Zerumbone, Zingiber Officinale Roscoen trooppinen inkivääriseskviterpeeni, heikentää -MSH-indusoitua melanogeneesiä B16F10-soluissa, osa 1

Abstrakti:Zerumbone (ZER), Zingiberaceae-perheen aktiivinen ainesosa, on osoitettu osoittavan useita biologisia aktiivisuuksia, kuten anti-inflammatorisia, antiallergisia, antimikrobisia ja syöpää estäviä; sen melanogeenisiä ominaisuuksia ei kuitenkaan ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että ZER ja Zingiber ovat virallisia (ZO) uutteita, jotka heikentävät merkittävästi melaniinin kertymistä melanosyyttejä stimuloivan hormonin (-MSH) stimuloimissa hiiren melanogeenisissa B16F10-soluissa. Lisäksi selvittääksemme molekyylimekanismia, jolla ZER estää melaniinin kertymistä, analysoimme melanogeneesiin liittyvän transkriptiotekijän, mikroftalmiaan liittyvän transkriptiotekijän (MITF) ja sen kohdegeenien, kuten tyrosinaasin, tyrosinaasille liittyvän proteiinin 1 ( TYRP1) ja tyrosinaasiin liittyvä proteiini 2 (TYRP2) B16F10-soluissa, joita -MSH stimuloi. Tässä havaitsimme, että ZER estää melanogeenisten geenien MITF-välitteisen ilmentymisen -MSH-stimulaation jälkeen. Lisäksi soluissa, joita oli käsitelty erilaisilla zerumbonin ja ZO:n pitoisuuksilla, havaittiin lisääntynyttä solunulkoisen signaalin säätelemän kinaasien 1 ja 2 (ERK1/2) fosforylaatiota, jotka ovat mukana MITF:n hajoamismekanismissa. ERK1/2:n farmakologinen esto U0126:lla kumosi riittävästi ZER:n anti-melanogeenisen vaikutuksen, mikä viittaa siihen, että ERK1/2:n lisääntynyt fosforylaatio vaaditaan sen anti-melanogeenisen aktiivisuuden vuoksi. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että ZER- ja ZO-uutteita voidaan käyttää aktiivisina ainesosina ihoa valkaisussa kosmetiikassa niiden melanogeenisen vaikutuksen vuoksi.

Asiaankuuluvien tutkimusten mukaan kista on yleinen yrtti, joka tunnetaan nimellä "ihmeyrtti, joka pidentää elämää". Sen pääkomponentti oncistanosidi, jolla on erilaisia ​​vaikutuksia, kutenantioksidantti,tulehdusta ehkäiseväja immuunijärjestelmän toiminnan edistäminen. Mekanismi välilläcistanchejaihon valkaisuunpiilee cistanchen antioksidanttisessa vaikutuksessaglykosidit. Ihmisen ihossa oleva melaniini muodostuu tyrosiinin hapettumisesta, jota katalysoityrosinaasi, ja hapetusreaktio vaatii hapen osallistumista, joten kehon happivapaista radikaaleista tulee tärkeä melaniinin tuotantoon vaikuttava tekijä. Cistanche sisältää cistanosidia, joka on antioksidantti ja voi vähentää vapaiden radikaalien muodostumista kehossa, jotenestää melaniinin tuotantoa.

Napsauta Kuinka käyttää Cistanchea

Lisätietoja:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Avainsanat:zerumbone; Zingiber officinal Roscoe; melanogeneesi; MITF; ERK1/2

