13-viikkoinen 2-(l-mentoksi)etanolin subkrooninen toksisuustutkimus F344-rotilla

Johdanto

2-(1-mentoksi)etanoli (CAS-nro 38618-23-4) on kirkas ja väritön neste, jolla on ominainen haju ja jota käytetään laajalti aromiaineena. FAO:n/WHO:n yhteinen elintarvikelisäaineita käsittelevä asiantuntijakomitea (JECFA) on arvioinut 2-(l-metoksi)etanoli aromiaineena, luokitellaan mentoliin rakenteellisesti sukulaisiksi aineiksi1. Aromiaineiden rakenneluokkaan perustuen 2-(l-metoksi)etanoli määritettiin luokkaan I. Yhdysvalloissa ja Euroopassa saantimäärät 2-(l-metoksiIhmisten etanolin arvioitiin olevan 12 ug/henkilö/vrk ja 0,01 ug/henkilö/vrk, molemmat alle luokan I kynnyksen 1 800 ug/henkilö/vrk. Näiden arvioiden perusteella katsotaan, että 2-(1-mentoksi)etanoli ei välttämättä aiheuta turvallisuusongelmia rutiininomaisessa käytössä aromiaineena.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg ruumiinpainoa [BW])1. Huolimatta 2-(1-mentoksi)etanolin käytöstä aromiaineena, tämän yhdisteen toistuvan annostelun myrkyllisyydestä on saatavilla vain vähän tietoja. Laboratoriomme on tutkinut useiden elintarvikelisäaineiden myrkyllisyyttä, mukaan lukien kunkin kategorian edustavat aromiaineet, jyrsijämalleissa2–7. Selvittääksemme toksikologista profiilia ja määrittääksemme no-havaitun haittavaikutuksen tason (NOAEL) suoritimme 13-viikon subkroonisen toksisuustutkimuksen 2-(1-mentoksi)etanolille, joka oli annettuna suun kautta F344-rotille letkuruokinta.

Materiaalit ja menetelmät

Testikemikaali

2-(1-mentoksi)etanoli (erä nro 5I0002, puhtaus 99,9 %), valmistaja Takasago Int. Corp.:n (Tokio, Japani) toimitti Japanin terveys-, työ- ja hyvinvointiministeriön elintarviketurvallisuusministeriön standardien ja arvioinnin osasto Japan Flavor & Fragrance Materials Associationin (Tokio, Japani) tuella. Vaikka testiaine toimitettiin optisten isomeerien seoksena (CAS-nro 38618-23-4), valmistaja vahvisti sen l-enantiomeeriksi (CAS-nro 75443-64-0). Antoreittiksi valittiin suuletku, jossa oli maissiöljyä (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japani) vehikkeliksi 2-(1-mentoksi)etanolin veteen liukenemattomuuden ja haihtuvuuden vuoksi. 2-(1-mentoksi)etanoliliuokset valmistettiin päivittäin, juuri ennen antoa. 2 tunnin huoneenlämmössä säilytyksen jälkeen 2-(1-mentoksi)etanolin jäännössuhteet 4, 40 ja 400 mg/ml liuoksessa vahvistettiin 96,8 %, 99,8 % ja 96,5 %. vastaavasti kaasukromatografialla (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokio, Japani).

Koeeläimet

Kaiken kaikkiaan 40 uros- ja 40 naarasrottaa, spesifistä patogeenivapaata rottaa (F344/DuCrlCrlj, 5 viikkoa) ostettiin Charles River Laboratories Japanista (Yokohama, Japani) ja niitä käytettiin yhden viikon ajan sopeutumisen jälkeen. Tutkimuksen aikana eläimiä pidettiin polykarbonaattihäkeissä, joissa oli pehmeä lastuvahvike, ja niitä pidettiin huoneessa, jossa oli estejärjestelmä valo/pimeyden syklin (12 h), ilmanvaihdon (ilmanvaihtonopeus 18 kertaa/h), lämpötilan ( 24 ± 1 astetta) ja suhteellinen kosteus (55 ± 5 %). Häkit ja lastukuivaimet vaihdettiin kahdesti viikossa. Jokaisella eläimellä oli vapaa pääsy vesijohtoveteen ja perusravintoon (CRF-1; Oriental Yeast, Tokio, Japani). Kokeen alussa eläimet jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään, joissa kussakin oli 10 uros- ja naarasrottaa, perustuen ruumiinpainoon, joka mitattiin juuri ennen testikemikaalihoidon aloittamista.

