Koko transkriptioanalyysi tutkiakseen heikentyneet immunologiset ominaisuudet kriittisesti sairailla iäkkäillä potilailla, joilla on sepsis

Abstrakti

Tausta

Sepsis on yleinen komplikaatio kriittisesti sairailla potilailla, se on erittäin heterogeeninen ja siihen liittyy korkea sairastuvuus ja kuolleisuus etenkin vanhuksilla. RNA-sekvensoinnin (RNA-Seq) käyttöä biologisten reittien analysointiin käytetään laajalti kliinisissä ja molekyyligeneettisissä tutkimuksissa, mutta iäkkäillä sepsispotilailla tehdyt tutkimukset puuttuvat edelleen. Siksi tutkimme kuolleisuuden kannalta merkittäviä biologisia piirteitä ja transkriptomisia piirteitä iäkkäillä potilailla, jotka joutuivat tehohoitoyksikölle (ICU) sepsiksen vuoksi.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

menetelmät

Otimme mukaan 37 vanhempaa potilasta, joilla oli sepsis Taichung Veterans General Hospitalin teho-osastolta. Päivänä 1 ja päivänä 8 kerättiin kliinisiä ja laboratoriotietoja sekä verinäytteitä RNA-Seq-analyysiä varten. Tunnistamme dynaamisesti ekspressoituneiden geenien dynaamisen transkription ja rikastetut reitit päivän 8 ja päivän 1 välillä DVID-rikastusanalyysin ja geenisarjan rikastusanalyysin avulla. Sitten T-soluvalikoiman monimuotoisuus analysoitiin MiXCR:llä.

Tulokset

Kaiken kaikkiaan 37 potilaalla oli sepsis, ja vasteen saaneet ja reagoimattomat ryhmiteltiin pääkomponenttianalyysin avulla. Merkittävästi korkeammat SOFA-pisteet päivänä 7, pidempiä hengityspäiviä, tehohoitojakson pituuksia ja sairaalakuolleisuutta havaittiin ei-vasteryhmässä kuin vastaajaryhmässä. Päivänä 8 iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla oli sepsis, synnynnäiseen immuniteettiin ja tulehdukseen liittyvät geenit, kuten ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 ja PCSK9, säädeltiin ylösalaisin. Erilaisesti ekspressoituneet geenit (DEG:t) rikastuivat transkription, adaptiivisen immuunivasteen, immunoglobuliinin tuotannon, transkription negatiivisen säätelyn ja immuunivasteen säätelyssä. Lisäksi T-solureseptorien vaihtelu oli suurempi päivänä-8 vastausryhmässä kuin päivänä-1, mikä osoittaa, että heillä oli paremmin säädelty toipuminen sepsisestä verrattuna potilaisiin, jotka eivät reagoineet. .

Johtopäätös

Sepsis-kuolleisuus ja ilmaantuvuus olivat korkeat vanhuksilla. Tunnistamme kuolleisuuden kannalta merkitykselliset biologiset ominaisuudet ja transkriptomiset piirteet RNA-Seq-tietoihin perustuvilla toiminnallisilla polku- ja MiXCR-analyyseillä; ja havaitsi, että vastaajaryhmällä oli lisääntynyt synnynnäinen immuniteetti ja lisääntynyt T-solujen monimuotoisuus; verrattuna ei-vastaajien ryhmään. RNA-Seq voi tarjota lisätietoa hoidon tulosten tarkkaa ja varhaista ennustamista varten.

cistanche-kasveja lisäävä immuunijärjestelmä

Avainsanat

Sepsis, RNA-Seq, iäkäs teho-osastopotilas, eri tavalla ilmentyvät geenit, T-solureseptori

Johdanto

Sepsis on kliininen oireyhtymä, joka voi olla hengenvaarallinen. Sitä tuottaa epäjärjestynyt isännän vaste infektioon, ja se on erittäin heterogeeninen ja tappava maailmanlaajuinen terveysuhka, erityisesti ikääntyneelle väestölle [1, 2]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että iäkkäillä potilailla on suurempi riski saada sepsis ja heillä on suurempi sairauden vakavuus kuin yleisväestöllä [3]. Iäkkäiden potilaiden määrä, jotka joutuvat teho-osastolle sepsiksen vuoksi, on kasvanut tasaisesti viimeisen kahden vuosikymmenen aikana, koska iäkkäiden henkilöiden määrä on jatkuvasti lisääntynyt [4]. Huolimatta korkeasta hoidon intensiteetistä, kuolleisuus on edelleen korkea teho-osastolle otettujen iäkkäiden potilaiden kohdalla, mutta tutkimuksia, jotka käsittelevät biologisia reaktioita hoitovasteeseen iäkkäillä potilailla, joilla on sepsis, puuttuu edelleen [5]. Vanhusten immuunijärjestelmä käy läpi lukuisia biologisia muutoksia heidän ikääntyessään, mikä vaikuttaa ikääntyneiden immuunivasteeseen, mikä johtaa suurempaan todennäköisyyteen immuunivajautumiseen [6]. Heikentynyttä adaptiivista immuniteettia pidetään vanhusten immunosensenssin ratkaisevana piirteenä [7, 8], mutta iäkkäiden sepsiksen aikana esiintyviä transkriptomisia piirteitä ei ole tutkittu. Nämä muutokset eivät määrää ainoastaan ​​alttiutta bakteeri-infektioille, vaan myös sepsiksen etenemistä ja kliiniset tulokset [6]. Siksi on tärkeää tutkia teho-osastolle otettujen iäkkäiden potilaiden vaihtelevia immunologisia vasteita ja kuolleisuuden kannalta merkittäviä biologisia piirteitä [9, 10].

