokalisaatio GFAP:lla 5 päivää ICH:n jälkeen. Edustavia kuvia Saline-, ICH-, ICH + TAT- ja ICH + TE1-ryhmistä. Mittakaavapalkki, 50 µm ja 10 µm, vastaavasti. (F) Kvantitatiiviset analyysit TUNEL-positiivisten astrosyyttien prosenttiosuudelle on esitetty kohdassa (E). n=4. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM.

Yksisuuntaista ANOVAa käytettiin kaikkiin tässä kuvassa esitettyihin tilastollisiin analyyseihin (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001, ei merkitsevä). Tietojen analysoinnin yksityiskohdat näkyvät lisätaulukossa S1.

3. Keskustelu

Tutkimuksemme tunnisti Netrinin-1 ydinpeptidisekvenssin, joka on ratkaisevan tärkeä ICH:n jälkeiselle toiminnalliselle palautumiselle. Vuorovaikutuksessa DCC:n kanssa tämä Netrin{1}}johdettu peptidi suojaa hermosolujen kuolemalta, joka johtuu ICH:n jälkeisestä sekundaarisesta vauriosta ja on siten lupaava hoitokeino ICH:lle.

Netrin-1, korkeamolekyylipainoisen proteiinin, terapeuttinen käyttö edellyttää Netrin-1:n minimaalisen toiminnallisen sekvenssin tunnistamista, joka edistää signaalia alavirtaan. Tutkimuksessamme tuotettiin peptidejä E1 (tähteet 407–422) ja E2 (tähteet 423–433), jotka ovat peräisin Netrinin-1 EGF3-domeenista, vastaavasti. Huomasimme, että peptidi E1 (tähteet 407–422) suojasi hermosolujen kuolemalta ICH:n jälkeen.

Havaitsimme, että Netrin{0}}- ja DCC-ilmentymistasot lisääntyivät NLT-soluissa hemiinihoidon jälkeen. Hemiiniä vapautuu hemoglobiinista ICH:n jälkeen ja se aiheuttaa sekundäärisen vaurion sekä glia- että hermosoluihin [46–48].

Lisäksi havaitsimme myös kohonneita Netrin{0}}- ja DCC-proteiinitasoja kokeellisen ICH:n jälkeen. Lisäksi havaitsimme myös kohonneita netriini-1- ja DCC-proteiinitasoja kokeellisen ICH:n jälkeen.

Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​aiempien tulosten kanssa, jotka osoittavat, että netriinillä{0}} on tärkeä rooli palautumisessa ICH:n jälkeen [49].

For more information:1950477648nn@gmail.com