Mikä yrtti lisää luun tiheyttä? Cistanche (CPhG) tehostaa osteogeneesiä SIRT2-C/EBP-AREG-reitin kautta

 

 

Osteoporoosion yleinen ortopedinen sairaus, joka vaikuttaa keski-ikäisten ja iäkkäiden ihmisten terveyteen, ja sen ilmaantuvuus on viime vuosina osoittanut nousevaa trendiä [1]. Vuonna 2015 Kiinassa oli 2,69 miljoonaa potilasta, joilla oli osteoporoottisia murtumia, ja tämän määrän odotetaan ylittävän 4,8 miljoonaa vuoteen 2035 mennessä. Hoitokustannukset nousevat kymmeniin miljardeihin juaneihin, mikä muodostaa merkittävän taakan perheille ja yhteiskunnalle [2]. Tutkimus [3] osoittaa, että osteoporoosi liittyy osteoblastien erilaistumiseen. Luun muodostumisen ja luun resorption välinen tasapaino on olennaista luukudoksen uudistumisen ja luun laadun ylläpitämiseksi. Vähentynyt osteogeneesi ja kiihtynyt luun resorptio ovat patologisia mekanismeja, jotka johtavat osteoporoosiin. Osteoblastit ovat vastuussa luumatriisin synteesistä, erityksestä ja mineralisaatiosta ja siten luun muodostumisesta, kasvusta, resorptiosta ja aineenvaihdunnasta [4]. Osteoporoosin hoito edellyttää osteoblastien erilaistumisen ja lisääntymisen edistämistä ja niiden toiminnan parantamista. Siksi osteoblastien erilaistumisen mekanismien selvittäminen on erityisen tärkeää. Tällä hetkellä kliinisessä hoidossa käytetään ensisijaisesti farmakologisia interventioita, kuten antiresorptiivisia lääkkeitä (bisfosfonaatit, selektiiviset estrogeenireseptorin modulaattorit, kalsitoniini, D-vitamiinilisät) ja anabolisia aineita (lisäkilpirauhashormonianalogeja). Pitkäaikainen lääkitys voi kuitenkin johtaa annoksesta riippuvaisiin haittavaikutuksiin. Yleisiä maha-suolikanavan reaktioita ovat pahoinvointi, oksentelu ja ripuli. Vaikka vakavien komplikaatioiden, kuten leuan osteonekroosin ja akuutin munuaisvaurion, yleinen ilmaantuvuus on alhainen, kliinikkojen on tarkkailtava tarkasti niiden riskiä tietyissä populaatioissa (esim. potilailla, joilla on kasvainluun etäpesäkkeitä) [5].

Cistanchella (Cistanche deserticola/tubulosa) on perinteisen kiinalaisen lääketieteen tehtävät virkistävä munuaisten yang ja ravitseva esanssi ja verta. Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset [6] ovat osoittaneet, että Cistanche voi säädellä luun aineenvaihduntaa edistämällä osteoblastien toimintaa ja estämällä osteoklastien toimintaa. Sillä on alhainen toksisuus ja vähän haittavaikutuksia. Rotilla, joilta on poistettu munasarjat, Cistanche-uute voi kääntää luukadon ja estää osteoporoosia. Tutkimus [7] on havainnut, että Cistanchen fenyylietanoidiglykosideilla (CPhG:t), jotka ovat Cistanchen kokonaisglykosidien tärkeimpiä aktiivisia ainesosia, on ainutlaatuisia vaikutuksia luun aineenvaihdunnan säätelyyn, osteoblastien aktiivisuuden lisäämiseen ja osteoklastien toiminnan tukahduttamiseen. Ei ole kuitenkaan raportoitu, säätelevätkö CPhG:t osteogeenista erilaistumista SIRT2-C/EBP-AREG-akselin kautta. Tämä tutkimus tutkii CPhG:iden vaikutuksia ja mekanismeja osteogeeniseen erilaistumiseen tavoitteenaan tarjota teoreettista tukea ja soveltavaa perustaa CPhG:iden käytölle osteoporoosin hoidossa.

