Eksogeeninen Wnt1 estää akuutin munuaisvaurion ja sen myöhemmän etenemisen krooniseen munuaissairauteen

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5ja Liangxiang Xiao^{3 *}

¹Valtion elinvikojen tutkimuksen avainlaboratorio, Kansallinen munuaissairauksien kliininen tutkimuskeskus, osasto nefrologiasta, Nanfangin sairaalasta, eteläisestä lääketieteellisestä yliopistosta, Guangzhousta, Kiinasta,²Nefrologian laitos, Xiamen Pekingin kiinalaisen lääketieteen yliopistoon liittyvä sairaala, Xiamen, Kiina,³Nefrologian laitos, Zhongshan Xiamenin yliopistoon liittyvä sairaala, Xiamen, Kiina,⁴Endokrinologian ja diabeteksen laitos, ensimmäinen sidosryhmä Xiamenin yliopiston sairaala, Xiamen, Kiina,⁵Patologian laitos, Pittsburghin yliopiston lääketieteellinen korkeakoulu, Pittsburgh, PA, Yhdysvallat

Tutkimukset viittaavat siihen, että Wnt/β-kateniini-agonistit ovat hyödyllisiä hoidettaessaakuutti munuaisvaurio(AKI); se on kuitenkin edelleen vaikeasti ymmärrettävä roolistaan AKI: n ehkäisyssä ja sen eteneminen krooniseen munuaissairauteen (CKD). Tässä tutkimuksessa munuaisten Wnt/β-kateniini signalointi joko aktivoitui eksogeenisen Wnt1:n yli-ilmentymisen kautta tai estyi anto ICG-001:llä, joka on β-kateniinisignaloinnin pienen molekyylin estäjä, ennen hiirille tehtiin iskemia/reperfuusiovamma (IRI) AKI:n ja sen jälkeen CKD: llä. Tuloksemme osoittivat, että eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen ennen IR:ää suojeli hiiriä AKI: tä vastaan ja esti AKI: n etenemisen CKD: ksi hiirillä, kuten todisteena sekä veren biokemialliset että munuaisten histologiset analyysit. Sitä vastoin ICG-001:n esikäsittelyllä ennen ir:tä ei ollut vaikutusta munuaisten Wnt/β-kateniinisignalointiin tai AKI: n eteneminen CKD: ksi. Eksogeenisen Wnt1:n mekanistisesti, in vivo -ilmentyminen ennen kuin IR tukahdutti proapoptoottisten proteiinien ilmentymisen AKI-hiirillä ja vähensi tulehdusvasteet sekä AKI- että CKD-hiirillä. Lisäksi eksogeeninen Wnt1 hypoksia-reoksigenaatiohoidon (H/R) aiheuttama tubulaaristen solujen apoptoosia koeputkessa. Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus tarjoaa näyttöä ennaltaehkäisevän Wnt/β-kateniinin aktivoitumisen vaikutus IR:hen liittyvään AKI:hen ja sen myöhempään etenemiseen CKD: lle.

Asiasanat: akuutti munuaisvaurio, krooninen munuaissairaus, Wnt1, β-kateniini, iskemia-reperfuusiovamma

Hoitoakuutti munuaisvaurio(AKI): cistanche

JOHDANTO

Akuutti munuaisvaurio (AKI)on kliininen tila, joka johtuu munuaisten toiminnan nopeasta menetyksestä eri vammat, kuten lääkkeet, iskemia, sepsis ja toksiinit (Chawla ja Kimmel, 2012; Scholz et ai., 2021). AKI liittyy korkeaan sairastuvuuden ja kuolleisuuden esiintyvyyteen, joka on vastuussa noin 2 miljoonaa kuolemaa vuosittain maailmanlaajuisesti (Belayev ja Palevsky, 2014). Erityisesti AKI on tunnettu riippumaton ennustaja kroonisen munuaissairauden (CKD) tai loppuvaiheen munuaissairauden (ESRD) kehittymiselle, jotka ovat aiheuttaneet valtavan taloudellisen taakan terveydenhuoltojärjestelmälle (Leung et ai., 2013; Belayev ja Palevsky, 2014; Kurzhagen et ai., 2020). Valitettavasti ei ole olemassa tehokkaita lääkkeitä AKI: n ehkäisy ja hoito.

