Koko genomin sekvensointi neurologisten toistuvien laajenemishäiriöiden diagnosoimiseksi Isossa-Britanniassa: retrospektiivinen diagnostinen tarkkuus ja mahdollinen kliininen validointitutkimus

Lisätietoja:ali.ma@wecistanche.com

Yhteenveto

Tausta

Toistuvan laajentumisen häiriöt vaikuttavat noin yhteen yksilöön 3 000:sta ja ovat kliinisesti heterogeenisiä sairauksia, jotka johtuvat lyhyiden tandem-DNA-toistojen laajenemisesta. Geneettinen testaus on usein paikkaspesifistä, mikä johtaa sellaisten ihmisten alidiagnosointiin, joilla on epätyypillisiä kliinisiä esimerkkejä, erityisesti lapsipotilailla, joilla ei ole aiempaa positiivista sukuhistoriaa. Koko genomin sekvensointia käytetään yhä enemmän muiden harvinaisten geneettisten sairauksien ensilinjan testinä, ja pyrimme arvioimaan sen suorituskykyä potilaiden diagnosoinnissa.neurologinentoistuvia laajentumishäiriöitä.

menetelmät

Arvioimme takautuvasti koko genomin sekvensoinnin diagnostista tarkkuutta havaitaksemme yleisimmät toistolaajenemislokukset, jotka liittyvätneurologinentulokset (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT ja TBP) käyttämällä näytteitä, jotka on otettu Englannin kansallisesta terveyspalvelusta potilailta, joiden epäiltiin sairastavanneurologinenhäiriöt; aiempia PCR-testin tuloksia käytettiin vertailustandardina. Koko genomin sekvensoinnin kliinistä tarkkuutta toistuvien laajentumisten havaitsemiseksi tutkittiin prospektiivisesti aiemmin geneettisesti testatuilla ja diagnosoimattomilla potilailla, jotka värvättiin vuosina 2013–2017 100 000 Genomes Projectiin Isossa-Britanniassa ja joilla epäiltiin geneettistäneurologinenhäiriö (famiaaliset tai varhain alkavat ataksian muodot, neuropatia, spastinen paraplegia, dementia, liikehermoston sairaus,parkinsonilainenliikettähäiriöt, kehitysvamma tai neuromuskulaariset häiriöt). Jos toistuva laajennuskutsu tehtiin käyttämällä koko genomin sekvensointia, tuloksen vahvistamiseen käytettiin PCR:ää.

Havainnot

Koko genomin sekvensoinnin diagnostinen tarkkuus toistuvien laajentumisten havaitsemiseksi arvioitiin 793 PCR-testillä, jotka tehtiin aiemmin NHS:ssä 404 potilaalta. Koko genomin sekvensointi luokitteli oikein 215 221 laajennetusta alleelista ja 1316 1321 ei-laajentumattomasta alleelista, mikä osoitti 97,3 prosentin herkkyyttä (95 prosentin CI 94,2–99,0) ja 99,6 prosentin spesifisyyttä (99,1–99). ·9) 13 sairauteen liittyvässä lokuksessa verrattuna PCR-testin tuloksiin. Näytteissä 11 631 potilaista 100 000 Genomes Projectissa koko genomin sekvensointi tunnisti 81 toistuvaa laajenemista, jotka myös testattiin PCR:llä: 68 vahvistettiin toistuviksi laajennuksiksi koko patogeenisuusalueella, 11 ei ollut. -patogeenisiä välilaajennuksia tai permutaatioita, ja kaksi oli ei-laajentunutta toistoa (16 prosentin vääriä löytöjä).

Tulkinta

Tutkimuksessamme koko genomin sekvensointi toistuvien laajennusten havaitsemiseksi osoitti suurta herkkyyttä ja spesifisyyttä, ja se johtineurologinentoistuvia laajentumishäiriöitä aiemmin diagnosoimattomilla potilailla. Nämä havainnot tukevat koko genomin sekvensoinnin toteuttamista kliinisissä laboratorioissa sellaisten potilaiden diagnosoimiseksi, joilla onneurologinentoistuvan laajentumishäiriön mukainen esitys.

Rahoitus

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research ja Illumina.

Johdanto

Huolimatta viimeaikaisista edistysaskeleistamme harvinaisten geneettisen perustan ymmärtämisessäneurologinenJopa 70 prosenttia potilaista, joilla on tällaisia ​​häiriöitä, jää geneettisesti diagnosoimattomiksi.1–3 Tämä johtuu osittain monimutkaisten ja toistuvien geneettisten muunnelmien testauksen teknisistä haasteista, mukaan lukien toistuvat laajennukset; tällaisten laajentumisten arvioidaan vaikuttavan noin yhteen ihmiseen 3 000:sta (liite p 1), ja ne ovat yli 40 neurogeneettisen häiriön johtava syy,4 mukaan lukien Huntingtonin tauti ja hauras X-oireyhtymä. Toistuva laajenemishäiriöt ovat kliinisesti ja geneettisesti heterogeenisiä, ja toistuva laajeneminen voi liittyä useisiin sairauksiin. Esimerkiksi C9orf72:n laajennukset voivat ilmetä joko amyotrofisena lateraaliskleroosina tai frontotemporaalisena dementiana.5 Toistuvat laajennukset eri lokuksissa voivat myös tuottaa samanlaisia ​​fenotyyppisiä piirteitä, mikä tekee niistä vaikean erottaa kliinisesti: toistuvia laajennuksia vähintään kymmenessä spinocerebellaarisessa ataksiageenissä esiintyy usein aikuisena. -alkuinen ataksia,6 ja C9orf72- ja AR-potilaat voivat molemmat aiheuttaa motoristen hermosolujen sairautta.7,8