1 Materiaalit ja menetelmät

1.1 Materiaalit ja välineet

CPhG:t (ekinakosidi suurempi tai yhtä suuri kuin 40 %, akteosidi/verbaskosidi suurempi tai yhtä suuri kuin 15 %, fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärä Suurempi tai yhtä suuri kuin 80 %, eränro. 20240211) ostettiinXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd. Sopiva määrä CPhG:itä liuotettiin 10 ml:aan soluviljelyalustaa. Täydellisen liukenemisen jälkeen liuos suodatettiin kahdesti 0,22 μm:n mikrohuokoisen kalvon läpi. Osteogeenisiä tai osteoklastisia induktioväliaineita, jotka sisälsivät CPhG:itä, valmistettiin pitoisuuksina 50, 100 ja 200 μmol/l. Kaikki CPhG:tä sisältävät väliaineet valmistettiin juuri ennen käyttöä.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd Cistanche-uutteen erittely

Kalseiini-AM, proteiinikinaasi B (AKT), fosforyloitu proteiinikinaasi B (p-AKT), CCAAT/tehostajaa sitova proteiini (C/EBP), Sirtuin 2 (SIRT2), osteopontiini (OPN), Runtiin liittyvä transkriptiotekijä 2 (RUNX2) ja osteokalsiini (OCN) ostettiin Kiinasta Betechnologyies-vasta-aineista (BiotechnologyS). CO2-inkubaattori ja reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR-laite ostettiin Bio-Radilta (USA). iMark-mikrolevylukija ostettiin Eppendorfilta (Saksa). Lipofectamine 3000 -transfektioreagenssi ostettiin Thermo Fisher Scientificilta (USA). QuikChange Lightning -paikkaohjattu mutageneesipakkaus ostettiin Agilentilta (USA).

Cistanche Ratio ja listaukset myytävänä

 

1.2 Koe-eläimet ja ryhmittely

Kuusikymmentä naaraspuolista C57BL/6-hiirtä ostettiin Sichuanin yliopiston Laboratory Animal Centeristä. Kaikki eläinprotokollat ​​hyväksyi Southwest Medical Universityn eläinetiikkakomitea (20230718-022).

CPhG:n interventiovaikutusten selvittämiseksi osteoporoosiin perustettiin klassinen munasarjan poisto (OVX) malli. Kahdeksan viikon ikäiset hiiret jaettiin satunnaisesti kolmeen ryhmään: Sham (saman tilavuuden rasvakudoksen poisto vain munasarjojen ympäriltä), OVX (kahdenvälinen munasarjan poisto) ja OVX + CPhG:t (kahdenpuoleinen munasarjan poisto + CPhG:t letkuruokinta). Natriumpentobarbitaalilla (50 mg/kg) tehdyn intraperitoneaalisen anestesian jälkeen tehtiin valeleikkaus tai molemminpuolinen munasarjojen poisto steriileissä olosuhteissa. Interventiot aloitettiin 24 tuntia leikkauksen jälkeen. OVX + CPhGs -ryhmä sai CPhG:t letkulla (liuotettuna 0,5 % natriumkarboksimetyyliselluloosaliuokseen, 300 mg·kg-1·d-1); OVX- ja Sham-ryhmät saivat yhtä suuret määrät vehikkeliä letkulla. Interventioita jatkettiin 8 viikkoa. Painoa seurattiin viikoittain. Kaksi kuukautta leikkauksen jälkeen luun muodostumisnopeus arvioitiin käyttämällä kaksoiskalseiinileimausta, ja reisiluuille tehtiin mikro-CT-skannaus (parametrit: 50 kV, 200 μA, 10 μm resoluutio) luun tilavuusfraktion (BV/TV), trabekulaarisen paksuuden (Tb.Sp) (Tb.Sp) kvantitatiiviseksi analysoimiseksi. Leikkauksen jälkeisenä päivänä 60 (yhteensä 8 viikon interventio) kaikki hiiret lopetettiin.

 

1.3 Solukokeet ja ryhmittely

Hiiren pre-osteoblastisolulinja MC3T3-E1 ostettiin yhtiöltä Guangzhou CytoNiche Biotechnology Co., Ltd. Soluja viljeltiin DMEM:ssä, joka sisälsi 10 % naudan sikiön seerumia ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä.

Analysoidakseen CPhG:iden vaikutuksia MC3T3-E1:n osteogeeniseen erilaistumiseen ja SIRT2–C/EBP –AREG-akseliin, jotkut viljellyt MC3T3-E1-solut jaettiin satunnaisesti kontrolliryhmään (NC) ja CPhGs-ryhmään. NC-ryhmää viljeltiin tavanomaisessa osteogeenisessa induktioelatusaineessa, kun taas CPhGs-ryhmää viljeltiin osteogeenisessä alustassa, joka sisälsi 50 μmol/l CPhG:itä.