Wnt/β-kateniini-signaloinnilla on keskeinen rooli organogeneesi, kudosten homeostaasi ja kehitys erilaiset sairaudet, mukaan lukien munuaissairaudet (Soni, 2021). β-Cateninilla on kaksi roolia toimimalla molempina rakenteellisina proteiini ja transkription säätelijä (MacDonald et ai., 2009). Kalvoon sidottu β-kateniini on osa kiinnittyjiä risteyskompleksi ja edistää solujen ja solujen vuorovaikutusta, kun taas sytosolinen β-kateniini fosforyloidaan glykogeenillä syntaasikinaasi-3β (GSK-3β) ja suunnattu ubikitinaatioon ja proteasomaalinen hajoaminen. Tällainen hajoaminen on kuitenkin β-kateniinista voitaisiin pelastaa Wnt-ligandeilla, perheellä erittyneistä glykoproteiineista, joilla on erilaisia biologisia toimintoja. Wntin sitoutuminen stabiloituu β kateniinin, joka siirtyy ytimeen ja toimii geenin transkriptiotekijänä asetus. Erityisesti Wnt/β-kateniinisignalointi on suhteellisen hiljennetään vahingoittumattomissa aikuisten munuaisissa, mutta aktivoituu uudelleen aikana akuutti ja krooninen munuaisvaurio (Huffstater et ai., 2020). Wnt/β-kateniinin aktivointi AKI:n alkuvaiheessa vähentää munuaisvaurio ja suosii munuaisten toiminnan palautumista, ottaa huomioon, että jatkuva Wnt/β-kateniinin aktivointi voi ajaa eteneminen AKI: stä CKD: hen (Xiao et ai., 2016; Huffstater et ai., 2020). Siksi Wnt/β-kateniini-signalointi on kaksiteräinen miekka munuaisvauriossa ja ansaitsee paremman ymmärryksen. Erityisesti se on edelleen vaikeaselkoinen Wnt/β-cateniinin roolista aktivointi AKI: n ja sen myöhemmän ehkäisyssä AKI-CKD:n eteneminen.

Munuaisten iskemia-reperfuusiovammaa (IRI) pidetään AKI: n pääasiallinen syy. Siksi munuaisten IRI-eläinmallilla on on yleisesti käytetty AKI: n ja AKI-CKD: n tutkimukseen eteneminen (Bonventre ja Yang, 2011). Molemmat farmakologiset ja geneettisiä lähestymistapoja on käytetty selventämään Wnt/β-kateniinin aktivoinnin rooli AKI:n IRI-malleissa ja CKD, vastaavasti. Litiumin ja GSK-3β:n estäjät ovat käytetään yleisesti Wnt/β-kataniinin farmakologiseen aktivointiin signalointi prekliinisissä AKI-malleissa, mutta se on huomattava niiden β kateniinista riippumattomista vaikutuksista (Bao et ai., 2014). GSK-3β:n, β-kateniinin tai Wnt-ligandien geneettiset modifikaatiot (Wnt1 ja Wnt9a) on käytetty selventämään Wnt/β-kateniinin aktivointi AKI: ssä ja CKD: ssä (Bonventre ja Yang, 2011; Bao et ai., 2014; Zhou et ai., 2013, 2018; Liu et ai., 2020). Siitä huolimatta tutkimukset Wnt/β-cateniinin roolista signalointi AKI: n ehkäisyssä on melko rajallinen. Sitä tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Wnt/β-kateniinisignaation roolia AKI:n ehkäisyssä ja sen myöhemmässä eteneminen CKD: hen.