Toistuvat laajenemishäiriöt johtuvat toistuvien lyhyiden tandem-DNA-sekvenssien määrän kasvusta, ja kunkin häiriön patogeenisuuskynnykset ovat lokuskohtaisia. Laajentumisen koko vaihtelee alle 30 toistosta (esim. CACNA1A:ssa) useisiin tuhansiin toistoyksikköihin (esim. FMR1:ssä, DMPK:ssa, C9orf72:ssa ja FXN:ssä, jotka voivat ulottua jopa 5 kb:n kokoisiksi). Toistuvissa laajennuksissa esiintyy molekyylien epävakautta, mikä voi johtaa toiston koon muutoksiin (yleensä pituuden kasvaessa) sukupolvien ja kudosten välillä.4 Näissä olosuhteissa toistojen lukumäärän lisääntyminen johtaa usein aikaisempaan puhkeamiseen ja vakavampaan sairauteen peräkkäisissä vaiheissa. 4 Toistuvien laajentumishäiriöiden puhkeaminen lapsilla voi ilmetä monisysteemisinä oireyhtyminä ilman spesifisiä fenotyyppisiä merkkejä9, ja siksi lapsia, joilla on näitä sairauksia, alidiagnosoidaan todennäköisemmin, jos suvussa ei ole esiintynyt toistuvaa laajenemishäiriötä, kuin silloin, kun se on olemassa.10– 12

Toistuvien laajentumisten laboratorioarviointi rajoittuu tyypillisesti yksittäisen lokuksen kohdennettuun molekyylien arviointiin, jota ohjaa epäilty kliininen diagnoosi käyttämällä PCR-pohjaisia ​​tai Southern blot -menetelmiä,13 mikä voi olla kallista ja aikaa vievää. Lisäksi näiden sairauksien vaihtelevien ja päällekkäisten fenotyyppisten piirteiden vuoksi sairauteen liittyvät toistuvat laajenemislokukset voivat jäädä testaamatta.14

Koko genomin sekvensointi on nousemassa ensimmäisen linjan diagnostiikkatyökaluksi harvinaisia ​​sairauksia sairastavilla potilailla15, mutta viime aikoihin asti sen uskottiin olevan rajallinen kyky arvioida toistuvia laajennuksia sisältäviä lokuksia.16 Bioinformatiikan edistyminen on kuitenkin mahdollistanut sairauksien havaitsemisen. -aiheuttaa toistuvia laajennuksia seuraavan sukupolven sekvensointitiedoista.17–22 Tässä raportoimme koko genomin sekvensointimenetelmän diagnostisesta arvioinnista toistuvien laajennuksien havaitsemiseksi retrospektiivisten PCR-tietojen avulla ja sen kliinisestä validoinnista 100 000 genomiprojektin potilailla, jotka oli epäilty neurologinen sairaus, jota ei ole diagnosoitu aikaisemmilla geneettisillä testeillä.

menetelmät

Tutkimuksen suunnittelu ja osallistujat

Tämä koko genomin sekvensoinnin arviointi toistuvien laajentumisten havaitsemiseksi sisälsi sekä diagnostisen tarkkuuden että kliinisen tarkkuuden arvioinnit. Diagnostinen tarkkuus arvioitiin käyttämällä tietoja potilailta, joille oli aiemmin testattu PCR:llä toistuvia laajennuksia, joiden tiedettiin aiheuttavan neurologisia sairauksia.4 Potilaat tunnistettiin kahdesta lähteestä: 100 000 Genomes Project ja Genomic Laboratory, joka perustuu Cambridgen yliopistollisiin sairaaloihin ( Cambridge, Iso-Britannia). Molemmille potilasryhmille PCR-testaus suoritettiin potilasnäytteille Kansallisen terveyspalvelun (NHS) laboratorioissa osana rutiininomaista kliinistä arviointia: 100000 Genomes -projektin näytteille tehtiin PCR-testit ennen hankkeen rekrytointia. University College London Hospital Neurogenetics Laboratory (Lontoo, UK); näytteet, joissa oli PCR-vahvistettu toistuva laajennus, saatiin potilailta, jotka oli testattu Cambridgessa sijaitsevassa Genomic Laboratoryssa. Potilaat, joilla oli PCR-positiivisia ja PCR-negatiivisia testituloksia toistuvien laajenemishäiriöiden osalta, tunnistettiin sisällytettäväksi tutkimukseemme laboratoriorekisterijärjestelmien avulla; kaikki potilaat olivat antaneet kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen näytteen käyttöön laadunvarmistus- sekä tutkimus- ja koulutustarkoituksiin osana kliinisen palvelun optimointia ja validointia.

Kunkin näytteen koko genomin sekvensointi tehtiin toisessa kahdesta laboratoriosta: Genomics England (Hinxton, UK) 100000 Genomes Project -näytteelle (n=254) ja Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) Cambridgessa sijaitsevan Genomic Laboratoryn (n=150) keräämille näytteille. Kaiken kaikkiaan tätä aineistoa käytettiin tutkimuksen diagnostisen tarkkuusosaan, ja se koostui 404 potilaan PCR- ja koko genomin sekvensointitiedoista, jotka kattoivat 13 lokusta, jotka edustavat yleisimpiä neurologisia toistuvia laajentumishäiriöitä: 11 lokusta, jotka liittyvät ataksiaan ja myöhään. alkavat neurodegeneratiiviset häiriöt (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 ja FXN), yksi älylliseen vammaisuuteen liittyvä lokus (FMR1) ja yksi myotoniseen dystrofiaan (DMPK) liittyvä lokus. Jokaisesta lokuksesta oli saatavilla PCR-testitiedot vähintään yhdestä laajennetusta alleelista (liite p 24).