1. Esittely

Melanogeneesiä, epidermaalisten melanosyyttien melaniinin tuotantoa, stimuloi -melanosyyttejä stimuloiva hormoni (-MSH), joka erittyy keratinosyyteistä altistuessaan ultraviolettisäteilylle (UV) [1,2]. Kantasolutekijä (SCF) on toinen melanogeeninen tekijä, joka säätelee tiukasti melanosyyttien migraatiota, proliferaatiota ja erilaistumista synnytyksen jälkeisen ihon melanogeneesin ylläpitämiseksi [3]. Mikroftalmiaan liittyvä transkriptiotekijä (MITF), joka on melanogeeninen transkriptiotekijä, aktivoituu cAMP-PKA-CREB:n (syklinen adenosiinimonofosfaatti-proteiinikinaasi A-cAMP-vasteelementtiä sitova proteiini) signaalireitin kautta, kun -MSH-stimulaatiota tapahtuu melanokortiini 1 -reseptorin kautta. (MC1R) epidermaalisten melanosyyttien sytoplasmisissa kalvoissa [4]. Useiden kemikaalien, kuten forskoliinin ja IBMX:n (3-isobutyyli-1-metyyliksantiini), tiedetään aktivoivan cAMP-PKA-CREB-signalointireittiä, mikä johtaa melanogeneesin induktioon [5]. Useat tutkimukset ovat paljastaneet, että solunulkoisten säädeltyjen kinaasien 1 ja 2 (ERK1/2) jatkuva aktivaatio, joka osallistuu onkogeneesin molekyylimekanismiin, edistää MITF:n fosforylaatiota Ser73:ssa ja sen myöhempää hajoamista ubikvitiiniriippuvaisen proteolyysin kautta [6,7 ]. Itse asiassa U0126:n, selektiivisen ERK1/2-reitin estäjän, on raportoitu lisäävän MITF:n ilmentymistä ja tyrosinaasin aktiivisuutta, mikä johtaa melaniinin tuotantoon [6]. Stabiloitu ja aktivoitu MITF lisää melanogeenisten geenien, kuten tyrosinaasin, tyrosinaaseihin liittyvän proteiinin 1 (TYRP1) ja tyrosinaasiin liittyvän proteiinin 2 (TYRP2) ilmentymistä. Tyrosiinin muuttumista 3,4-dihydroksifenyylialaniiniksi (L-DOPA), joka on melanogeneesin alkuvaihe, katalysoi tyrosinaasi. Tyrosinaaseihin liittyvät proteiinit (TRP:t) katalysoivat lisähapetus- ja tautomerointireaktioita [8]. Melaniinin synteesin jälkeen kypsä melaniini kuljetetaan epidermaalisista melanosyyteistä peruskeratinosyyttien sytoplasmaan solujen suojaamiseksi UV-säteilyltä [2].

Epänormaalisti lisääntynyt melanogeneesi aiheuttaa monenlaisia ​​ihosairauksia, kuten ihosyöpää, kloasmaa ja pisamia [4]; näin ollen pienet molekyylit tai luonnontuotteet, jotka kohdistuvat joko tyrosinaasin katalyyttiseen aktiivisuuteen tai melanogeneesin signalointireittien säätelijöihin, mukaan lukien ERK1/2, tai melanogeenisten geenien MITF-välitteinen transkriptio, on tunnistettu kosmeettisessa valmistuksessa hyödynnettäviksi aktiivisiksi ainesosiksi. ala. Useita pieniä molekyylejä, kuten kojiinihappoa, arbutiinia ja niasiiniamidia, käytetään laajalti kosmeettisina ainesosina niiden melanogeenisten vaikutusten vuoksi. Raportit ovat kuitenkin osoittaneet, että kojiinihappo aiheuttaa genotoksisen vaikutuksensa vuoksi useita sivuvaikutuksia, mukaan lukien sytotoksisuus, dermatiitti, ihosyöpä ja hepatosellulaarinen karsinooma [9]. Vaikka karhunmarjakasvista eristettyä arbutiinia on käytetty hyperpigmentaatiohäiriön hoitoon, viime aikoina sen käyttöä kosmeettisena ainesosana on rajoitettu sen useiden sivuvaikutusten vuoksi [9]. Niasiiniamidilla on raportoitu olevan anti-melanogeeninen aktiivisuus, ja tämä aktiivisuus toteutetaan estämällä melanosomin siirtymistä melanosyyteistä ympäröiviin keratinosyytteihin [10]. Siten sitä on yleisesti käytetty ihoa valkaisevana yhdisteenä kosmetiikkateollisuudessa. Vakiintuneiden ihonvalkaisuaineiden, joilla on useita sivuvaikutuksia, rajoitusten voittamiseksi on tärkeää kehittää turvallisia ihonvalkaisuaineita, jotka on johdettu luonnollisista lähteistä. Esimerkiksi -tujaplisiini, linderanolidi B, 4-butyyliresorsinoli ja plumbagiini on tunnistettu antimelanogeenisiksi yhdisteiksi niiden tyrosinaasia estävän vaikutuksensa vuoksi [4,11]. Nobiletiinilla, withaferiini A:lla, sesamolilla ja kaetosiinilla on anti-melanogeenisiä ominaisuuksia moduloimalla signalointivälituotteita melanogeneesireitillä [11].