KUVA 1 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo ilmentyminen ennen ir:tä estää AKI:n ja aktivoi munuaisten β-kateniinia hiirillä

taiHiiren hoitoryhmät. Hiiriä hoidettiin joko pcDNA3 (IRI + pcDNA3) tai PHA-Wnt1 (IRI + PHA-Wnt1) plasmidi hydrodynaamisen hännän laskimoinjektion kautta 2 päivää ennen BIRI:tä. Seerumin kreatiniinitasottaija veren ureatypen (BUN) tasotjamitattiin.(D)Munuaisten morfologian edustavat mikrografit 1 päivän kuluttua BIRI: stä. Munuaisleikkaukset altistettiin Jaksollinen happo–Schiff-värjäys. Laatikkoalueita laajennetaan. Nuolet osoittavat munuaisputkia. Vaakapalkki, 200 μm.(E, F)Munuaisten aktiivisen β-kateniinin läntinen pisteanalyysi hiiristä. *P< 0.05="" versus="" sham="" controls="" (n="5)." †p="">< 0.05="" versus="" iri="" injected="" with="" pcdna3="" plasmid="" (n="">

Cistanche parantaa munuaisten toimintaa

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Eläinten tutkimus

Urospuoliset C57BL/6-hiiret, joiden paino oli noin 22–25 g, olivat ostettu Vital River Laboratory Animal Technologylta (Peking, Kiina) ja ylläpidetään eläinlaitoksessa (lämpötila: 22 ± 2 ◦C, kosteus: 60 ± 5%, 12h tumma/vaalea sykli) Southern Medical Universityssä (Guangzhou, Kiina) vesi ja ruoka ad libitum. Eläinkokeet hyväksyttiin eläinten eettinen ja hyvinvointikomitea Southern Medicalissa Yliopisto. Kaikkia eläimiä hoidettiin Opas koe-eläinten hoitoon ja käyttöön.

AKI: n ja CKD: n induktiota hiirillä kuvattiin aiemmissa tutkimuksissamme (Xiao et ai., 2016; Zhou ym., 2018). Kahdenvälinen munuaisten iskemia/reperfuusiovamma (BIRI) on käytetty laajalti AKI: n indusoimiseen hiirillä, kun taas se lisää kuolleisuutta AKI: n etenemisen aikana CKD: llä. Siksi yksipuolinen munuaisten iskemia/reperfuusio vammaa (UIRI) käytetään etenemistä koskevaan tutkimukseen AKI: sta CKD: hen. Lyhyesti sanottuna keskiviivan vatsan viilto oli valmistettu hiiressä yleisanestesiassa ja kahdenvälisessä tai vasemman munuaisen pedicles leikattiin 30 minuutiksi käyttäen mikroaneurysmin puristimet (tuote nro 18051-35; Hieno tiede Tools, Cambridge, Yhdistynyt kuningaskunta). Leikkauksen aikana keho lämpötila pidettiin noin 37–38◦C:ssa käyttäen lämpötilasäädelty lämmitysjärjestelmä.

Wnt/β-kateniinin aktivaation ennaltaehkäisevän vaikutuksen arviointi AKI:lle hiirille injektoitiin 1 mg/kg hemagglutiniinia (HA)-merkitty Wnt1-lausekevektori (PHA-Wnt1, Upstate Biotekniikka) tai tyhjä vektori (pcDNA3) 2 päivää ennen BIRI käyttäen hydrodynaamiseen perustuvaa geeninsiirtotekniikkaa raportoitu aiemmin (Xiao et ai., 2016). Veri- ja munuaiskudokset kerättiin 1 päivä munuaisten BIRI: n jälkeen.

Varhaisen Wnt/β-kateniinin aktivoitumisen vaikutuksen arviointi AKI: n eteneminen CKD: ksi, hiiret altistettiin joko Wnt1-ilmentymisen päivittäiseen hydrodynaamiseen pyrstölaskimoinjektioon plasmidit 1 mg/kg tai päivittäinen ICG-001:n intraperitoneaalinen injektio (847591-62-2, Chembest, Shanghai, Kiina) lämpötilassa 5 mg/kg 3 päivän ajan ennen UIRI:tä. Veri- ja munuaiskudokset kerättiin 11 päivää UIRI: n jälkeen. Alustavassa tutkimuksessamme 2 päivää Wnt1-injektiota voisi indusoida Wnt1: n ilmentymisen AKI-hiirillä (tiedot eivät näkyy). On huomattava, että 3 päivää Wnt1-injektiota oli valittu varmistamaan ja pidentämään Wnt1: n ilmaisua AKI: n eteneminen CKD: ksi.