Kliininen tarkkuus arvioitiin tutkimalla koko genomin sekvensoinnilla havaittujen toistuvien laajentumisten yhteensopivuutta epäillyn kliinisen diagnoosin kanssa PCR-vahvistuksen jälkeen potilailla, joilla epäillään geneettisiä neurologisia häiriöitä (famiaaliset tai varhain alkavat ataksian muodot, neuropatia, spastinen paraplegia, dementia , motoristen hermosolujen sairaus,parkinsonilainenliikehäiriöt, kehitysvamma tai hermo-lihashäiriöt) rekrytoitiin 100000 Genomes -projektiin vuosina 2013–2017. 100000 Genomes Project on Yhdistyneen kuningaskunnan ohjelma, jonka tarkoituksena on arvioida koko genomin sekvensoinnin arvoa potilailla, joilla on tyydyttämättömiä diagnostisia tarpeita harvinaisissa sairauksissa ja syövissä. Sen jälkeen kun Itä-Englannin Cambridge South Research Ethics Committee (viite 14/EE/1112) oli hyväksynyt eettisen hyväksynnän 100000 genomia -projektille, mukaan lukien tietojen analysointi ja diagnostisten tulosten palauttaminen potilaille, terveydenhuollon ammattilaiset ja tutkijat rekrytoivat nämä potilaat 13 Genomic Medicine Centeriä Englannissa ja otettiin mukaan hankkeeseen, jos he tai heidän huoltajansa antoivat kirjallisen suostumuksen näytteidensä ja tietojensa käyttöön tutkimuksessa, mukaan lukien tämä tutkimus. Probandit ja mahdollisuuksien mukaan muut perheenjäsenet otettiin mukaan tietyille harvinaisille sairauksille asetettujen kelpoisuuskriteerien mukaisesti (liite s. 5–11). Potilaat rekrytoitiin 100000 Genomes -projektiin NHS:ssä suoritetun standardinmukaisen geneettisen testauksen jälkeen kelpoisuuskriteerien mukaisesti. Standardoidut perustason kliiniset tiedot tallennettiin käyttämällä Human Phenotyping Ontology (HPO)23:a sairauskohtaisia ​​tietomalleja vastaan.24 Myös perheenjäsenten sairaustila suhteessa koettimen kliiniseen testausaiheeseen kerättiin.

Tunnistaaksemme aiheuttavan toistuvan laajenemisen potilailla, joilla oli geneettisesti diagnosoimaton sairaus, testasimme potilaita, joilla epäillään geneettisiä häiriöitä, jotka ovat yhdenmukaisia ​​toistuvan laajenemissairauden kanssa. Potilaat valittiin sairauden ja HPO-termien yhteensopivuuden perusteella toistuvaan laajentumiseen liittyvien sairauksien kanssa. Potilaiden koko genomin sekvensointitietoja tutkittiin laajennuksien etsimiseksi tietyistä toistosarjoista käyttämällä neljää erilaista toistolaajennuspaneelia heidän kliinisten ominaisuuksiensa mukaan (liite p 5). Näihin paneeleihin sisällytettäväksi valitut toistuvat laajennukset ovat yleisimpiä neurologisia sairauksia aiheuttavia toistuvia laajenemislokuksia. Potilaita, joilla oli mahdollisesti yhteensopivia useamman kuin yhden toistuvan laajentumishäiriön kanssa, testattiin useilla paneeleilla. Jos toistuva laajennuskutsu tehtiin käyttämällä koko genomin sekvensointia, suoritettiin vahvistava testaus PCR:llä.

Jokaisen potilaan, jolla oli vahvistettu toistuva laajeneminen, paikalliselle kliinikolle ilmoitettiin mahdollisesta diagnostisesta tuloksesta, ja toistuvan laajennuksen vaikutus potilaan kliinisiin ominaisuuksiin arvioitiin. Toistuvista laajennuksista, jotka selittivät kokonaan tai osittain potilaan kliiniset ominaisuudet, annettiin diagnostinen raportti paikallisten standardimenettelyjen mukaisesti.

Menettelyt

Tutkimuksemme diagnostisen tarkkuuden osassa käytetyille historiallisille NHS-näytteille toistuvia laajennuksia oli aiemmin testattu käyttämällä PCR-amplifikaatiota ja fragmenttianalyysiä. Southern blotting suoritettiin suurille C9orf72-laajennuksille. Tutkimuksemme kliinisen tarkkuuden osassa 100 000 Genomes Projectin potilaiden koko genomin sekvensoinnilla havaitut toistuvat laajennukset testattiin PCR:llä NHS:n geneettisiin laboratorioihin tallennetuista näytteistä. Lisätiedot, mukaan lukien alukesekvenssit, on annettu liitteessä (s. 2–3, 25–26).

DNA valmistettiin koko genomin sekvensointia varten käyttämällä TruSeq DNA PCR-Free -kirjaston valmistelua, ja 150 bp:n tai 125 bp:n paripäiden sekvensointi suoritettiin joko HiSeq 2000- tai HiSeq X -alustoilla Genomics Englandin korkean suorituskyvyn genomilaitoksessa ja ICSL:ssä. . Genomit sekvensoitiin keskimäärin 35× (31× - 37×; liite p 27) syvyyteen. Lyhyen tandem-toiston genotyypitys suoritettiin ExpansionHunter-ohjelmistopaketin versiolla 3.1.2.25,26 Lyhyesti sanottuna ExpansionHunter kohdistaa sekvensointilukemat uudelleen ennalta määritetylle lyhyiden tandemtoistojen joukolle arvioidakseen molempien alleelien koon yksilöstä (liite p 3).

ExpansionHunter-tulos sisältää arvion toistuvien elementtien määrästä, kokonaiskoosta ja luottamusrajasta jokaiselle arvioidulle lokukselle. Association for Medical Pathologyn ja College of American Pathologists -yliopiston ohjeissa suositellaan muunnelmien kutsujen silmämääräistä tarkastusta korkean suorituskyvyn sekvensointimuunnelmien rutiiniarvioinnin aikana.27

Lyhyitä tandem-toistovariantteja ei kuitenkaan voida visualisoida riittävästi yleisillä visualisointityökaluilla, kuten Integrative Genomics Viewer.28 Kunkin genotyyppikutsun taustalla olevan koko genomin sekvensointidatan tutkimiseen käytettiin graafisen visualisointityökalua, joka mahdollistaa haplotyyppien ja vastaavan lukukasan suoran visualisoinnin. ExpansionHunter-genotyypeistä (liite s. 3, 15). Pileup-kaavion visuaalinen tarkastus suoritettiin kaikille koko genomin sekvensoinnin lyhyille tandem-toistokutsuille sen varmistamiseksi, että ExpansionHunter-ennuste alleeleille sisältyi kokonaan jokaiseen lukemaan (eli toistosekvenssi oli pienempi kuin sekvensoinnin lukupituus); vahvistaakseen monoalleelisen tai kaksialleelisen laajenemisen; havaita oletetut väärät positiiviset puhelut; ja väärien negatiivisten alleelien havaitsemiseen kaksialleelisissa toistuvissa laajennuksissa, kuten FXN (liite s. 4, 16).