Sepsis on erittäin heterogeeninen ja sille on tunnusomaista monimutkaiset ja dynaamiset immunologiset reaktiot, joihin liittyy aluksi liiallinen tulehdusvaste, jota seuraa säätelemätön/lopentunut adaptiivinen immuniteetti [11]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet muuttuneen adaptiivisen immuniteetin sepsiksen jälkeen; niin sanottu immunohalvaus näyttää olevan yksi tärkeimmistä immunologisista piirteistä, jotka johtavat jatkuvaan heikentyneeseen immuniteettiin sepsispotilailla [12]. RNA-Seqiä käytettiin aiemmissa tutkimuksissa transkriptomisen allekirjoituksen tai "subendotyypin" löytämiseksi potilailla, joilla on sepsis. Sepsikseen liittyvät alagenotyypit ovat elinten toimintahäiriön varhainen paraneminen sepsiksen jälkeen, heikentynyt adaptiivinen immuniteetti immuunipuutteellisilla potilailla ja herkkyys steroideille septisen shokin potilailla [13, 14]. RNA-Seq-dataa hyödyntäen on äskettäin kehitetty analyyttisiä työkaluja, kuten MiXCR, mittaamaan T-solureseptorien (TCR:iden) monimuotoisuutta [15, 16]. Tässä tutkimuksessa tutkimme septisten potilaiden dynaamista transkriptiota tutkimalla parinäytteitä päivästä 1 ja päivästä 8 ja havaitsimme, että immuunipuutteisilla septisilla potilailla oli vähentynyt T-solujen monimuotoisuus ja heikentynyt T-solujen toiminta. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli tutkia kuolleisuuden kannalta merkittäviä biologisia piirteitä ja transkriptomisia piirteitä, jotta saataisiin parempi käsitys adaptiiviseen immuniteettiin liittyvästä signaloinnista iäkkäillä potilailla, jotka joutuivat teho-osastolle sepsiksen vuoksi.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materiaalit ja menetelmät Tutkimuksen suunnittelu ja tiedonkeruu

Tutkimuksen hyväksyi TCVGH:n Institutional Review Board (IRB nro CE20069B), ja kaikilta osallistujilta saatiin tietoinen suostumus. Kolmekymmentäseitsemän iäkästä tehohoitopotilasta rekrytoitiin Taichung Veterans General Hospitalista (TCVGH) joulukuusta 2018 tammikuuhun 2022. Ilmoittautumisen yhteydessä kerättiin demografisia tietoja ja otettiin lähtötason verinäytteitä päivänä 1 ja päivänä 8. transkription avulla kerättiin kaksi 4 ml:n alikvoottia verta steriileihin EDTA-vacutainereihin ja siirrettiin välittömästi RNAasittomiin pulloihin, jotka sisälsivät 10,5 ml RNAlater®:a (TermoFisher, Waltham, MA, USA).

RNA:n uutto ja sekvensointi

Tässä tutkimuksessa erotimme RNA:ta PAXgene Blood RNA Kit -pakkauksella, ja keskimääräinen RNA:n eheysluku (RIN) oli 8,31±0,58. Kirjastoa rakennettaessa noudatettiin valmistajan ohjeita ja myöhemmissä kokeissa käytettiin 1,000 ng fragmentoitunutta RNA:ta. 150-bp paired-end -lukuja käytettiin RNA-Seq:lle NovaSeq-alustalla (Illumina, Inc., San Diego, CA, Yhdysvallat), ja jokaisessa näytteessä oli vähintään 50–60 miljoonaa lukua. RNA-seq-tietojoukko talletettiin National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus -järjestelmään (GEO) talletusnumerolla GSE216902. Aineistoa käytettiin solujen mittasuhteiden ja reittien analysointiin.