Akuutti munuaisvaurio (AKI) on kliininen tila, joka johtuu munuaisten toiminnan nopeasta menetyksestä

Soluviljely ja hoito

Ihmisen proksimaalinen tubulaarinen epiteelisolulinja (HKC-8) oli toimittanut tohtori L. Racusen Johns Hopkinsin yliopistossa (Baltimore, MD, Yhdysvallat). Soluviljelmät suoritettiin aiemmin kuvattu (Zhou et ai., 2013). HKC-8-soluja hoidettiin ihmisen rekombinantin Wnt1 (SRP4754) kanssa; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Yhdysvallat) nopeudella 100 ng/ml tai ICG-001 (847591- 62-2, Chembest, Shanghai, Kiina) 10 μM 4 tunnin ajan. Solut olivat sitten inkuboidaan hypoksiatyöasemalla (X3-CK, Biospherix) klo 1% pO2 48 h: lle. Seuraavaksi soluja hapetettiin uudelleen 2 tuntia ennen kokoelma erilaisia analyysejä varten.

KUVA 2 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo ilmentyminen ennen ir:tä vähentää putkisolujen apoptoosia ja NF-κB-aktivaatiota AKI-hiirillä

taiEdustavat mikrografit osoittavat TUNEL-positiiviset solut eri ryhmissä ohjeiden mukaisesti. Nuolet osoittavat positiivista värjäytymistä. Vaakapalkki, 100 μm.taiGraafisessa esityksessä näkyvät TUNEL-positiiviset solut suurtehokenttää (HPF) kohti eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla.(C–F)Edustavat länsimaiset blot-analyysit osoittavat FasL: n, p53: n ja Baxin munuaisten ilmentymisen eri ryhmät ilmoitetulla tavalla. *P< 0.05="" versus="" sham="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" iri="" injected="" with="" pcdna="" plasmids="" (n="5–6).">(G)Edustava länsimainen läntinen läiskä p65 ja p-p65-proteiinit eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla.

Apoptoosin määritys

Solut trypsinisoitiin, kerättiin ja pestiin PBS:llä. PE-liitteen V värjäys suoritettiin valmistajan protokolla. Sytometrinen analyysi suoritettiin virtaussytometrillä (BD FACSCanto II, San Jose, CA), Yhdysvallat) mitata apoptoosimääriä havaitsemalla liitteessä V olevan positiivisen pe-arvon ja 7-AAD-negatiivisen määrän suhteellinen määrä Solut. Jokainen määritys suoritettiin kolmena kappaleena.

Kreatiniini ja veren ureatyppi Koe

Kreatiniinitasot seerumissa ja virtsassa sekä veren ureassa typpitasot (BUN) mitattiin automaattisella biokemiallinen analysaattori (AU480, Beckman-Coulter Inc., Brea, CA, Yhdysvallat).

Histologia ja immunohistokemiallinen Värjäys

Munuaisleikkaukset ja immunohistokemiallinen värjäytyminen olivat suoritetaan aiemmin kuvatulla tavalla (Liu et ai., 2020). Ensisijaisia vasta-aineita olivat kanin polyklonaalinen anti-Wnt1 (ab15251; Abcam, Inc.), kanin polyklonaalinen anti-β-kateniini (ab15180; Abcam, Inc.) ja kanin polyklonaalinen antifibronektiini (F3648; Sigma-Aldrich).