Opintojen suunnittelu

Alustavassa {{0}}päivätutkimuksessa, jossa arvioitiin 2-(1-mentoksi)etanolia, jota annettiin annoksina 0, 200, 400 ja 800 mg/kg BW/ päivänä, absoluuttiset ja suhteelliset maksan painot lisääntyivät merkittävästi kaikissa hoidetuissa molempien sukupuolten ryhmissä (tietoja ei ole esitetty). Näiden tulosten perusteella valitsimme 2-(1-mentoksi)etanoliannokset 0, 15, 60 ja 250 mg/kg/vrk annettavaksi sekä uros- että naarasrotille nykyisessä {{ 13}}viikon toksisuustutkimus.

Yleistilat ja kuolleisuus arvioitiin päivittäin. Kehon painot sekä syötettävän ja jäljellä olevan ruokavalion määrät mitattiin kerran viikossa koejakson aikana. Kaikki rotat paastosivat yön yli hoidon päätyttyä, ja verinäytteet hematologiaa ja seerumin biokemiaa varten kerättiin vatsa-aortasta syvän inhalaatioanestesiassa käyttäen isofluraania. Tutkimussuunnitelma perustui Japanin elintarvikelisäaineiden nimeämiseen ja elintarvikelisäaineiden käyttöstandardien tarkistamiseen (1996), ja sen hyväksyi Japanin kansallisen terveystieteiden instituutin eläintenhoito- ja käyttökomitea.

Hematologia ja seerumin biokemia

Seuraavat hematologiset parametrit analysoitiin ProCyte Dx automaattisilla hematologisilla analysaattoreilla (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): valkosolujen määrä (WBC), punasolujen määrä (RBC), hemoglobiinipitoisuus (HGB), hematokriitti (HCT), keskimääräinen korpuskulaarinen tilavuus (MCV), keskimääräinen verisolujen hemoglobiini (MCH), keskimääräinen verisolujen hemoglobiinipitoisuus (MCHC), verihiutaleiden määrä (PLT) ja differentiaaliset leukosyyttisolut, mukaan lukien neutrofiilit (Neut), lymfosyytit (lymph), monosyytit (Mono), eosinofiilit (eosino) ja basofiilit (Baso). Oriental Yeast suoritti seerumin biokemiallisen analyysin seuraaville parametreille: kokonaisproteiini (TP), albumiini (Alb), albumiini/globuliinisuhde (A/G), kokonaisbilirubiini (Bil), glukoosi, kokonaiskolesteroli (T-Chol), triglyseridi (TG), urea typpi (BUN), kreatiniini (Cre), kalsium (Ca), epäorgaaninen fosfori (IP), natrium (Na), kalium (K), kloori (Cl), aspartaattiaminotransferaasi (AST), alaniiniaminotransferaasi (ALT), alkalinen fosfataasi (ALP) ja -glutamyylitranspeptidaasi (-GTP).