ExpansionHunter arvioi toistokoon koko genomin sekvensointitiedoista analysoimalla sekvensointilukemat, jotka sisältävät kokonaan tai osittain lyhyen tandemtoiston. Jos lyhyt tandem-toistoalleeli on lyhyempi kuin lukupituus, ExpansionHunter ennustaa tarkan koon; jos lyhyt tandem-toistoalleeli on pidempi kuin lukupituus, ExpansionHunter arvioi toiston koon CI:ssä lokussekvenssin koostumuksesta, sekvensoinnin syvyydestä ja sekvensoinnin laadusta riippuen.

Tilastollinen analyysi

Luokitimme toistot laajennetuiksi koko genomin sekvensoinnilla, jos ExpansionHunterin ennustama koko oli yli premutaatiorajan, tai ei-laajentuneiksi, jos ennustettu koko oli rajan alapuolella (liite p 28).

Herkkyys ja CI:t koko genomin sekvensoinnin toiston laajenemisen havaitsemiseksi laskettiin laajennettujen toistojen omaavien alleelien osuutena aiemmin PCR-vahvistettujen alleelien joukossa, joissa oli laajennettuja toistoja. Spesifisyys arvioitiin ei-laajentuneiden alleelien osuutena aiemmin testattujen ei-laajentuneiden toistojen joukossa PCR:llä. Tilastokaavojen täydellinen kuvaus on liitteessä (s. 1).

Toistokokojen vertaamiseksi PCR:llä toistokokoarvioihin koko genomin sekvensoinnilla, PCR-kvantifioituja alleeleja verrattiin ExpansionHunterin ennustamiin toistokokoihin alleeleille, jotka olivat lyhyempiä kuin lukupituus kaikissa 13 lyhyessä tandemtoistolokuksessa. Yhteensopivuus laskettiin ExpansionHunterin ennustamien toistokokojen prosenttiosuudella, jotka olivat yhtäpitäviä PCR-kvantifioidun koon kanssa, ottaen huomioon PCR-virheen plus tai miinus yksi toisto. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä R tilastollisen ohjelmiston versiota 3.6.3.

Rahoituslähteen rooli

Tutkimuksen suunnittelua, potilaiden rekisteröintiä, tiedonkeruuta ja sekvensointia johtivat Genomics Englandin työntekijät ja akateemiset tutkijat. Illuminan työntekijät suorittivat 150 potilasnäytteen sekvensoinnin osana koko genomin sekvensoinnin diagnostista tarkkuustutkimusta ja kehittivät ExpansionHunterin. Genomics Englandin työntekijät, akateemiset tutkijat ja kirjoittajat RTH, ED ja MAE suorittivat 100 000 Genomes Projectiin värvättyjen potilaiden toistuvien laajentumisten analyysin ja tulkinnan. Rahoituslähteillä ei ollut roolia tiedon tulkinnassa tai raportin kirjoittamisessa.

Tulokset

Koko genomin sekvensoinnin diagnostinen tarkkuus toistuvien laajentumisten havaitsemiseksi arvioitiin 793 PCR-testillä, jotka tehtiin aiemmin NHS:ssä 404 potilaalta (64 potilasta testattiin useamman kuin yhden toiston suhteen; kuva 1). Näistä testeistä 183 luokiteltiin sellaisiksi, joilla oli laajennettu toisto ja 610, joilla ei ollut toistuvaa laajenemista PCR:llä, mikä tuotti yhteensä 221 laajennettua ja 1321 ei-laajentunutta yksittäistä alleelia 13 sairauspaikassa (liite s. 24, 28). Koko genomin sekvensointi luokitteli oikein 215 221 laajennetusta alleelista ja 1316 1321 ei-laajentuneesta alleelista PCR-testituloksiin verrattuna (liite s. 27, 29), joiden alkuperäinen herkkyys oli 97,3 prosenttia (95 prosentin CI 94,2–99). ·0) ja spesifisyys 99,6 prosenttia (99,1–99,9; taulukko 1). Kun kaikki kutsut oli korjattu visuaalisesti lukujen laatuun perustuen, herkkyys nousi 99,1 prosenttiin (96,8–99,9) ja spesifisyys 100 prosenttiin (99,7–100; kuva 2A, taulukko 1). Laajentuneiden alleelien visualisointi mahdollisti väärien positiivisten tulosten havaitsemisen ja kaikkien väärien negatiivisten alleelien uudelleenluokittelun FXN:ssä, joista vain yksi alleeli luokiteltiin oikein laajentuneeksi näytteissä, joissa oli kaksialleelisia laajennuksia (liite s. 17, 18).

Toiston pituus määritettiin PCR:llä 509 PCR-testissä, joissa tutkittiin 945 alleelia 13 toistolaajentumislokuksen poikki. ExpansionHunterin ja PCR:n väliset korrelaatiot toistokokojen ollessa lyhyempiä ja suurempia kuin sekvensoinnin lukupituus (eli 150 bp) on esitetty liitteessä (liite p 19). Korkea yhteensopivuus havaittiin lukupituutta lyhyemmillä toistoilla, 92,7 prosentin (836/902) yhtäpitävyys PCR:n ja ExpansionHunterin välillä. Lokuksen vaihtelua havaittiin, ja ExpansionHunterin ja PCR:n välillä oli korkea yhteensopivuus ATXN2:lle, ATXN7:lle, CACNA1A:lle ja HTT:lle, ja alhainen vastaavuus DMPK:lle tai TBP:lle (liite p 30). ExpansionHunter aliarvioi lukupituutta suurempien alleelien pituudet, mikä vaikutti kutsumisen tarkkuuteen DMPK:ssa, FMR1:ssä ja FXN:ssä (kuva 2B, liite s. 19, 31).