Western Blot -analyysi

Western Blot -analyysi suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla (Zhou et ai., 2019). Ensisijaiset vasta-aineet sisälsivät kanin polyklonaalinen antifibronektiini (F3648; Sigma-Aldrich), hiiri monoklonaalinen anti-β-kateniinivasta-aine (610154; BD-transduktio Laboratoriot), hiiren monoklonaalinen anti-α-SMA-vasta-aine (A2547; Sigma-Aldrich), kanin polyklonaalinen anti-Wnt1 (ab15251; Abcam), hiiren anti-α-tubuliini (T9026; Sigma-Aldrich), hiiren antiPAI-1-vasta-aine (AF3828; T&K-järjestelmät), antiaktiivinen β kateniini (#05–665; EMD Millipore), anti-Fas ligand (FasL) (SC -6237; Santa Cruz, Kalifornia, Yhdysvallat), s. 53 (#2524S; CST), Bax (SC20067; Santa Cruz), s. 65 (#8242S; CST), p-p65 (#3033S; CST), PCNA (#2586S; CST).

RNA-uutto ja qPCR-analyysi

RNA:n kokonaiseristys ja qPCR suoritettiin kuten aiemminkin kuvattu. Eri geenien mRNA-tasot normalisoitiin β-aktiinin kanssa. Geenien pohjustussekvenssit on lueteltu Täydentävä taulukko 1.

KUVA 3 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo ilmentyminen ennen ir:tä estää AKI:n etenemisen CKD:ksi hiirillä

taiHiiren hoitoryhmät. Hiiret altistettiin joko hydrodynaaminen pyrstölaskimoinjektio 1 mg/kg pcDNA3 (IRI + pcDNA3) tai PHA-Wnt1 (IRI + PHA-Wnt1) plasmidi tai vatsakalvonsisäinen injektio 5 mg/kg ICG-001:tä 3 päivää ennen UIRI: tä. Veri ja kudokset kerättiin 11 päivää UIRI: n jälkeen. Seerumin kreatiniinitasottaija veren ureatypen (BUN) pitoisuudetjamitattiin.(D)Munuaisten morfologian edustavat mikrografit 11 päivän kuluttua UIRI: stä. Munuaisleikkaukset altistettiin jaksoittaiselle happo–Schiff-värjäykselle. Laatikkoalueet ovat laajentunut. Nuolet osoittavat munuaisputkia. Vaakapalkki, 100 μm. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin sem:± keskiarvoina. Tiedot olivat tilastollisesti analysoitu Sigma Stat -ohjelmistolla (Jandel Scientific Ohjelmisto, San Rafael, Kalifornia, Yhdysvallat). Vertailu ryhmien välillä tehtiin yksisuuntaisella ANOVA: lla, jota seuraa Student–Newman–Keuls-testi. P< 0.05="" was="" considered="">

CISTANCHE YRTTI HYÖTY MUNUAINEN

TULOKSET

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin IR estää akuutin munuaisvaurion ja aktivoi munuaisten β-kateniinin hiirillä

Wnt/β-kateniinin aktivoinnin roolin määrittäminen AKI:ssä ennaltaehkäisy, hiiriä annettiin joko HA-merkityllä Wnt1-lausekevektori (PHA-Wnt1) tai tyhjä vektori (pcDNA3) hydrodynaamisen pyrstölaskimon injektoinnilla 2 päivää ennen BIRI:tä(Kuvio 1A). Kreatiniinin ja BUN: n, kahden munuaisvaurion biomarkkerin, seerumin tasot nousivat merkittävästi hiirillä 1 päivä BIRI: n jälkeen, mikä viittaa AKI: n olemassaoloon (kuvat 1B, C). Johdonmukaisesti merkittävät munuaisten morfologiset vauriot, kuten putkimaisia vammoja kortikoiden risteyksessä havaittiin AKI-hiirissä(Kuvio 1D). Erityisesti nämä muutokset seerumissa munuaisvaurion biomarkkerit ja morfologiset vauriot AKI-hiirillä olivat selvästi heikentyneet eksogeenisellä Wnt1: llä. analyysit paljastivat, että eksogeeninen Wnt1 edisti ilmaisua munuaisten β-kateniinista AKI-hiirillä(Kuvat 1E, F). Yhdessä tarkasteltuna, nämä havainnot viittaavat siihen, että eksogeenisen Wnt1: n esikäsittely aktivoi munuaisten β-kateniinia ja estää AKI: n hiirillä.