Jaksottaisen elinten vajaatoiminnan arvioinnin (SOFA) pisteet

SOFA-pistemäärä on sepsikseen liittyvän elinten vajaatoiminnan numeerinen arvo, eli se ilmaisee vaurioituneiden elinten lukumäärän ja vakavuuden. Jokainen pistemäärä vaihtelee välillä 0 - 4, ja korkeampi pistemäärä viittaa elinten toimintahäiriön pahenemiseen [17]. Käytimme SOFA-pisteiden dynaamista muutosta määrittämään vastaajat (R) ja vastaamattomat (NR), ja osallistuja luokiteltiin NR:ksi, jos SOFA-pisteiden lasku päivästä 1 päivään 7 oli alle 2 [13, 18, 19] .

RNA-Seq-tietojen bioinformatiset analyysit 

Sekvensointi oli korkealaatuista, käytettiin Phred-pisteitä 30, ja HISAT2 kartoitti sekvenssilukemat referenssigenomiin (GRCh38/hg38) [20]. R-pakettia DEseq2 [21] käytettiin tunnistamaan differentiaalisesti ekspressoituneet geenit (DEG), ja lukumäärät laskettiin käyttämällä featureCountsia [22]. Keskimääräinen kartoitusnopeus ja lukumäärät olivat 87,6±4,8 % ja 65,5±17,6 miljoonaa lukua. Profiler [23] R-pakettia käytettiin genomien (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) ja geeniontologian (GO, http://geneontology.org) pohjalta toiminnallisen rikastamisen ja polkuanalyysin suorittamiseen. /) tietokannat. Korjatun p-arvon, joka oli alle 0,05, katsottiin olevan merkittävästi rikastunut. Kaikki differentiaalisesti ekspressoituneet geenit merkittiin toiminnallisesti käyttämällä Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) -analyysiä [24], ja luotiin Cytoscape 3.9.0 [25] -visualisoitu rikastuskartta. Visualisoimme GSEA-tuloksia käyttämällä rikastuskarttaa, joka järjestää geenijoukot samankaltaisuusverkostoon. Solmu, linkki ja solmun väri edustavat geenisarjaa, jäsengeenien päällekkäisyyttä ja rikastuspisteitä [24].

TCR-analyysien monimuotoisuus

RNA-Seq-tietoja käytettiin MiXCR v3:ssa.0.13 [15, 16] sepsispotilaiden klonotyyppien kvantifiointiin perustuen aiemmin raportoituun protokollaan [14]. VDJTools v 1.2.1 [26] -ohjelmistoa käytettiin komplementaarisuuden määrittävän alueen -3 (CDR3) ja näytteiden monimuotoisuuden laskemiseen kvantitatiivisten klonotyyppien hankinnan jälkeen.

Tilastolliset analyysit

Tarkastimme normaaliuden Kolmogorov–Smirnov-testillä ja havaitsimme, että useiden muuttujien, mukaan lukien hengityslaitepäivä, tehohoitojakson pituus ja sairaalahoidon kesto, jakautuminen oli vasemmalle vino. Datan esittämiseksi yhtenäisessä muodossa esitimme kategoristen muuttujien taajuudet (prosenttiosuudet) kategorisille muuttujille ja jatkuville muuttujille mediaanina (kvartiiliväli, IQR). Näiden kahden ryhmän väliset erot analysoitiin Mann–Whitney U -testillä jatkuville muuttujille ja Fisherin täsmälliselle testille kategorisille muuttujille. Merkitsevyystasoksi asetettiin 0.05, ja tilastolliset analyysit olivat kaksipuolisia. Kaikkien data-analyysien suorittamiseen käytettiin R-versiota 4.1.0.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Tulokset Potilaan ominaisuudet ja SOFA-pisteet

Tähän tutkimukseen otettiin mukaan 37 iäkästä potilasta, joilla oli sepsis [mediaani-ikä 83 vuotta (IQR: 79–87 vuotta)] (taulukko 1). Pääkomponenttianalyysissä havaitsimme, että ero päivän -1 ja päivän-8 välillä oli parempi reagoivilla potilailla (vasteryhmä, R) kuin ei-vastepotilailla (ei-vasteryhmä, NR). osoittaa säädeltyä toipumista sepsiksestä immunokompetenttiryhmässä (Lisätiedosto 1: Kuva S1). Kaiken kaikkiaan 37 potilaan joukossa oli 23 reagoivaa potilasta (vasteryhmä, R), joiden mediaani-ikä oli 82 vuotta (IQR: 79,5–86,5 vuotta) ja 14 reagoimatonta potilasta (ei-vasteryhmä, NR). mediaani-ikä 84 vuotta (IQR: 79–88 vuotta). Taulukossa 1 on esitetty tutkimusryhmän perusominaisuudet. Hoidossa havaittiin korkeampi albumiini (mediaani 3,3 mg/dl, IQR: 3–3,7 mg/dl) ja pienempi C-reaktiivinen proteiini (mediaani 9,16 mg/dl, IQR: 3,9–17,5 mg/dl) kuin vastaavissa. Reagoimattomalla ryhmällä oli merkittävästi korkeammat SOFA-pisteet päivänä 7, pidempiä hengityshoitopäiviä, pidemmät tehohoitojaksot ja korkeampi sairaalakuolleisuus verrattuna hoitoon reagoineeseen ryhmään.