Vaikka ExpansionHunter pystyi tunnistamaan oikein suuret laajentuneet alleelit FMR1:ssä, DMPK:ssa, C9orf72:ssa ja FXN:ssä (liite p 29), ennustetut kokoarviot olivat yleensä pienempiä kuin PCR:llä saadut, koska toistokoko kasvoi patogeenisen alueen sisällä, mikä vaikutti kyky erottaa suuret ja pienet laajennukset DMPK:ssa, C9orf72:ssa ja FXN:ssä tai täydet laajennukset ja permutaatiot FMR1:ssä (liite p 31). Esimerkiksi lokusten, joiden PCR-arvioitu toistopituus on suurempi kuin 200 toistoa FMR1:ssä ja jotka luokiteltiin täydelliseksi mutaatioksi, oli ExpansionHunterin arvioima keskimääräinen toistokoko 92,6 (SD 17,8; liite p 31).

Testaaksemme koko genomin sekvensoinnin avulla tapahtuvan toistuvan laajenemisen havaitsemisen kykyä ratkaista aiemmin testattujen ja geneettisesti diagnosoimattomien potilaiden diagnoosi, testasimme 11 631 potilasta, joilla epäillään geneettistä neurologista sairautta ja jotka on värvätty 100000 genomiprojektiin (kuva 1). Koko genomin sekvensointitiedot arvioitiin käyttämällä neljää erilaista toistolaajennuspaneelia potilaan kliinisten ominaisuuksien mukaan. Jokaisella neljällä paneelilla testattujen potilaiden lukumäärät on esitetty taulukossa 2.

Kaiken kaikkiaan havaitsimme ja vahvistimme visuaalisesti toistuvia laajennuksia 105 potilaan näytteistä (taulukko 2, liite s. 20, 33). Näistä 81 näytettä oli saatavilla vahvistavaa testausta varten PCR:llä, ja 68:lla vahvistettiin toistuva laajeneminen (0·6 prosentin saanto): 45 (1,2 prosenttia) 3692:sta paneelissa A, kahdeksan ({ {18}}·3 prosenttia ) 2743:sta paneelissa B, viisi (0,6 prosenttia ) 860:sta paneelissa C ja kymmenen (0,1 prosenttia ) 6731:stä paneelissa D. Kolmetoista 81 laajennuskutsusta ei vahvistettu patogeenisiksi toistuviksi laajennuksiksi (16 prosenttia vääriä löytöjä). Näistä kaksi oli ei-laajentuneita alleeleja ATXN1:ssä ja ATXN2:ssa, neljä oli FMR1-keskikokoisia kutsuja (liite p 21) ja seitsemän oli FMR1-permutaatioita.

Taulukossa 3 on kliiniset tiedot 68 potilaasta, joilla on PCR:llä vahvistettu toistuva laajeneminen, mukaan lukien heidän kliinisen esityksensä, tunnistettu toistuva laajeneminen ja toistuvan laajenemisen vaikutus potilaan kliinisiin piirteisiin; HPO-termit, ExpansionHunterin arvioima toistokoko ja se, onko diagnostiikkaraportti annettu, on lueteltu liitteessä (s. 33).

Laajenemista havaittiin potilailla, joilla oli laaja valikoima päällekkäisiä kliinisiä esityksiä, jotka testattiin paneelilla A (taulukko 3, liite p 22), mukaan lukien ATXN2-toistuva laajeneminen potilaalla, jolla oli levodoparesponsiivinen varhain alkanut Parkinsonin tauti ja jolla on ollut progressiivinen pikkuaivojen ataksia. ja AR-laajeneminen neljällä potilaalla, joilla on kliinisesti diagnosoitu Charcot-Marie-Toothin tauti, mukaan lukien yksi, jolla on geneettisesti vahvistettu demyelinisoiva neuropatia (eli Charcot-Marie-Toothin tauti tyyppi 1, potilas 42; liite s. 33). Laaja valikoima aiempia kliinisiä diagnooseja havaittiin potilailla, joilla oli patogeenisiä toistuvia laajennuksia.

Esimerkiksi seitsemällä potilaalla, joilla oli amyotrofinen lateraaliskleroosi tai muu motorinen hermosairaus, havaittiin AR:n (n=4) ja C9orf72:n (n=3) laajenemista. Potilailla, joilla epäillään perinnöllistä ataksiaa, havaitsimme laajennuksia lokuksissa, joita ei ollut arvioitu osana rutiininomaista diagnostista työtä NHS:ssä rekrytointihetkellä, mukaan lukien ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP ja HTT ( taulukko 3). Havaitsimme myös toistuvia laajennuksia potilailla, joilla oli kliinisiä piirteitä, jotka ovat yhdenmukaisia ​​vaihtoehtoisten toistuvien laajenemishäiriöiden kanssa, mukaan lukien C9orf72-laajeneminen varhain alkaneessa ja familiaalisessa Parkinsonin taudissa (potilas 24, taulukko 3) ja toistuvia laajennuksia alentuneella penetranssialueella HTT:ssä (38 toistoa) kahdessa sisaressa, joilla on liikehäiriö, dementia, masennus ja puhevaikeudet (potilaat 44 ja 45), mikä korostaa näiden toistuvien laajentumishäiriöiden aiheuttamaa diagnostista haastetta.

Kahdeksalla paneelilla B testatulla lapsella havaittiin suuria CAG-toistolaajennuksia (kuva 3), joista seitsemän selitti täysin potilaan kliiniset ominaisuudet. Kuudella potilaalla ei ollut informatiivista sukuhistoriaa, eikä heille ole tarjottu uusintalaajennustestiä osana kliinistä arviointiaan rekrytointihetkellä (potilaat 48–53; taulukko 3, liite s. 33). Kahdella näistä lapsista oli suuria HTT-laajennuksia (90–100 CAG-toistoa). On huomionarvoista, että yksi lapsi oli perinyt toiston terveeltä vanhemmalta, jonka suvussa ei ollut Huntingtonin tautia. Perhetestaukset jatkuvat, mutta laajennetussa perheessä on havaittu alentunut penetranssialleeli, mikä osoittaa, että toisto oli laajentunut yli 60 toistoyksiköllä yhden sukupolven aikana (potilas 52). Kirjoitushetkellä kenelläkään perheessä ei ollut merkkejä Huntingtonin taudista, ja vanhempien geneettinen neuvonta ja testaus ovat käynnissä. Kahdella alle 5-vuotiaalla lapsella oli suuria toistuvia laajennuksia ATXN7:ssä ja heillä oli monimutkainen monisysteeminen sairaus. Yhdellä näistä lapsista (potilas 50) heidän vanhemmillaan oli kävelyongelmia 2 vuotta 100000 genomiprojektiin ilmoittautumisen jälkeen. Samoin 10-vuotiaalla kehitysvammaisella tytöllä todettiin 99-toistuva ATXN2-laajeneminen huolimatta siitä, että molemmat vanhemmat määriteltiin vammautumattomiksi, ja 18-vuotiaalla dementiaa sairastavalla tytöllä todettiin 99- {19}}toista laajennus ATN1:ssä (liite s. 33).