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin infrapuna vähentää putkimaista kennoa Apoptoosi ja estää ydintä Tekijä-Kappa B-aktivaatio

Tutkia, onko apoptoosin säätely mekanismi eksogeenisen Wnt1:n AKI:hen kohdistuvan suojaavan vaikutuksen taustalla, TUNEL-värjäys suoritettiin apoptoosin tunnistamiseksi AKI-hiirien munuaiskudoksessa. Verrattuna Sham-hiiriin, IRI lisäsi huomattavasti apoptoosinopeutta ja tasoja apoptoosiin liittyvistä proteiineista, kuten FasL, p53 ja Bax, hiirien munuaiset(kuvat 2A–F). Tällaiset muutokset munuaisissa AKI-hiiristä väheni huomattavasti in vivo -ilmentymisellä eksogeenisestä Wnt1: stä ennen IR: tä. Ydintekijä-kappa B (NFκB), erityisesti sen heterodimeerimuoto p65/p50, on kriittinen rooli munuaisten tulehdusvasteen säätelyssä AKI-hiiret. Western blot -analyysi osoitti, että sekä p65 että sen fosforyloitu muoto (p-p65) lisääntyi huomattavasti hiirien munuaiset IRI: n jälkeen, kun taas tällaiset muutokset olivat eksogeenisen Wnt1:n estämä(Kuvio 2G). Nämä havainnot ehdottaa, että eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen ennen IR estää apoptoosia ja estää NF-κB:n aktivaation AKI-hiirien munuaiset.

KUVA 4 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen ennen kuin IR säätelee endogeenistä Wnt1:tä ja β-kateniinia hiirien munuaisissa AKI-CKD:n etenemisen jälkeen

taiEdustavat mikrografit osoittavat Wnt- ja β-kateniiniproteiinin ilmentymisen eri ryhmissä, kuten on osoitettu. Vaakapalkki, 50 μm.(B–E)Edustava länsimainen blot Wnt1:n, β-kateniinin ja aktiivisten β-kateniiniproteiinitasojen analyysit eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla.(F)TGF-β mRNA-ilmentyminen eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen infrapunaa estää etenemisen Akuutti munuaisvaurio krooniseen munuaiseen Sairaus

Seuraavaksi tutkimme, onko Wnt/β-catenin aktivointi ennen kuin IR voi estää AKI: n etenemisen CKD: hen. As näkyyKuva 3A, hiirille tehtiin joko hydrodynaaminen Wnt1-ekspressioplasmidin (PHA-Wnt1) tai ICG-001:n vatsakalvonsisäisen injektion laskimoinjektio 3 päivän kuluttua ennen UIRI:tä. Sekä seerumin kreatiniini- että BUN-tasot olivat lisääntynyt hiirillä 11 päivän kuluttua UIRI:stä(Kuvat 3B, C). Lisäksi Massonin kolmivärinen värjäytyminen paljastui näkyväksi munuaisten kollageenin laskeutuminen ja fibroottiset vauriot hiirillä 11 päivän kuluttua UIRI:stä(Kuvio 3D). Nämä huomautukset ilmoita AKI: n eteneminen CKD: ksi hiirillä sen jälkeen, kun UIRI. Erityisesti seerumin munuaisen havaitut muutokset vamman biomarkkerit ja munuaisten fibroosi CKD-hiirillä olivat lähes kokonaan estetty eksogeenisen esikäsittelyllä Wnt1, mutta ei ICG-001. Sen vuoksi in vivo -ilmentyminen eksogeeninen Wnt1 ennen infrapunaa estää etenemisen AKI CKD: lle hiirillä.