Sen varmistamiseksi, vaikuttaako SIRT2 C/EBP:n ilmentymiseen MC3T3-E1-soluissa, toinen erä MC3T3-E1-soluja jaettiin satunnaisesti kontrolliin (villityypin MC3T3-E1 ilman CPhG:itä), SIRT2 KD:hen (stabiili SIRT2 knockdown MC3T3-E1) ilman CPhCPhGsG-tyyppiä. MC3T3-E1 käsitelty 50 μmol/l CPhG:llä) ja SIRT2 KD + CPhG (SIRT2 knockdown MC3T3-E1 käsitelty 50 μmol/l CPhG:llä). SIRT2 KD- ja SIRT2 KD + CPhGs -ryhmille SIRT2-knockdown saavutettiin transfektoimalla siRNA sekoitettuna Lipofectamine 3000:een; SIRT2-mRNA-tasot mitattiin qRT-PCR:llä. Kontrolli- ja kontrolli + CPhGs-ryhmille NC-siRNA transfektoitiin ja SIRT2-mRNA-tasot mitattiin.

C/EBP-deasetylaation roolin vahvistamiseksi osteogeenisen erilaistumisen edistämisessä jäljellä olevat MC3T3-E1-solut jaettiin WT- (kontrolli-), K102R-mutantti-, K211R-mutantti- ja CPhGs-käsiteltyihin (EX) ryhmiin. WT-soluja pidettiin tavanomaisessa osteogeenisessa induktioväliaineessa. K102R- ja K211R-ryhmille suunniteltiin asetylaatiokohdan mutanttialukkeet C/EBP:n koodaavan sekvenssin perusteella. Käyttämällä villityypin pcDNA3.1-FLAG-C/EBP:tä templaattina ja QuikChange Lightning -pakkausta, konstruoitiin pcDNA3.1-FLAG-C/EBP (K102R ja K211R) mutantteja. EX-ryhmää viljeltiin osteogeenisessä alustassa, joka sisälsi 50 μmol/l CPhG:tä.

 

Mikä yrtti lisää luun tiheyttä

1.4 Western blot -menetelmä ja immunosaostus proteiinien ilmentämistä varten

PVDF-kalvoja inkuboitiin primääristen vasta-aineiden kanssa yön yli 4 °C:ssa, mitä seurasi HRP-konjugoitu sekundaarinen vasta-aine (vuohen anti-kanin IgG, 1:5 000) huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan. Proteiinijuovat visualisoitiin käyttämällä kemiluminesenssikuvausjärjestelmää, ja -tubuliini (1:1 000) toimi sisäisenä kontrollina suhteellisessa kvantifiointissa. Analyysissä käytettiin ImageJ-ohjelmistoa. Immunosaostukseen käytettiin Pierce IP -lyysipuskuria. Uutteita inkuboitiin vastaavien vasta-aineiden kanssa yön yli 4 asteessa, sitten proteiini A/G agaroosihelmien kanssa 4 tuntia 4 asteessa. Proteiini-A/G-helmet-vasta-aine-antigeenikompleksit saostettiin ja pestiin, sitten eluoitiin SDS-näytepuskurissa 95 asteessa 5 minuutin ajan. Kohdeproteiinit havaittiin Western blot -menetelmällä.

 

1.5 Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR) mRNA-ilmentymistä varten

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä TRIzol-reagenssia. Optinen tiheys aallonpituudella 260 ja 280 nm mitattiin ultramikro-UV-näkyvällä spektrofotometrillä. RNA-konsentraatio laskettiin OD:sta 260 nm:ssä ja puhtaus arvioitiin OD260/OD280-suhteella. cDNA syntetisoitiin käyttämällä HiFiScript cDNA -synteesipakkausta (Vazyme, Nanjing, Kiina). qRT-PCR suoritettiin käyttämällä Ultra SYBR Mixturea reaaliaikaisessa PCR-järjestelmässä. Alukesekvenssit:

OCN, eteenpäin 5'-TCTGACCTCACAGATGCCAAG-3', taaksepäin 5'-AGGGTTAAGCTCACACTGCT-3';

OPN, eteenpäin 5'-CACATGAAGAGCGGTGAGTCT-3', taaksepäin 5'-CCCTTTCCGTTGTTGTCCTG-3';

RUNX2, eteenpäin 5'-GGGACTGTGGTTACCGTCAT-3', taaksepäin 5'-ATAACAGCGGAGGCATTTCG-3';

C/EBP , eteenpäin 5'-CTTCAGCCCGTACCTGGAG-3', taaksepäin 5'-GGAGAGGAAGTCGTGGTGC-3';

GAPDH, eteenpäin 5'-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3', taaksepäin 5'-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3'.
GAPDH:ta käytettiin sisäisenä kontrollina, ja suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää.

 

1.6 Alizarin Red S (ARS) -värjäys

Soluviljelyn jälkeen solut huuhdeltiin PBS:llä ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä 30 minuutin ajan. Niitä värjättiin huoneenlämpötilassa 1-prosenttisella ARS-liuoksella (pH 4,2) 20 minuutin ajan, sitten pestiin toistuvasti ultrapuhtaalla vedellä, kunnes tausta oli kirkas. Kuvauksen jälkeen mineralisoituneet kyhmyt liuotettiin 10-prosenttiseen setyylipyridiniumkloridiliuokseen kvantifiointia varten ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 562 nm.