DMPK:ssa (paneeli C) havaittiin viisi laajenemista, mukaan lukien lapsella ja äidillä, joilla oli kliininen lihasdystrofian diagnoosi, kahdella sisaruksella, joilla epäillään distaalista myopatiaa, ja nuorella, jolla oli synnynnäinen myopatia (potilaat 54–58). FMR1-laajennuksia (paneeli D) havaittiin yhdeksällä pojalla ja yhdellä tytöllä, ja Fragile X -oireyhtymän diagnoosi selitti kokonaan tai osittain esiintyvät kliiniset piirteet (potilaat 59–68).

Keskustelu

Toistuvien laajenemishäiriöiden diagnoosi on haastavaa terveydenhuollossa heterogeenisten ja päällekkäisten kliinisten piirteiden ja epäspesifisten kliinisten löydösten vuoksi, jotka voivat pahentua iän myötä ja jokaisessa seuraavassa sukupolvessa. Toistuva laajenemishäiriöt ovat perinnöllisten neurologisten sairauksien yleisimpiä syitä.4 Siitä huolimatta potilaat voivat olla alidiagnosoituja joko siksi, että geneettistä testausta ei ole tehty riittävästi tai koska niiden aiheuttajia geneettisiä muunnelmia ei ole vielä löydetty. Testausmenetelmät ovat tällä hetkellä hajanaisia, ja potilaat voivat testata väärän toistuvan laajenemislokuksen29 tai saada molekyylitestin eri muunnelmaluokkaa varten, koska kliiniset piirteet ovat päällekkäisiä muiden neurologisten geneettisten häiriöiden kanssa.30

Koko genomin sekvensointia on käytetty useissa olosuhteissa ensimmäisen linjan diagnostisena testinä harvinaisille neurologisille häiriöille, mutta sen on aiemmin uskottu olevan heikko kyky havaita toistuvia laajennuksia.16 Useita työkaluja on kehitetty tunnistamaan toistuvia laajennuksia koko genomista. sekvensointi tutkimusympäristössä,31 mutta mitään näistä lähestymistavoista ei ole sovellettu koko genomin sekvensointitietoihin, jotka on kerätty suurelta määrältä potilaita yhdessä terveydenhuollon palvelussa. Esitämme todisteita siitä, että algoritmilla, joka on suunniteltu havaitsemaan toistuvia laajennuksia koko genomin sekvensoinnista, voidaan luotettavasti arvioida yleisimmät sairauksia aiheuttavat toistuvat laajennukset ja ratkaista aiemmin geneettisesti diagnosoimattomat tapaukset suuressa ryhmässä potilaita, joilla on neurologisia häiriöitä. Tuloksemme osoittavat, että koko genomin sekvensointi voi erottaa ei-laajentuneet ja laajentuneet alleelit, joilla on korkea herkkyys ja spesifisyys 13 toistuvan laajennuslokuksen välillä (joita voidaan edelleen parantaa visuaalisella tarkastelulla), voi laskea tarkasti luettua pituutta pienempien alleelien koon. , ja saattaa aliarvioida suurten laajennusten kokoa FMR1:ssä, DMPK:ssa, FXN:ssä ja C9orf72:ssa.

Kun toistuvien laajentumisten havaitsemista koko genomin sekvensoinnilla arvioitiin verrattuna positiivisiin ja negatiivisiin tuloksiin, jotka on saatu aiemmin kliinisissä diagnostisissa genomilaboratorioissa kultastandardimenetelmillä, havaitsimme vähintään 97,3 prosentin herkkyyden ja 99,6 prosentin spesifisyyden. Lisäksi osoitimme, että sekä spesifisyyttä että herkkyyttä voidaan parantaa manuaalisella käsittelyllä, joka mahdollistaa väärien positiivisten tulosten havaitsemisen ja väärien negatiivisten alleelien uudelleenluokittelun näytteissä, joissa on kaksialleelisia laajennuksia. FMR1-testatuista 6731 potilaasta (paneeli D) 124 puhelun ennustettiin laajenevan. Pystyimme sulkemaan pois 97 silmämääräisen tarkastuksen avulla todennäköisinä väärinä positiivisina. Tämä osoittaa, että yhdellä 54:stä koko genomin sekvensointitestistä on FMR1-kutsu, joka olisi tarkastettava silmämääräisesti mahdollisen väärän positiivisen kutsun hylkäämiseksi. ExpansionHunter-genotyypitysmenetelmää kehitetään jatkuvasti, jotta voidaan vähentää vääriä positiivisia FMR1-kutsuja.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 toistoa) aiheuttavat vakavampaa sairautta ja spinocerebellaarista ataksiaa tyyppi 36 (NOP56), jossa yli 650 toiston laajennukset katsotaan patogeenisiksi ja toistokoot 15–650 ovat välimuotoja ja muunnelmia, joiden merkitys on epävarma.

Yli 40 toistuvaa laajenemislokusta on tunnistettu; monet näistä lokuksista on tunnistettu vasta äskettäin, ja ne liittyvät nyt aiemmin selittämättömiin tiloihin, mukaan lukien pikkuaivojen ataksia, johon liittyy neuropatia ja vestibulaarinen areflexia-oireyhtymä (RFC1) 32 ja myokloninen epilepsia (SAMD12).33 Yleisimmät neurologisia sairauksia aiheuttavat toistuva laajenemislokukset olivat valittiin tutkimukseemme positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden saatavuuden perusteella.