Elinten painot ja histopatologinen arviointi

Kaikille eläimille suoritettiin täydellinen ruumiinavaus, ja aivot, kateenkorva, keuhkot, sydän, perna, maksa, lisämunuaiset, munuaiset, kivekset ja munasarjat punnittiin. Nämä elimet sekä selkäytimen, kolmoishermon, aivolisäkkeen, nenäontelon, sylkirauhasten, kielen, ruokatorven, henkitorven, aortan, kilpirauhasen, lisäkilpirauhasen, haiman, mahalaukun, ohutsuolen ja suoliliepeen, submandibulaarisen ja suoliliepeen kudokset imusolmukkeet, emätin, kohtu, virtsarakko, eturauhanen, siemenrakkulat, lisäkives, reisiluu ja rintalastan luuytimeineen, nikamat, luustolihakset, iskiashermo, iho ja rintarauhanen kiinnitettiin 10 % neutraalisti puskuroituun formaliiniin; sitten valmistettiin parafiiniin upotetut leikkeet ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histopatologista tutkimusta varten. Kivekset ja silmät Harderian rauhasilla kiinnitettiin Bouinin kiinnitysaineeseen ja Davidsonin liuokseen, vastaavasti. Luukudokset, mukaan lukien nenäontelo, nikamat, rintalastan ja reisiluun kalkki, poistettiin käyttämällä seosta, jossa oli 10 % muurahaishappoa ja 10 % puskuroitua formaliinia enintään 2 viikon ajan. Histopatologinen arviointi suoritettiin kaikille kudoksille, jotka oli saatu kontrolliryhmän eläimistä, ja ryhmälle annettiin suurin annos, ellei mitään hoitoon liittyviä vaurioita havaittu.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA IMMUUNITEETTA PARANTAAN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Immunohistokemia 2u-globuliinille

Urosrotilla 2u-globuliinin kertymistä munuaisiin tutkittiin immunohistokemiallisella analyysillä parafiiniin upotetuista leikkeistä. Antigeenin hakemista varten leikkeitä, jotka oli saatu 5 rotalta kussakin ryhmässä, inkuboitiin proteinaasi K:n (DAKO, Glostrup, Tanska) kanssa 1 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Kaikki leikkeet upotettiin 3-prosenttiseen H202/metanoliliuokseen 10 minuutiksi huoneenlämpötilassa endogeenisen peroksidaasiaktiivisuuden inaktivoimiseksi. Sen jälkeen kun epäspesifiset reaktiot oli estetty 10 % normaalilla kanin seerumilla, leikkeitä inkuboitiin 2uglobuliinin primaarisen vasta-aineen kanssa (laimennettu 1:400; anti-rotta 2u-globuliinivasta-aine; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) yön yli 4 asteessa 8. Vasta-aineen sitoutumisen visualisointi suoritettiin käyttämällä VectaStain Elite ABC Kit -sarjaa (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) ja 3,3'-diaminobentsidiiniä. Kaikki leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä.

Tilastollinen analyysi

Ruumiinpainon data-arvojen vaihtelut koejakson aikana, samoin kuin hematologia, seerumin biokemia ja elinten painot, arvioitiin homogeenisuuden suhteen käyttämällä Bartlettin testiä. Homogeenisille ja heterogeenisille tiedoille käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä ja vastaavasti Kruskal-Wallis-testiä. Tilastollisesti merkitsevien erojen määrittämisessä käytettiin Dunnettin moninkertaista vertailutestiä vertailu- ja hoitoryhmien vertaamiseen. Histopatologisten ilmaantuvuuden ja asteiden vertailut analysoitiin käyttämällä Fisherin tarkkaa todennäköisyystestiä ja Mann-Whitneyn U-testiä, vastaavasti. P-arvot<0.05 were considered statistically significant.

Tulokset

Elämänaikaiset parametrit, hematologia ja seerumin biokemia

Merkittäviä kliinisiä oireita ei havaittu koko koejakson aikana, ja kaikki eläimet selvisivät suunniteltuun ruumiinavaukseen asti. Lisäksi ei havaittu merkittäviä eroja ruumiinpainossa ja päivittäisessä ravinnonsaannissa uros- ja naarasrotilla (kuvio 1A ja B).