Zerumbone (ZER) on luonnontuote, joka on eristetty Zingiberaceae-heimoon kuuluvien kasvien, kuten Zingiber zerumbet Smith ja Zingiber officinal Roscoe [12], haihtuvista eteerisistä öljyistä. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ZER:llä on laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia, mukaan lukien antimikrobiset, antioksidanttiset, diabeteksen, syövän, tulehduksen, allergian ja angiogeneesin vastaiset vaikutukset [12]. Mielenkiintoista on, että ZER:n on osoitettu suojaavan ultravioletti A:n (UVA) aiheuttamilta oksidatiivisilta vaurioilta ihon keratinosyyteissä, koska se pystyy poistamaan reaktiivisia happilajeja (ROS) ydintekijä-E:n aktivoinnin kautta {{8} }liittyvä tekijä-2 (Nrf2) [1,13]. Tämä viittaa siihen, että ZER:ää voidaan käyttää toiminnallisena lisäaineena ihonhoitokosmetiikassa. ZER-toiminnan melanogeenisten ominaisuuksien yksityiskohtainen mekanismi on kuitenkin vielä tutkimatta.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin ZER- ja Zingiber officinal (ZO) -uutteen estäviä vaikutuksia -MSH-stimuloituun melanogeneesiin ja niiden taustalla olevia mekanismeja. Tässä osoitamme, että ZER vaimentaa merkittävästi -MSH-indusoitua melanogeneesiä säätelemällä ERK1/2:n fosforylaatiota ja inhiboimalla melanogeenisten geenien MITF-välitteistä ilmentymistä.

2. Tulokset

2.1. Zerumbone (ZER) estää -MSH:n aiheuttamaa melanogeneesiä hiiren B16F10 melanoomasoluissa

Zerumbonin (ZER) anti-melanogeenisen vaikutuksen tutkimiseksi arvioimme aluksi sen sytotoksisuutta sekä B16F10- että HaCaT-soluissa. ZER:n kemiallinen rakenne on esitetty kuvassa 1A. Havaittiin, että ZER pitoisuuksilla yli 20 uM osoitti voimakasta sytotoksista vaikutusta, kun taas alle 20 uM ZER ei osoittanut sytotoksisuutta molemmissa solulinjoissa (kuvio 1B). Seuraavaksi tutkimme ZER:n estäviä vaikutuksia melanosyyttejä stimuloivan hormonin (-MSH) indusoimaan melaniinin kertymiseen ja erittymiseen B16F10-soluissa. ZER:n osoitettiin tukahduttavan voimakkaasti -MSH:n aiheuttamaa melaniinin solunsisäistä kertymistä ja sen erittymistä viljelyalustaan ​​(kuvio 1C, D). Lisäksi havaitsimme, että ZER vaimentaa melanogeneesiä tehokkaammin kuin 1 mM arbutiini tai 0,2 mM kojiinihappo, ihoa valkaisevan kosmetiikan tunnetut aktiiviset ainesosat (kuva 1D). Selvittääksemme, onko ZER riittävä tukahduttamaan melanogeneesiä ihmissoluissa, käytimme melaniinia tuottavia ihmisen G361-melanoomasoluja. Kuten kuviosta 1E esitetään, ZER vähentää merkittävästi kantasolutekijän (SCF) indusoimaa solunulkoista ja intrasellulaarista melaniinipitoisuutta. Nämä tulokset vahvistavat ZER:n melanogeenisen aktiivisuuden melanogeenisissa hiiren B16F10- ja ihmisen G361-soluissa.

2.2. Zerumboni estää melanogeneesitranskriptiotekijän, MITF:n ja sen kohdegeenien geeniekspressiota ihmisen G361-melanoomasoluissa 

Endoteliinin-1 ja SCF-signaloinnin on raportoitu olevan olennainen rooli ihmisen melanosyyttien ja useiden melanooman alatyyppien melanogeneesissä [3,14–16]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ZER estää melanogeneesiä melanogeenisten ärsykkeiden, -MSH:n ja SCF:n, vaikutuksesta hiiren B16F10- ja ihmisen G361-melanoomasoluissa (kuvio 1).

Näin ollen mittasimme muutoksia melanogeneesiin liittyvien geenien ja proteiinien ilmentymistasoissa SCF-stimulaation jälkeen ihmisen G361-melanoomasoluissa. Huomasimme, että ZER vaimentaa SCF-indusoitua MITF- ja tyrosinaasiproteiinin ilmentymistä 2–4 tuntia ja 24–48 tuntia SCF-stimulaation jälkeen (kuva 2A). Lisäksi melanogeneesiin liittyvien geenien, kuten MITF:n, tyrosinaasin ja tyrosinaasiin liittyvän proteiinin 1 (TYRP1) geeniekspressio suppressoitiin ZER-käsitellyissä G361-soluissa (kuvio 2B, C). Nämä tulokset paljastivat melanogeneesiin liittyvien geenien ilmentymisen huippuajan SCF-stimulaation jälkeen; maksimaalinen MITF-mRNA-induktio havaittiin 1–2 tunnin sisällä, ja tyrosinaasin ja TYRP1:n mRNA-tasojen havaittiin saavuttavan maksiminsa 24–48 tuntia SCF-stimulaation jälkeen.