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin IR down-säätelee endogeenistä Wnt1 ja β-kateniini munuaisissa

Tutkimme edelleen eksogeenisen Wnt1: n vaikutusta endogeeninen Wnt/β-kateniinisignalointi CKD-hiirien munuaisissa. Kuten kuvassa 4A on esitetty, immunohistokemiallinen värjäytyminen paljastui että sekä endogeeninen Wnt1 että β-kateniini olivat selvästi säädeltyjä hiirien munuaisissa 11 päivän kuluttua IRI:stä. Niiden proteiini tasoja vähennettiin huomattavasti eksogeenisen esikäsittelyn avulla Wnt1, mutta ei ICG-001. Länsimaiset blot-analyysit vahvistivat eksogeenisen Wnt1: n, mutta ei ICG-001: n, estävä vaikutus Wnt1:n, β-kateniinin ja aktiivisen β-kateniinin endogeeninen ilmentyminen CKD-hiirien munuaisissa (kuvat 4B–E). Wnt/β-kateniini ja TGF-β signalointireitit ristikuuluvat munuaisfibroosissa. TGF-β mRNA-ilmentyminen indusoitiin munuaisissa CKD-hiiret, ja eksogeeniset vähensivät tällaista induktiota Wnt1, mutta ei ICG-001 (kuva 4F). Siksi eksogeenisen Wnt1:n esihoito estää endogeenistä munuaisten Wnt/β-kateniinia signalointi CKD-hiirillä.

KUVA 5 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen ennen ir:n säätelyä alentaa munuaisten Wnt/β-kateniinin kohdegeenien säätelyä hiirillä AKI-CKD:n etenemisen jälkeen

(A, B)mRNA PAI-1: n ja MMP-7: n ilmentyminen eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla.(C–E)Edustavat länsimaiset läntiset sulkuanalyysit PAI-1- ja Klotho-proteiinitasoista.(F)mRNA Klothon ilmaisu. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin IR alentaa munuaisten sääntelyä Wnt/β-catenin kohdegeenit hiirissä

Verrattuna Sham-hiiriin, PAI-1: n mRNA-ilmentyminen ja MMP-7, kaksi suoraa Wnt/β-kateniinin kohdetta alavirtaan signalointi, oli merkittävästi säädelty hiirien munuaisissa 11 päivän kuluttua UIRI:stä(Kuvat 5A, B). Esikäsittely eksogeeninen Wnt1, mutta ei ICG-001, esti PAI-1: n ja MMP-7: n mRNA: n ilmentymisen CKD-hiirillä. Läntisen läiskän analyysi osoitti, että PAI-1-proteiinitasot nousivat munuaisissa CKD-hiiristä, joissa ne on poistettu esikäsittelyllä eksogeeninen Wnt1, mutta ei ICG-001(Kuvat 5C, D). Klotho on endogeeninen Wnt-antagonisti sitomalla ja sitomalla Wnt-ligandit. Verrattuna Sham-hiiriin, molemmat mRNA ja Klothon proteiinitasot laskivat munuaisissa hiiret 11 päivän kuluttua UIR:stä(Kuvat 5E, F). Esikäsittely eksogeeninen Wnt1, mutta ei ICG-001, lähes kokonaan kunnostettu Klotho mRNA: n ja proteiinien ilmentyminen CKD-hiirien munuaisissa. Nämä havainnot viittaavat edelleen siihen, että eksogeeninen Wnt1 endogeenisellä Wnt/β-kateniinin signaloinnilla CKD-hiirien munuaiset.

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin IR vähentää munuaisten fibroosia Hiiret akuutin munuaisvaurion jälkeen-krooninen Munuaissairauden eteneminen

Seuraavaksi tutkimme Wnt/β-kateniinin aktivoitumisen vaikutusta ennen IR: tä munuaismatriisigeeneissä ja fibroottisissa vaurioissa CKD-hiirillä. Verrattuna Sham-hiiriin, fibronektiinin mRNA-ilmentyminen (FN), kollageeni I, kollageeni III ja α-SMA indusoitiin selvästi hiirien munuaisissa 11 päivän kuluttua UIR: stä(Kuviot 6A–D). Tällaisia muutoksia vähensi eksogeenisen esikäsittely Wnt1, mutta ei ICG-001. Länsimainen blot-analyysi osoitti, että FN: n ja α-SMA: n proteiinitasot nousivat merkittävästi CKD-hiirien munuaiset, ja tällaiset muutokset poistettiin eksogeenisen Wnt1: n, mutta ei ICG-001: n esikäsittely(Kuviot 6E– G). Eksogeenisen Wnt1: n ja ICG-001: n vaikutukset FN: ään proteiinien ilmentyminen CKD-hiirillä validoitiin munuaisilla immunostainointi FN-vasta-aineella(Kuvio 6H). Nämä havainnot viittaavat siihen, että eksogeenisen Wnt1:n esikäsittely estää munuaisten fibrogeneesi IR: n aiheuttamissa CKD-hiirissä.