Hematologiset ja seerumin biokemialliset tiedot on esitetty taulukoissa 1 ja 2, vastaavasti. Hematologiset analyysit paljastivat merkittävästi vähentyneen HGB:n, HCT:n, MCV:n ja MCH:n ja lisääntyneen PLT:n urosrotilla, joille annettiin 250 mg/kg BW/päivä 2-(1-mentoksi)etanolia (taulukko 1). Seerumin biokemiassa havaittiin merkittäviä TP:n, T-Cholin ja Ca:n nousuja ja Bilin ja ALP:n laskuja 250 mg/kg:n ryhmän miehillä (taulukko 2). Merkittävä Cre-arvon nousu ja A/G:n lasku havaittiin miehillä ryhmissä 60 ja 250 mg/kg. Naisilla Ca-pitoisuuden merkittävä nousu ja ALP-arvon lasku todettiin 60 ja 250 mg/kg ryhmissä, kun taas kohonnut T-Chol ja vähentynyt A/G, Bil, TG, AST ja ALT havaittiin 250 mg:n ryhmissä. /kg ryhmä. Vaikka miehillä, joille annettiin 60 mg/kg, havaittiin merkittävä TG:n nousu ja Cl:n lasku, annossuhteen puuttuminen viittasi siihen, että nämä erot eivät liittyneet altistumiseen testiaineelle.

Elinten painot

Tiedot elinten painoista on koottu taulukkoon 3. Maksan absoluuttiset ja suhteelliset painot lisääntyivät merkittävästi molemmilla sukupuolilla 250 mg/kg:n ryhmässä (taulukko 3). Merkittävä lisääntyminen maksan suhteellisissa painoissa havaittiin miehillä 60 mg/kg:n ryhmässä. Miehillä munuaisten absoluuttinen ja suhteellinen paino kasvoivat merkittävästi ryhmissä 60 ja 250 mg/kg. Miesten 250 mg/kg:n ryhmässä havaittiin merkittävää lisäystä lisämunuaisten absoluuttisessa ja suhteellisessa painossa sekä pernan ja kivesten suhteellisissa painoissa.

Histopatologia ja immunohistokemia

Histopatologisten ja immunohistokemiallisten löydösten tiedot on koottu taulukoihin 4 ja 5, vastaavasti. Histopatologiset löydökset paljastivat, että eosinofiilisten rakeiden (kuvat 2A–D), basofiilisten tubulusten ja hyaliinikipujen kertymisen sekä munuaisten fokaalisen interstitiaalisen tulehduksen esiintymistiheys lisääntyi merkittävästi miehistä koostuvissa hoitoryhmissä verrattuna kontrolliin verrattuna. ryhmä (taulukko 4). Immunohistokemiallisten analyysien perusteella testiaineella käsitellyillä urosrotilla 2u-globuliinin immunoreaktiivisuus lisääntyi proksimaalisten tubulusten epiteelisoluissa, mikä osoittaa selkeän annosriippuvuuden (kuvio 2E–H) (taulukko 5).

Ruumiinavauksessa yksi urosrotta 250 mg/kg ryhmässä osoitti oikean munuaisen vakavan laajentumisen histologisesti ominaisen nefroblastooman vuoksi. Vaikka nefroblastooma on harvinainen useimmissa rottakannoissa9, tätä tapausta pidettiin satunnaisena, koska millään muilla eläimillä ei esiintynyt samanlaisia ​​vaurioita. Lisäksi suun kautta annetuissa karsinogeenisuustutkimuksissa spontaanin nefroblastooman ilmaantuvuuden urospuolisilla F344/DuCrlCrlj-rotilla raportoitiin vaihtelevan välillä 0–2,0 %10. Vaikka useita vaurioita havaittiin satunnaisesti muissa elimissä, merkittäviä hoidosta riippuvia muutoksia ei havaittu näiden leesioiden esiintyvuudessa.