2.3. Zerumboni estää melanogeenisten geenien ja entsyymien ilmentymisen hiiren B16F10-soluissa

Tutkiaksemme molekyylimekanismia, jolla ZER suppressoi melanogeneesiä, mittasimme melanogeneesin transkriptiotekijän, MITF:n, ja sen kohdegeenien, kuten tyrosinaasiin liittyvän proteiinin 1:n (TYRP1), tyrosinaasin ja tyrosinaasiin liittyvän proteiinin 2:n (TYRP2) geeniekspressiota. ZER:n puuttuessa tai läsnä ollessa. Koska melanogeneesiin liittyvien geenien ilmentymisen huippuaika SCF- ja -MSH-stimulaatiolla tiedetään ihmisen G361- (kuva 2) ja hiiren B16F10-melanoomasoluille [4], vastaavasti, mittasimme edelleen MITF:n, tyrosinaasin, TYRP1:n ja TYRP2:n ilmentymistä. ZER-käsitellyissä hiiren B16F10-melanoomasoluissa 2 tunnin tai 48 tunnin -MSH:n kanssa inkuboinnin jälkeen. Kuvio 3A osoittaa, että ZER on riittävä heikentämään -MSH-indusoitua MITF-, TYRP1-, TYRP2- ja tyrosinaasin ilmentymistä B16F10-soluissa. Samoin MITF-, tyrosinaasi- ja TYRP2-proteiinin ilmentymistasot laskivat ZER-hoidon aikana. Proteiinikinaasi A:n (PKA) välittämä CREB:n fosforylaatio on tärkeä signalointireitti, joka lisää MITF:ää transkription tasolla -MSH-stimulaation yhteydessä [4]. Siten tässä analysoimme, voisiko ZER:n vähentynyt fosforylaatio välittää MITF:n tukahduttamista. Havaitsimme, että ZER-käsittely ei vaikuttanut -MSH-indusoituun CREB-fosforylaatioon, mikä viittaa siihen, että ZER vaimentaa -MSH-indusoitua MITF-ilmentymistä riippumatta PKA-CREB-signalointireitin akselista (kuvio 3B). Koska tyrosinaasi on nopeutta rajoittava entsyymi, joka säätelee melaniinin synteesiä [2,4,11], analysoimme edelleen solunsisäisiä tyrosinaasiproteiinitasoja ja sen entsymaattista aktiivisuutta arbutiini-, kojiinihappo- ja ZER-käsittelyssä. Kuvio 3C osoittaa, että ZER vähentää riittävästi -MSH:n aiheuttamia tyrosinaasiproteiinitasoja B16F10-soluissa. Lisäksi kuva 3D paljastaa, että 10 µM ZER estää L-DOPA:n hapettumista tehokkaammin kuin tyrosinaasin estäjät, arbutiini ja kojiinihappo, mikä viittaa siihen, että L-DOPA:n hapettuminen dopakinoniksi tyrosinaasin entsymaattisen aktiivisuuden kautta estyy ZER-käsitellyissä soluissa. . Nämä tulokset osoittavat, että ZER heikentää -MSH-välitteistä melanogeneesiä suppressoimalla MITF:n, melanogeneesiin liittyvän transkriptiotekijän, ja sen kohdegeenien geeniekspressiota.