Selkeä dynaaminen transkripti iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla on sepsis

Kuten kuvassa 1A havainnollistetaan, käyttämällä pääkomponenttianalyysiä 500 suurimmasta vaihtelevasta geenistä kaikista näytteistä, havaitsimme, että tehohoitoyksikön iäkkäillä sepsispotilailla oli merkittävästi erilaiset transkriptiot päivänä 1 ja päivänä 8. Differentiaaliset ilmentymisgeenit ( DEG) tunnistettiin sitten vertaamalla geeniekspressioprofiileja päivän 8 ja päivän 1 välillä iäkkäillä tehohoitopotilailla käyttämällä p-kriteereitä.<0.01 and log fold change>0.25 tai<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

Dynaamisen transkriptin DAVID-rikastusanalyysi

Havainnollistaaksemme biologisten reittien muutosta iäkkäillä tehohoitopotilailla 8. ja 1. päivän välillä esitimme rikastetun reitin käyttämällä online-DAVID v6.8 -palvelinta. Kuten kuvassa 2 on esitetty, geeniontologian (GO) kuplakaaviot rakennettiin tietojoukon 20 parhaan DEG:n biologisille prosesseille. Havaitsimme, että iäkkäiden tehohoitopotilaiden, joilla oli sepsis, DEG:t rikastuivat transkription, adaptiivisen immuunivasteen, immunoglobuliinin tuotannon, transkription negatiivisen säätelyn ja immuunivasteen säätelyssä. DAVIDin toiminnallinen GO-analyysi on esitetty kuvassa 3. Verrattuna verrokkeihin, geenien koodaamien proteiinien toiminnalliset annotaatiot DEG:issä osoittivat merkittävästi (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

Taulukko 1 Sepsispotilaiden iäkkäiden teho-osastopotilaiden ominaisuudet

Kuva 1 Transkriptomin pääkomponenttianalyysi A ja tulivuorikaavio B päivän{1}} ja päivän-8 välillä

Kuva 2 Differentiaalisesti ekspressoituneiden geenien toiminnalliset ja polkurikastusanalyysit DAVIDin kanssa kuplakaavion avulla

Kuva 3 DAVID-funktionaalinen geeniontologia (GO) -analyysi biologisesta prosessista (BP), solukomponentista (CC) ja molekyylitoiminnasta (MF)

TCR-analyysit MiXCR:llä iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla on sepsis

Ottaen huomioon, että R- ja NR-ryhmät toipuivat sepsisestä spesifisen T-solureseptorin signalointireitin kautta, käyttämällä ainutlaatuisten CDR3:n, D50:n ja käänteisen Simpson-indeksin määrää, käytimme MiXCR:ää T-solureseptorin (TCR) monimuotoisuuden määrittämiseen. ) (Kuvat 5A–C). Päivänä 8 R-ryhmän CDR3-, D50- ja käänteinen Simpson-indeksi olivat merkittävästi korkeammat kuin päivänä 1. Lisäksi D50-indeksi oli merkittävästi korkeampi R-ryhmässä kuin NR-ryhmässä päivänä 8 (kuvio 5B). Lopuksi arvioimme ainutlaatuisen CDR3:n monimuotoisuuden käyttämällä käänteistä Simpson-indeksiä, joka heijastaa runsaasti klonotyyppejä. Havaitsimme samanlaisen kuvion, jossa TCR:n monimuotoisuus lisääntyi merkittävästi R-ryhmässä, erityisesti päivänä 8 (kuvio 5C).