Tässä esitetyt havainnot viittaavat siihen, että ExpansionHunterin pitäisi pystyä luokittelemaan ei-laajentuneet ja laajentuneet alleelit tarkasti missä tahansa toistuvassa laajenemislokuksessa, jos laajentumattomat alleelit ovat pienempiä kuin lukupituus (eli 150 bp). Vaikka useimmissa toistuvissa laajenemislokuksissa on alleeleja, jotka ovat pienempiä kuin 150 emäsparia, kun niitä ei ole laajennettu, joidenkin lokusten, joissa ei-laajentumattoman alleelin koko on lähellä 150 emäsparia (esim. NOTCH2NLC)34, genotyypitys voi olla vaikeampaa tätä lähestymistapaa käyttämällä. Lokuksissa, joissa laajennettu toisto on huomattavasti suurempi kuin lukupituus, koko genomin sekvensointi voi havaita patogeeniset laajennukset (esim. NOP56,35 RFC120,32). Kehittyvät pitkään luetut sekvensointitekniikat voivat tarjota täydentäviä lähestymistapoja suurien laajennusten genotyypitykseen.36

Toistuvien laajentumisten arviointi koko genomin sekvensoinnilla 11 631 diagnosoimattomilla potilailla, jotka oli värvätty 100 000 genomiprojektiin, tuotti 68 potilasta, joilla oli selittäviä löydöksiä. Potilaat rekrytoitiin 100 000 Genomes Projectiin normaalin hoidon geneettisen testauksen jälkeen; siksi tässä kohortissa tunnistettu toistuvien laajentumisten osuus edustaa diagnostisen tuoton nousua standardista NHS-testistä, joka sisältää lokusspesifisen testauksen toistuvien laajenemishäiriöiden, kuten FXN:n tai DMPK:n, varalta. On huomattava, että joitain diagnooseja ei epäilty potilaan kliinisten ominaisuuksien perusteella, mukaan lukien kuusi lapsipotilasta, joilla ei ollut tiedossa suvussa toistuvaa laajentumishäiriötä. Tässä tutkimuksessa kuvatut lapsipotilaiden koko genomin sekvensoinnilla ennustetut keskimääräiset toistuvat laajenemiskoot ovat huomattavasti suurempia kuin aikuisten keskiarvo, mikä on yhdenmukainen sen odotuksen kanssa, että suuremmat laajenemiset liittyvät aikaisempaan ja vakavampaan alkamiseen, jopa lapsilla. Lisätyötä tarvitaan, mutta tämä havainto viittaa siihen, että iästä ja toistuvasta koosta riippuvainen patogeenisuuden arviointi saattaa tukea lasten diagnoosia vähentämällä aikuisten riskialleelien tunnistamisen mahdollista riskiä, ​​mikä johtaa ei-toivottuun ennustavaan testaukseen lapsilla.

Tuloksemme mahdollistavat kliinisen diagnostisen työnkulun koko genomin sekvensointiin (liite p 23). Ehdotamme, että silmämääräinen tarkastus tehdään kaikille laajennetuiksi luokitelluille kutsuille väärien positiivisten havaitsemiseksi ja bialleelisille laajennuksille, joille on havaittu vain yksi laajennettu alleeli (esim. FXN). Suosittelemme, että laboratoriot käyttävät ExpansionHunteria laajenemisen arvioimiseen ilman kokoarviointia ja vahvistavan PCR-testin suorittamista testauksen työnkulun vakiokomponenttina.

Harvinaisiin perinnöllisiin sairauksiin kuuluu laaja valikoima kliinisiä piirteitä, mikä tekee lokuspesifisestä genomitestauksesta tehotonta, vaivalloista ja kallista. Esitämme todisteita siitä, että kliinisen asteen koko genomin sekvensointia, jolla on mahdollisuus diagnosoida joukko harvinaisia ​​neurologisia sairauksia, jotka tyypillisesti esiintyvät yhdellä emäs-, indel- tai kopionumerovariantilla, voitaisiin nyt laajentaa toistuviin laajennuksiin. Koska koko genomin sekvensointi tarjoaa yhden testin, jolla voidaan tunnistaa yleisimmät toistolaajennukset sekä mahdollistaa pistemutaatioiden ja kopiolukuvarianttien testaamisen näihin tiloihin liittyvissä geeneissä samanaikaisesti, se tarjoaa mahdollisuuden tunnistaa useimmat potilaat, joilla on näitä heterogeenisia häiriöitä. joita ei ole diagnosoitu lokuskohtaisilla testeillä. Näiden sairauksien uusien hoitomuotojen aikakaudella varhainen havaitseminen voi olla ratkaisevan tärkeää.37 Nämä tulokset tukevat koko genomin sekvensoinnin toteuttamista toistuvien laajenemien havaitsemiseksi kliinisissä diagnostisissa laboratorioissa. Tämä lähestymistapa on jo sisällytetty NHS England National Genomic -ohjelmaan. Test Directory,38 diagnosoimattoman harvinaisen neurologisen sairauden tutkimiseen.

Viitteet

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et ai. Diagnostinen katto pikkuaivojen ataksiassa ja siihen liittyvissä neurologisissa häiriöissä eksomien sekvensoinnissa. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et ai. Perinnöllinen spastinen paraplegia Kreikassa: aiemmin tutkimattoman populaation karakterisointi seuraavan sukupolven sekvensoinnilla. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola F, Garone G, Stregapede F, et ai. Diagnostinen tuotto kohdistetusta seuraavan sukupolven sekvensointigeenipaneelista lasten liikehäiriöille: 3-vuotinen kohorttitutkimus. Front Genet 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Toistuvat laajenemissairaudet. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporaalinen dementia ja/tai amyotrofinen lateraaliskleroosi. Seattle, WA: Washingtonin yliopisto, 2015.