2.4. Zerumbonen melanogeeninen vaikutus johtuu ERK1/2:n fosforylaatiosta

Kasvutekijöiden tai melanogeenisten ärsykkeiden aiheuttaman proteiinikinaasi B:n (AKT) ja solunulkoisten signaalisäädeltyjen kinaasien (ERK1/2) aktivoitumisen tiedetään tukahduttavan melanogeneesiä MITF:n ja sen kohdegeenien vähentyneen ilmentymisen kautta [11]. MITF:n fosforylaatio Ser73:ssa ja Ser409:ssä vasteena ERK1/2-signalointireitille edistää sen proteasomista riippuvaa hajoamista [17,18]. Siksi tutkimme, sääteleekö ZER ERK1/2-fosforylaatiota B16F10-hiiren ja G361-ihmisen melanoomasoluissa. ERK1/2:n (p-ERK1/2) mutta ei kokonais-ERK1/2:n (T-ERK1/2) lisääntynyt fosforylaatio havaittiin ZER-hoidossa ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4A, B). Mielenkiintoista on, että ERK1/2:n fosforylaation havaittiin lisääntyneen nopeasti 10–30 minuutin ja 1–2 tunnin kuluessa ZER-hoidon jälkeen hiiren B16F10- ja ihmisen G361-melanoomasoluissa (kuva 4A). AKT:n ja MEK:n fosforylaatiota ei kuitenkaan havaittu ZER-hoidon aikana, mikä viittaa siihen, että ZER:n aiheuttama ERK1/2-fosforylaatio voi tukahduttaa MITF:n (kuvio 4B). Koska ERK1/2-fosforylaatio edistää MITF:n fosforylaatiota ja proteasomaalista hajoamista [17,18], tutkimme, estääkö proteasomi-inhibiittori MITF:n pelkistystä ZER:llä. ZER:n aiheuttamaa MITF:n suppressiota ei havaittu MG132:n läsnä ollessa, mikä vahvistaa, että ZER vähentää MITF:n ilmentymistä proteasomaalisen hajoamisen kautta (kuvio 4C). Seuraavaksi tutkimme, fosforyloiko ZER MITF:ää Ser73:ssa, joka on ERK1/2:n kohdejäännös. Fosforyloidun MITF:n havaitsemiseksi solut altistettiin -MSH:lle ja MG132:lle. Tässä havaitsimme, että ZER lisäsi merkittävästi fosforyloitua MITF:ää (Ser73) -MSH:n ja MG132:n läsnä ollessa (kuva 4D). U0126, selektiivinen mitogeenin aktivoiman proteiinikinaasin (MAPK) estäjä [19], poisti ZER-indusoidun MITF-fosforylaation (kuvio 4D). Lisäksi ZER ja U0126 eivät muuttaneet MITF-proteiinin kokonaistasoja kokosolulysaateissa (WCL) MG132:n läsnä ollessa (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittavat, että ERK1/2-välitteinen MITF:n (Ser73) fosforylaatio ja proteasomaalinen hajoaminen on kriittinen mekanismi ZER-välitteisessä MITF:n suppressiossa. Lisäksi kuvio 4E osoittaa, että U0126 palautti merkittävästi alentuneet MITF-proteiinitasot ZER-käsitellyissä soluissa. U0126 palautti johdonmukaisesti ZER:n alentaman solunsisäisen melaniinipitoisuuden noin 40 prosenttiin (kuvio 4F), mikä viittaa siihen, että ERK1/2:n aktivointi vaaditaan ZER:n melanogeenisen vaikutuksen kannalta.

2.5. Zingiber Offificinale (ZO) -uutteiden melanogeeninen vaikutus

ZER on fytokemikaali, joka on johdettu useista Zingiberaceae-heimon kasvilajeista, kuten Zingiber zerumbet ja Zingiber officinal [12]. Näin ollen alun perin mittasimme solujen elinkelpoisuuden ZO-uutteen puuttuessa tai läsnä ollessa B16F10- ja HaCaT-soluissa. Kuvio 5A osoittaa, että solujen elinkelpoisuus ei muuttunut ZO-uutekäsittelyllä. Analysoimme edelleen Zingiber officinal (ZO) -uutteen melanogeenisiä vaikutuksia. Koska ZER vähensi MITF:n ja sen melanogeenisten kohdegeenien ilmentymistä aktivoidun ERK1/2-signalointireitin kautta (kuvat 2 ja 3), tarkistimme, estääkö ZO-uute -MSH:n indusoimaa MITF:ää ja sen melanogeenisten kohdeproteiinien ilmentymistä B16F10-soluissa. Samalla tavalla kuin ZER:n melanogeeninen vaikutus, ZO-uute vähensi merkittävästi -MSH:n aiheuttamaa MITF:ää, tyrosinaasia ja TYRP2:ta annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio 5B). Mielenkiintoista kyllä, ERK1/2-fosforylaatio lisääntyi myös ZO-uutteella käsitellyissä soluissa (kuvio 5B). MITF:n ja sen kohdegeenien, kuten tyrosinaasin, TYRP1:n ja TYRP2:n, ilmentyminen väheni merkittävästi 5 µg/µl ZO-uutekäsittelyn jälkeen (kuvio 5C). Lisäksi sekä solunulkoinen että solunsisäinen melaniinipitoisuus pieneni merkittävästi noin 40 prosenttiin 5 µg/µl:lla ZO-uutekäsittelyllä (kuvio 5D). Lisäksi havaittiin vähentynyt tyrosinaasiaktiivisuus soluissa, joita käsiteltiin ZO-uutteella (kuvio 5E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että Zingiber officinal (ZO) -uute suppressoi melanogeneesiä heikentämällä MITF-välitteistä melanogeenistä geeniekspressiota.

Lisätietoja: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501