Keskustelu

Tämä tutkimus osoittaa, että kuolleisuuden kannalta merkitykselliset biologiset ominaisuudet ja adaptiivinen immuniteettiin liittyvä signalointi transkriptomiikkaa käyttämällä, vertaamalla päivän 1 ja päivän 8 välisiä eroja (lisätiedosto 1: kuva S1), voivat luotettavasti tunnistaa iäkkäät tehohoitopotilaat, joilla on sepsis ja erottaa reagoimattomat potilaat. . Aiemmat tutkimukset, joissa tutkittiin sepsiksen biomarkkereita, riippuivat tunnettujen biologisten toimintojen ja polkujen valinnasta tietoon perustuvilla menetelmillä [28], ja vain pieni osa tutkimuksista on kohdistettu suoraan geeneihin, joiden toimintoja ei ole täysin kuvattu [29]. Tässä tutkimuksessa otettiin käyttöön RNA-Seq tunnistaaksemme biologisia ja immunologisia piirteitä iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla on sepsis pääkomponenttianalyysin, differentiaalisen geeniekspressioanalyysin ja MiXCR:n avulla. Synnynnäinen immuniteetti ja tulehdus, kuten ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 ja PCSK9, lisääntyivät iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla oli sepsis. ZDHHC19 on palmitoyylitransferaasi ja välittää RRAS:n palmitoylaatiota, mikä lisää solujen elinkelpoisuutta [30]. Genominlaajuinen geeniekspressioanalyysi on yhdistetty lisääntyneeseen ilmentymiseen tehohoitopotilailla, joilla on ulosteen peritoniitin aiheuttama sepsis [31]. HDC (histidiinidekarboksylaasi, HDC) on ryhmän II dekarboksylaasiperheen jäsen ja muodostaa homodimeerin, joka käyttää pyridoksaalifosfaattia L-histidiinin muuntamiseen histamiiniksi. Eläintutkimus, jonka tekivät Hattori et al. [32] käytti HDC-geenin knockout (HDC−/−) hiiriä. Kun sepsis indusoitiin umpisuolen ligaatiolla ja puhkaisulla (CLP), HDC-poistohiirillä havaittiin alentuneita plasman histamiinitasoja, ja TNF-, IL-1b-, IL-6- ja MCP1-tasojen nousu sepsiksessä heikkeni, kun plasmasta puuttui histamiini [32]. Sepsiksen aiheuttama epänormaali sytokiinituotanto ja useiden elinten vauriot (keuhkot, maksa ja munuaiset) vähenivät merkittävästi HDC-poistohiirillä verrattuna WT C57BL/6 J -hiiriin. HDC:n ilmentymisen esto esti tulehduksellisen kudosvaurion ja paransi eloonjäämistä hiirillä, joilla oli CLP:n aiheuttama sepsis [32]. Lisäksi histamiini voi edistää proinflammatoristen sytokiinien tuotantoa, joita säätelee transkriptiotekijä NF‐κB. CLP-indusoidussa sepsiksessä HDC-knockout-hiirillä oli merkittävästi vähentynyt NF‐κB-aktiivisuus tumassa verrattuna WT-hiiriin [32]. Tämä tulos osoittaa, että histamiini indusoi proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien synteesiä lisäämällä NF-kB-aktiivisuutta.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että ALOX15 ja FCER1A ovat ratkaisevia bakteerisepsiksen patogeneesissä [33, 34]. ALOX15, lipidejä peroksidoiva entsyymi, on toiminnallinen lipoksygenaasi (LOX) geeni [35], joka hapettaa monityydyttymättömiä rasvahappoja ja on liitetty useisiin fysiologisiin prosesseihin sekä hermostoa rappeutuvien, tulehdus- ja hyperproliferatiivisten sairauksien patogeneesiin [35, 36]. ALOX15 ja sen metaboliitit ovat osallisena useiden tulehdussairauksien, kuten sepsiksen, niveltulehduksen, astman, kystisen fibroosin ja ateroskleroosin, patofysiologiassa [36]. FCER1A (IgE-reseptorin Ia Fc-fragmentti, FCER1A), immuunijärjestelmään liittyvä proteiini, on allergisten reaktioiden alkutekijä ja sillä on rooli allergisessa tulehduksessa [37, 38]. Aiemmissa tutkimuksissa FCER1A on osallisena aineenvaihduntaprosessien ja immuunijärjestelmän säätelyssä. [38, 39]. Lisäksi astmaa esiintyy todennäköisemmin, kun FCER1B ja muut immunoglobuliiniin liittyvät tulehdusgeenit ovat vuorovaikutuksessa [39]. Lisäksi PCSK9 (proteiinikonvertaasi subtilisiini/keksiinityyppi- 9, PCSK9) on tunnistettu plasman LDL-kolesterolitasojen keskeiseksi säätelijäksi sen kyvyn perusteella sitoutua LDL-reseptoriin (LDLR) ja laukaista se lysosomaalista hajoamista varten soluissa. , mikä johtaa LDLR:n hajoamiseen ja LDL-kolesterolitason nousuun [40].