 

1.7 Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin SPSS 25.0:lla. Mittaustiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± standardipoikkeama. Normaalisti jakautuneille tiedoille käytettiin yksisuuntaista ANOVAa useiden ryhmien vertailuihin, mitä seurasi Tukeyn post hoc -testi parivertailuihin. Ei-normaalisti jakautuneille tiedoille käytettiin Mann-Whitney U -testiä. AP-arvoa < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.

Strateginen huomautus B2B-ostajille, jotka etsivät luotettavia yrttiratkaisuja osteoporoosiin

Avainsanan painopiste: Cistanche-uute, Cistanche-fenyylietanoidiglykosidit (CPhG:t), ekinakosidi, akteosidi/verbaskosidi, osteoblastien erilaistuminen, osteoporoosin yrttiuutteen toimittaja, luuterveyden ravintoaineet, GMP Cistanchen tehdas, Xinjiang Cistanche.

Miksi Cistanche/CPhG:t: Yllä oleva translaatioperuste korostaa CPhG:iden kaksoisvaikutusta, joka edistää osteoblastitoimintaa ja tukahduttaa osteoklastien toimintaa – tukee niiden käyttöä luun terveyteen liittyvissä formulaatioissa, jotka kohdistuvat osteogeneesiin, luumassaan ja mikroarkkitehtuuriin.

Hankinta ja laatu: Ostajat, jotka tarvitsevat yhdenmukaisia ​​CPhG-määrityksiä (esim. ekinakosidi vähintään 40 %, akteosidi vähintään 15 %, fenyylietanoidiglykosidien kokonaismäärä enintään 80 %), etsi GMP-sertifioituja, laajamittaisia ​​ja jäljitettäviä toimitusketjuja.

 

Alan johtava Cistanche-toimittajan esittely

Jos arvioit osteoporoosiin keskittyneiden yrttiuutteiden toimittajia, Chengdu Wecistanche Bio-Tech Co., Ltd (WECISTANCHE) on huomionarvoinen huippukumppani.WECISTANCHEon omistautunut myyntiyhtiöXinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd, ja ryhmän pääkonttori sijaitsee Hotanissa, Xinjiangissa. Yrityksen profiilin mukaan:

Mittakaava ja alkuperä: Perustettu vuonna 2003, pääkonttori Luopu Countyssa, Hotanissa, Xinjiangissa (Cistanche-alkuperä), jolla on 200 000 hehtaarin Cistanche-tukikohta ja maailman suurin Cistanchen jalostustehdas.

Integrated supply chain: Seed breeding base (~20,000 acres), cultivation base (>85 000 eekkeriä), 15 000 tonnia tuoretta Cistanche-keräystä ja -varastointia sekä GMP-tehdas, joka pystyy käsittelemään 20 000 tonnia tuoretta Cistanchea ja muita kasvituotteita.

Sertifikaatit ja laatu: National Health Food GMP-työpaja, China SC, HACCP, IOIA/NOP luomusertifikaatit ja 14 Cistancheen liittyvää keksintöpatenttia (mukaan lukien kalvoerotustekniikka).

 

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

T&K-vahvuus:Professori Pengfei Tun (Pekingin yliopisto) johtama ja pitkäaikainen yhteistyö Pekingin yliopiston TCM Modern Research Centerin, Shanghai Jiao Tong -yliopiston, Shenyangin lääketieteellisen yliopiston, Xinjiangin lääketieteellisen yliopiston, Kioton farmaseuttisen yliopiston ja Kinkin yliopiston kanssa.

Käyttöalue: Uutteet ja valmiit muodot, jotka sopivat TCM-keitteisiin, funktionaalisiin elintarvikkeisiin, terveystuotteisiin, ravintolisäaineisiin, lääkkeisiin ja ihonhoitoon.

Xinjiang Hotan Dicheng Pharmaceutical Biotechnology Co., Ltd

Sosiaalinen vastuu:Tunnustettu panos aavikoitumisen hallintaan ja köyhyyden lievittämiseen Xinjiangissa; suuria Cistanche-tuotteiden lahjoituksia COVID-19:n aikana.

Jos tarvitset teknisiä asiakirjoja, tarjouksia tai yksityisiä tuotemerkkejä/OEM-tuotteita CPhG:stä luun terveydelle, ota yhteyttä WECISTANCHE:

Verkkosivusto:https://www.xjcistanche.com/about-us

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com
 

Osoite:No.1, Floor 26, Unit 1, Building 6, No.133 Sheng'an Street, High-tech District, Chengdu, Sichuan, Kiina (pilot Free Trade Zone)