Keskustelu

Tähän mennessä JECFA on arvioinut 24 aromiainetta, mukaan lukien 2-(1-mentoksi)etanoli, rakenteellisesti mentoliin liittyviksi aineiksi, ja kaikki on luokiteltu "ei turvallisuusriskiä" nykyisillä arvioiduilla tasoilla. saanti1, 11. 2-(1-Mentoksi)etanoli luokitellaan alisyklisten alkoholien tai eetterien alaryhmään, ja sen katsotaan olevan pääasiallisesti konjugoitunut glukuronihapon kanssa, minkä jälkeen se erittyy virtsaan1. Vaikka näiden aineiden oraaliset LD50-arvot jyrsijöillä ovat suhteellisen korkeat, tiedot toistuvien annosten toksisuustutkimuksista ovat edelleen rajallisia. 13-Viikko toistuvan annoksen toksisuustutkimus on paljastanut, että mentyylipyrrolidonikarboksylaatti (CAS-nro 68127-22-0), rakenteellisesti mentolille sukua oleva yhdiste, voi liittyä maksan ja munuaisten suhteellisen painon nousuun miehillä ja naisilla. Wistar-rotat. 2u-globuliinin kertymistä urosrottien proksimaalisiin tubuluksiin havaittiin myös annoksella 1 111 mg/kg BW/vrk, ja NOAEL määritettiin arvoksi 109 mg/kg BW/vrk1.

Tässä 13-viikon 2-(1-mentoksi)etanolin subkroonisessa toksisuustutkimuksessa ei havaittu toksikologisia muutoksia yleiskunnossa, ruumiinpainossa ja ravinnonsaannissa. Hematologisen arvioinnin jälkeen havaitsimme HGB:n laskun (96,6 % kontrollin keskiarvoihin), HCT:n (96,3 %), MCV:n (98,4 %) ja MCH:n (98,2 %) sekä PLT:n nousun (111 %) miehillä. 250 mg/kg ryhmässä, joiden katsottiin olevan 2-(1-mentoksi)etanolikäsittelyn toksikologisia vaikutuksia. Sekä absoluuttinen (115 % molemmilla sukupuolilla) että suhteellinen (119 % miehillä ja 111 % naisilla) maksan paino kasvoi merkittävästi molemmilla sukupuolilla 250 mg/kg ryhmissä. Vaikka maksassa ei esiintynyt histopatologisia muutoksia, seerumin T-Chol (110 % miehillä ja 121 % naisilla) ja TP (105 % miehillä) ja TG:n aleneminen (naisilla 60,1 %) 250-vuotiailla. mg/kg-ryhmät osoittavat toksisia muutoksia, jotka liittyvät lipidimetaboliaan ja proteiinisynteesiin maksassa. Vähentynyt HGB ja MCH sekä kohonnut PLT, T-Chol ja TP miehillä ja alentunut TG sekä lisääntynyt absoluuttinen ja suhteellinen maksan paino molemmilla sukupuolilla, joilla oli tilastollista merkitystä 28-päivän alustavassa tutkimuksessa (tietoja ei esitetty ), mikä vahvistaa, että nämä muuttuneet hematologiset ja seerumin biokemialliset parametrit sekä maksan painot eivät olleet satunnaisia ​​vaan testiaineeseen liittyviä vaikutuksia. Sitä vastoin tässä tutkimuksessa miesten 60 mg/kg:n ryhmässä havaittuun maksan suhteellisten painojen merkittävään nousuun ei liittynyt absoluuttisten painojen nousua tai muutoksia asiaan liittyvissä biokemiallisissa parametreissa, mikä viittaa siihen, että tämä nousu oli mukautuva muutos.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Merkittävästi lisääntyneiden lisämunuaisten absoluuttisten (120 %) ja suhteellisten (118 %) painojen katsottiin liittyvän testikemikaaliin miespuolisessa 250 mg/kg:n ryhmässä. Lisäksi lisämunuaisten absoluuttiset ja suhteelliset painot molemmilla sukupuolilla osoittivat selkeän annosriippuvuuden 28-päivän alustavassa tutkimuksessa (tietoja ei näytetä), mikä osoittaa yhteyden testikemikaalikäsittelyyn. Vaikka lisämunuaisen liikakasvu saattoi johtua stressistä, stressiin viittaavia löydöksiä, kuten vähentynyttä painonnousua tai kateenkorvan ja muiden lymfoidisten elinten surkastumista, ei havaittu sekä tässä että alustavissa tutkimuksissa. Koska lisämunuaisessa ei välttämättä ole histopatologisia muutoksia edes glukokortikoidituotannon heikentyessä tapauksissa, joissa steroidogeneesiin liittyviä entsyymejä estetään12, mahdollisuutta, että lisämunuaisen painon kasvu on toksinen löydös, ei voida sulkea pois. Sitä vastoin pernan ja kivesten suhteellisten painojen nousua 250 mg/kg:n urosryhmässä, jota ei havaittu alustavassa tutkimuksessa, pidettiin toksikologisesti merkityksettömänä histopatologisten leesioiden puuttumisen tai merkittävästi lisääntyneiden absoluuttisten painojen vuoksi. Samoin seerumin biokemia paljasti A/G:n laskun ja Ca:n nousun molemmilla sukupuolilla, millä ei katsottu olevan toksikologista merkitystä, koska asiaan liittyvissä parametreissa ei havaittu poikkeavuuksia. Lisäksi laskeneet Bil- ja ALP-tasot molemmilla sukupuolilla ja alentuneet AST- ja ALT-arvot naisilla olivat toisin kuin odotetut toksiset vaikutukset, eikä niitä pidetty merkityksellisinä.