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Tässä tutkimuksessa käytimme KEGG-rikastamista ja GO:ta näiden geenien toiminnallisen annotaation määrittämiseksi tutkiaksemme ekspressoituneiden DEG:iden osallistumista iäkkäiltä tehohoitopotilailta, joilla oli sepsis BP:ssä, MF:ssä ja FH:n molekyylipoluissa. Nämä DEG:t rikastuivat ensisijaisesti transkription, adaptiivisen immuunivasteen, immunoglobuliinituotannon, transkription negatiivisen säätelyn ja immuunivasteen säätelyssä (kuvio 2). Rakensimme toiminnallisesti järjestetyn GO/polkutermien verkoston käyttämällä Cytoscape-laajennusta ClueGO/CluePedia, biologisten termien parannettua tulkintaa. Tämä lisäosa auttoi meitä myös visualisoimaan verkot, jotka on toiminnallisesti ryhmitelty suuremmista geeniklustereista [41]. Käytimme ClueGO-laajennusta tunnistaaksemme differentiaalisesti säädellyt molekyylireitit ja niiden merkittävät geenivuorovaikutukset p-arvojen ja kappa-tilastojen perusteella saadaksemme kattavan kuvan sepsikseen liittyvistä DEG:istä. Lisäksi DEG:t rikastuivat merkittävästi transkriptioaktiivisuudessa ja proteiinisitoutumisessa, kun GO:sta peräisin oleva MF analysoitiin (kuvio 3). Nämä tulokset osoittavat, että toiminnalliset rikastusanalyysit viittaavat erityisesti immuniteettisolujen signalointireitteihin, jotka liittyvät soluvasteeseen patogeenisille motiiveille tai sytokiineille. Nämä ovat todennäköisesti odotettavissa olevia tuloksia septisille potilaille, ja ne tarvitsevat lisätutkimuksia sepsiksen kulkureittien selvittämiseksi. Kappa-tilastojen ja p-arvojen perusteella havaitsimme, että rikastuneiden biologisten prosessien ja molekyylireittien joukossa sytokiinien signalointi immuunijärjestelmässä, adaptiivinen immuunijärjestelmä, sensorinen havainto, synnynnäinen immuunijärjestelmä sekä immunosäätelyvuorovaikutukset lymfoidisten ja ei-lymfoidisten välillä. solujen säätelyhäiriöt ja ne liittyivät merkitsevästi sepsiksen etenemiseen iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla oli sepsis (kuvio 4).

Lisäksi osoitimme T-solujen monimuotoisuuden iäkkäillä sepsispotilailla ja käytimme MiXCR:ää analysoimaan RNA-Seq:n raakasekvenssiä TCR:iden klootyyppien määrittämiseksi, mikä mahdollisti meidän tutkia samanaikaisesti TCR:ien ja koko transkription monimuotoisuutta [ 15]. Tässä tutkimuksessa käytettiin RNA-Seqiä ja MiXCR:ää T-solusignaloinnin tunnistamiseen, ja tulokset paljastivat, että R-ryhmän TCR-diversiteetti päivänä -8 oli suurempi kuin päivänä-1 (kuva 5). . Verrattuna NR-ryhmään R-ryhmän CDR3-, D50- ja käänteis-Simpson-indeksiarvot olivat huomattavasti korkeammat päivänä-8 kuin päivänä-1. Tämä todistusaineisto korostaa myös TCR:ien aiheuttaman monimuotoisuuden merkitystä iäkkäillä tehohoitopotilailla, joilla on sepsis. Tämä todiste osoittaa, että RNA-Seq- ja MiXCR-dataa voidaan käyttää TCR:iden monimuotoisuuden käsittelemiseksi sepsispotilailla. Tutkimuksessamme on joitain rajoituksia, jotka on otettava huomioon. Ensinnäkin tässä tutkimuksessa tutkittu potilasryhmä oli pieni. Siksi erilaisten populaatioiden tutkimukset suuremmalla otoskoolla auttaisivat vahvistamaan tietomme. Toiseksi käytimme tässä tutkimuksessa bulkki-RNA-Seq:ia, ja tulevat sc-RNA-Seq- ja toiminnalliset kokeet ovat perusteltuja validointia varten solutasolla. Lisäksi cDNA-päiden nopeaa 5'-amplifikaatiota (5'-RACE) voidaan käyttää T-soluvalikoiman tutkimiseen, mikä voi edelleen vahvistaa havaintojamme. Kolmanneksi arvioimme tulehdusvasteiden biologiset ja molekyyliset toiminnot sepsispotilailla käyttämällä RNA-Seq-tietoja. Lisätoiminnallisia tutkimuksia tarvitaan sepsiksen roolien selvittämiseksi.