6 Klockgether T, Mariotti C, Paulson HL. Spinocerebellaarinen ataksia. Nat Rev Dis Primeers 2019; 5:24.

7 Shakkottai EH, Fogel BL. Kliininen neurogenetiikka: autosomaalinen hallitseva spinocerebellaarinen ataksia. Neurol Clin 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Selkärangan ja bulbarin lihasatrofia. Julkaisussa: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et ai., toim. GeneReviews. Seattle, WA: Washingtonin yliopisto, 1999.

9 Gousse G, Natural H, Touraine R, et ai. Tyypin 7 spinocerebellaarisen ataksian tappava muoto, joka alkaa varhain lapsuudessa. Arch Pediatr 2018; 25: 42-44.

10 Ansorge O, Giunti P, Michalik A, et ai. Ataksiini-7 aggregaatio ja ubikvitinaatio infantiilissa SCA7:ssä 180 CAG-toistolla. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 Ramocki MB, Chapieski L, McDonald RO, Fernandez F, Malphrus AD. Spinocerebellaarinen ataksia tyyppi 2, jossa on kognitiivinen regressio lapsuudessa. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N, LaTouche GA, Nelson B, Figueroa KP, Walker RH, Sobering AK. Lapsuudessa alkanut spinocerebellaarinen ataksia 3: kielen dystonia varhaisena ilmentymänä. Vapina Muu hyperkineettinen Mov 2019; julkaistu verkossa 13.9.

13 Bird TD. Myotoninen dystrofia, tyyppi 1. Julkaisussa: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et ai., toim. GeneReviews. Seattle, WA: Washingtonin yliopisto, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. SCA8:n, SCA10:n, SCA12:n, SCA36:n, FXTAS:n ja C9orf72:n toistuvien laajennusten esiintymistiheys SCA-potilailla, jotka ovat negatiivisia yleisimmille SCA-alatyypeille. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et ai. Harvinaisia ​​sairauksia sairastavien potilaiden koko genomin sekvensointi kansallisessa terveydenhuoltojärjestelmässä. Luonto 2020; 583: 96–102.

16 Ashley EA. Kohti täsmälääkettä. Nat Rev Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L, Zheng MY, et ai. Koko genomin sekvensoinnin diagnostinen ja kliininen hyöty kohortissa diagnosoimattomissa kiinalaisperheissä, joilla on harvinaisia ​​sairauksia. Sci Rep 2019; 9: 19365.

18 Mousavi N, Shleizer-Burko S, Yanicky R, Gymrek M. Profiling the genome-wide landscape of tandem repeat expansions. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Tandem-toistojen laajenemisen havaitseminen kohortteissa, jotka on sekvensoitu lyhyellä lukudatalla. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Bennett MF, et ai. Bioinformatiikkaan perustuva laajennettujen toistojen tunnistaminen: ei-referenssiintroninen pentameerilaajennus RFC1:ssä aiheuttaa CANVAS:n. Am J Hum Genet 2019; 105: 151-65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et ai. Kopionumerovariantit kliinisen genomin sekvensoinnissa: harvinaisten ja diagnosoimattomien sairauksien käyttöönotto ja tulkinta. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et ai. Genominlaajuinen tandem-DNA-toistojen havaitseminen, jotka ovat laajentuneet autismissa. Luonto 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. Ihmisen fenotyyppiontologia: työkalu ihmisen perinnöllisten sairauksien merkitsemiseen ja analysointiin. Am J Hum Genet 2008; 83: 610-15.

24 Genomics England. Harvinaisten sairauksien kliiniset tietomallit. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (käytetty 4. elokuuta 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et ai. Pitkien toistuvien laajennusten havaitseminen PCR-vapaasta koko genomin sekvenssitiedosta. Genome Res 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et ai. ExpansionHunter: sekvenssikaaviopohjainen työkalu lyhyiden tandemtoistoalueiden vaihtelun analysoimiseen. Bioinformatiikka 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S, Coldren C, Karunamurthy A, et ai. Standardit ja ohjeet seuraavan sukupolven sekvensointibioinformatiikan putkilinjojen validoimiseksi: Association for Molecular Pathology ja College of American Pathologists yhteinen suositus. J Mol Diagn 2018; 20: 4-27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et ai. Integroiva genomiikan katseluohjelma. Nat Biotechnol 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et ai. Huntingtonin taudin kaltaisen esityksen fenotyyppinen homogeenisuus SCA17-perheessä. Neurology 2006; 67: 1701-03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntingtonin tauti, Huntingtonin taudin ulkonäkö ja hyvänlaatuinen perinnöllinen korea: mitä uutta? Mov Disord Clin Pract 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M, Bennett MF, Degorski P, Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Viimeaikaiset edistysaskeleet toistuvien laajennusten havaitsemisessa lyhyen luettavan seuraavan sukupolven sekvensoinnilla. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A, Simone R, Sullivan R, et ai. Intronisen toiston kaksialleelinen laajeneminen RFC1:ssä on yleinen syy myöhään alkavaan ataksiaan. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 Ishiura H, Doi K, Mitsui J, et ai. Intronisten TTTCA- ja TTTTA-toistojen laajeneminen hyvänlaatuisessa aikuisen familiaalisessa myoklonisessa epilepsiassa. Nat Genet 2018; 50: 581-90.

34 Ishiura H, Shibata S, Yoshimura J, et ai. Koodaamattomat CGG:n toistuvat laajennukset hermosolujen intranukleaarisessa inkluusiotaudissa, okulofaringodistaalisessa myopatiassa ja päällekkäisessä sairaudessa. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Pope K, et ai. Spinocerebellaarisen ataksian 36 nopea diagnoosi kolmen sukupolven perheessä käyttämällä lyhyesti luettavia koko genomin sekvensointitietoja. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Pitkään luettu sekvensointi kehittymässä lääketieteellisessä genetiikassa. Front Genet 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Toistuva laajenemishäiriöt: mekanismit ja terapiat. Neuroterapia 2019; 16: 924–27.

38 Kansallinen terveydenhuoltojärjestelmä. National Genomic Test Directory: harvinaisten ja perinnöllisten sairauksien testauskriteerit. lokakuu, 2021.