Krooninen nefropatia, jolle oli tunnusomaista basofiiliset tubulukset, hyaliinikipsi ja fokaalinen interstitiaalinen tulehdus, havaittiin tilastollisesti merkitsevästi kaikkien hoidettujen ryhmien miehillä. Lisäksi lisääntyneet seerumin Cre ja absoluuttiset ja suhteelliset munuaisten painot havaittiin miesryhmissä 60 ja 250 mg/kg; näitä muutoksia ei havaittu naisten hoitoryhmissä. Näissä tapauksissa eosinofiilisten rakeiden kertymisaste proksimaalisiin tubulaarisiin epiteelisoluihin lisääntyi näennäisesti annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä rakeet vahvistettiin 2u-globuliiniksi immunohistokemialla, mikä osoitti 2u-globuliininefropatian esiintymistä. Tiettyihin kemikaaleihin, kuten d-limoneeniin, sitoutuneet 2u-globuliinit kerääntyvät lysosomeihin ja niitä havaitaan proksimaalisissa tubuluksissa eosinofiilisinä tai hyaliinirakeina9. Tämä kerääntyminen voi vaurioittaa epiteelisoluja, mikä johtaa krooniseen etenevään nefropatiaan ja sen seurauksena kasvaimen muodostumiseen9. Näin ollen, vaikka 2-(1-mentoksi)etanolin NOAEL-arvoa, joka liittyy 2u-globuliininefropatiaan urosrottien munuaisissa, ei tunnistettu, tämäntyyppisen nefropatian kerrotaan olevan spesifinen urosrotille eikä siten ole merkityksellinen ihmiselle. riskinarviointi13. 2u-globuliinin kertymiseen liittyvien mekanismien välittämä lisääntynyt munuaisten vajaatoiminnan riski on erittäin epätodennäköistä, koska tämä proteiini puuttuu ihmisistä14. Tästä syystä katsottiin järkeväksi jättää miehillä havaitut krooniseen nefropatiaan liittyvät muutokset pois NOAEL-arvon määrittämisestä.

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä 13-viikon subkrooninen toksisuustutkimus osoitti, että 250 mg/kg BW/vrk 2-(1-mentoksi)etanolihoito aiheutti toksisia muutoksia hematologiassa, seerumin biokemiassa ja elinten painossa. uros- ja naarasrotilla F344. Havaittujen tulosten perusteella 2-(1-mentoksi)etanolin NOAELarvioitiin 60 mg/kg BW/vrk molemmille sukupuolille.

LUONNOLLINEN CISTANCHE TUBULOSA SEKSUAALISTEN TOIMINTOJEN PARANTAMISEEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%