Kuva 4 Gene Ontologyn (GO) termien rikastaminen visualisoitiin käyttämällä Cytoscapen ClueGO/CluePedia-laajennusta

Kuva 5 T-solureseptorin monimuotoisuus päivänä-1 ja päivänä-8. Käänteisen Simpson-indeksin lukemat (A), yksilöllinen CDR3 (B), D50 ja (C). *<0.05, **<0.005

Johtopäätökset

Sepsiksen ilmaantuvuus ja kuolleisuus ovat korkeat vanhuksilla. Tutkimuksessamme otettiin mukaan kriittisesti sairaita iäkkäitä henkilöitä, joilla oli sepsis ja tunnistettiin kuolleisuuden kannalta merkityksellisiä biologisia piirteitä ja transkriptomisia piirteitä RNA-Seq-tietoihin perustuvilla toiminnallisilla polku- ja MiXCR-analyyseillä. Verrattuna päivään 1 havaitsimme lisääntyneen synnynnäisen immuniteetin ja lisääntyneen T-solujen monimuotoisuuden reagoivien potilaiden joukossa päivänä 8, mikä osoittaa, että reagoivilla potilailla toipuminen sepsisestä oli paremmin säädelty kuin ei-responsiivisilla potilailla. Tarkan ja varhaisen ennustamisen toteuttamiseksi RNA-Seq-testin hyödyntäminen voisi tarjota täydentävää lisätietoa hoidon tulosten varhaiseen ennustamiseen.

Viitteet

1. Seymour CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliott CF, Xu Z, et ai. Sepsiksen uusien kliinisten fenotyyppien loma, validointi ja mahdolliset hoitovaikutukset. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R, et ai. Bakteerisepsiksen transkriptomiikan valvomaton analyysi useissa tietosarjoissa paljastaa kolme vahvaa klusteria. Crit Care Med. 2018;46(6):915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH, et ai. Kumulatiivinen prognostinen pistemäärä, joka ennustaa teho-osastolle otettujen yli 80-vuotiaiden potilaiden kuolleisuutta. J Am Geriatr Soc. 2019;67(6):1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S, et ai. Tehohoidon lääketutkimuksen asema ja tulevaisuuden ohjelma hyvin vanhoille potilaille teho-osastolla. Tehohoito Med. 2017;43(9):1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C, et ai. Haurauden, kognition, jokapäiväisen elämän aktiivisuuden ja samanaikaisten sairauksien vaikutus lopputulokseen yli 80-vuotiailla akuutisti hoidetuilla potilailla Euroopan teho-osastoilla: VIP2-tutkimus. Tehohoito Med. 2020;46(1):57–69.

6. Stahl EC, Brown BN. Soluterapiastrategiat immunogeenitieteen torjumiseksi. Organogeneesi. 2015;11(4):159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. Sepsis ja immunosensenssi iäkkäällä potilaalla: katsaus. Front Med (Lausanne). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D, et ai. Antigeenispesifinen adaptiivinen immuniteetti SARS-CoV-virukselle-2 akuutissa COVID-viruksessa-19 ja yhteys ikään ja taudin vaikeusasteeseen. Cell. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. Kymmenen asiaa, jotka on tiedettävä kriittisesti sairaista iäkkäistä potilaista. Tehohoito Med. 2017;43(2):217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G, et ai. Kriittisesti sairaiden yli 80-vuotiaiden potilaiden hoito: kertomus. Ann tehohoito. 2018;8(1):114.

11. Brady J, Horie S, Lafey JG. Mukautuvan immuunivasteen rooli sepsiksessä. Tehohoito Med Exp. 2020; 8(1):20.

12. Martin MD, Badovinac VP, Grifth TS. CD4 T-soluvasteet ja sepsiksen aiheuttama immunohalvaustila. Front Immunol. 2020. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA, et ai. Sellaisen transkriptiprofiilin tunnistaminen, joka liittyy elinten toiminnan paranemiseen septisen shokin potilailla varhaisen tukihoidon jälkeen. Crit Care. 2018; 22(1):312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL, et ai. RNA-Seq:n käyttäminen immuuniaineenvaihdunnan ominaisuuksien tutkimiseen immuunipuutteellisilla potilailla, joilla on sepsis. Front Med (Lausanne). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putintseva EV, et ai. MiXCR: ohjelmisto kattavaan adaptiiviseen immuniteettiprofilointiin. Nat Methods. 2015;12(5):380–1.

16. Bolotin DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI, et ai. Antigeenireseptorivalikoiman profilointi RNA-seq-tiedoista. Nat Biotechnol. 2017;35(10):908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM, et ai. SOFA-pistemäärän käyttö elinten toimintahäiriön/vian ilmaantuvuuden arvioimiseen tehohoitoyksiköissä: tulokset monikeskustutkimuksesta, prospektiivisesta tutkimuksesta. Euroopan tehohoitoyhdistyksen "sepsikseen liittyviä ongelmia" käsittelevä työryhmä. Crit Care Med. 1998;26(11):1793–800.

18. Garcia-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. SOFA- ja Delta-SOFA-pisteiden hyödyllisyys päivystysosaston kriittisesti sairaiden potilaiden tulosten ennustamiseen. Eur J Emerg Med. 2018;25(6):387–93.

19. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. Peräkkäinen elinten vajaatoiminnan arviointipisteet tulosten ennustamiseksi potilailla, joilla on vaikea sepsis ja näyttöä hypoperfuusiosta ensiapuosaston esittelyhetkellä. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: nopea jatkojalostus, jossa on vähän muistia. Nat Methods. 2015;12(4):357–60.

21. Anders S, Huber W. Differentiaalinen ilmentymisanalyysi sekvenssien määrätiedoille. Genome Biol. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: tehokas yleiskäyttöinen ohjelma sekvenssilukemien määrittämiseksi genomiominaisuuksille. Bioinformat ics. 2014;30(7):923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et ai. g: Profiler: verkkopalvelin funktionaalisen rikastusanalyysin ja geenilistojen muunnoksia varten (2019 päivitys). Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. Rikastuskartta: verkkopohjainen menetelmä geenijoukon rikastamisen visualisointiin ja torjuntaan. PLoS ONE. 2010;5(11):e13984.

25. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D, et ai. Cytoscape: ohjelmistoympäristö biomolekyylien vuorovaikutusverkostojen integroiduille malleille. Genome Res. 2003;13(11):2498–504.

26. Andersen ES. DNA- ja RNA-rakenteiden ennustaminen ja suunnittelu. N Biotekniikka. 2010;27(3):184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. Uusi yksinkertaistettu akuutin fysiologian pistemäärä (SAPS II), joka perustuu Euroopan/Pohjois-Amerikan monikeskustutkimukseen. JAMA. 1993; 270(24):2957–63.

28. Sutherland A, Thomas M, Brandon RA, Brandon RB, Lipman J, Tang B, et ai. Uuden molekyylibiomarkkeridiagnostisen testin kehittäminen ja validointi sepsiksen varhaiseen havaitsemiseen. Crit Care. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D, et ai. Leikkauksen jälkeisen infektion ja sepsiksen presymptomaattinen diagnoosi geeniekspression allekirjoituksia käyttämällä. Tehohoito Med. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumili GK, Walker SR, et ai. Rasvahapot ja syövän monistettu ZDHHC19 edistävät STAT3:n aktivaatiota S-palmitoylaation kautta. Luonto. 2019;573(7772):139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P, et ai. Yhteiset ja erilliset näkökohdat sepsiksen transkriptomisesta vasteesta ulosteen peritoniitille ja keuhkokuumeelle. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(3):328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K, et ai. Endogeenisen histamiinin kriittinen rooli päätekudosvaurion edistämisessä sepsiksessä. Tehohoito Med Exp. 2016; 4(1):36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT, et ai. Immuunisolujen allekirjoitus bakteerisepsiksestä. Nat Med. 2020;26(3):333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S, et ai. Ihmisen in vivo -muodostetut monosyyteistä peräisin olevat dendriittisolut ja makrofagit ristiin esittelevät antigeenejä tyhjiöreitin kautta. Nat Commun. 2018;9(1):2570.

35. Ivanov I, Kuhn H, Heydeck D. Arakidonihappo-15-lipoksigenaasin-1 (ALOX15) rakenne- ja toimintabiologia. Gene. 2015;573(1):1–32.

36. Singh NK, Rao GN. 12/15-lipoksigenaasin (ALOX15) kasvava rooli ihmisen patologioissa. Prog Lipid Res. 2019; 73:28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. Kroonisen spontaanin urtikariapotilaiden kiertävän FCepsilonRIan arviointi ja sen korrelaatio kliinisten ja immunologisten muuttujien kanssa. Immunobiologia. 2018; 223(12):807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. Tutkiva pilottitutkimus geneettisistä markkereista IgE-välitteisille allergisille sairauksille FcepsilonR1alpha- ja Cepsilon-ilmentymillä. Int J Mol Sei. 2015;16(5):9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J et ai. Neljän lokuksen geenivuorovaikutus IL13:n, IL4:n, FCER1B:n ja ADRB2:n välillä astmassa kiinalaisilla Han-lapsilla. Pediatr Pulmonol. 2016;51(4):364–71.

40. Kosenko T, Golder M, Leblond G, Weng W, Lagace TA. Matalatiheyksinen lipoproteiini sitoutuu proproteiinikonvertaasin subtilisiini/keksiinityyppi-9 (PCSK9) ihmisen plasmassa ja estää PCSK9--välitteisen matalatiheyksisen lipoproteiinireseptorin hajoamisen. J Biol Chem. 2013;288(12):8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A, et ai. ClueGO: Cytoscape-laajennus funktionaalisesti ryhmitellyn geeniontologian ja polkumerkintäverkkojen tulkitsemiseen. Bioinformatiikka. 2009;25(8):1091–3.