KUVA 6 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo ilmentyminen ennen infrapunasäteilyä vähentää munuaisfibroosia hiirillä AKI-CKD:n etenemisen jälkeen

(A–D)fibronektiinin mRNA-ilmentyminen, kollageeni I, kollageeni III ja α-SMA.(E–G)Edustavat länsimaiset pisteanalyysit fibronektiinistä ja α-SMA-SMA-proteiinitasoista.(H)Fibronektiinin immunostainointi munuaisten osat. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01;="" †p="">< 0.05.="" n="5." scale="" bar,="" 50="">

Eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen Ennen kuin IR vaimentaa munuaisten tulehdusta Akuutin munuaisvaurion jälkeen-krooninen munuainen Taudin eteneminen

Verrattuna Sham-hiiriin, mRNA-ilmentyminen tulehdukselliset geenit, kuten IL-1, IL-6 ja TNF-α, olivat merkittävästi säädelty hiirien munuaisissa 11 päivän kuluttua UIR(kuvat 7A–C). Tällaiset muutokset olivat lähes kokonaan poistettu esikäsittelyllä eksogeeninen Wnt1, mutta ei ICG-001. Western blot -analyysi osoitti, että molempien P65:n proteiinitasot ja sen fosforyloitu muoto (p-p65) lisääntyi huomattavasti hiirien munuaiset 11 päivän kuluttua UIRI:stä, mikä osoittaa aktivoitumisen NF-κB-signaloinnista CKD-hiirillä(Kuvat 7D–F). Eritoten eksogeenisen Wnt1: n, mutta ei ICG-001: n, esikäsittely merkittävästi alentunut p65- ja p-p65-proteiinitasot munuaisissa CKD-hiirillä. Nämä havainnot osoittavat, että eksogeenisen Wnt1: n esikäsittely estää munuaisten tulehdusvasteet CKD-hiirillä.

KUVA 7 | Eksogeenisen Wnt1:n in vivo ilmentyminen ennen kuin IR vaimentaa munuaisten tulehdusta hiirillä AKI-CKD:n etenemisen jälkeen

(A–C)IL-1: n, IL-6: n mRNA-ilmentyminen, ja TNF-α hiirien munuaisissa.(D–F)Edustavat länsimaiset pisteanalyysit p65- ja p-p65-proteiinipitoisuuksista. *P< 0.05;="" **p="">< 0.01.="" n="">

Eksogeeninen Wnt1 suojaa putkimaisia soluja Apoptoosia vastaan, jonka indusoi Hypoksia-reoksigenaatiovamma in vitro

Wnt1:n roolin määrittämiseksi edelleen AKI:ssa perustimme AKI:n HKC-8:n putkimaiset solumallit, joissa käytetään hypoksia-reoksigenaatiota (H/R) hoito. Virtaussytometriaa käytettiin apoptoosin havaitsemiseen ja se paljasti apoptoosinopeuden nousun HCK8-soluissa H/R-hoidon jälkeen(Kuvat 8A, B). Eksogeeninen Wnt1 huomattavasti alentunut apoptoosi HCK-8-soluissa H/R-hoidon jälkeen. Western blot -analyysit osoittivat, että H/R-hoito on merkittävää lisäsi apoptoosiin liittyvien proteiinien, kuten FasL: n, tasoja, p54, Bax ja Parp-1 HCK-8-soluissa(Kuvat 8C–G). Sellainen muutoksia vähensi eksogeeninen Wnt1. Nämä tiedot ehdottaa, että eksogeeninen Wnt1 suojaa H/R:n aiheuttamalta apoptoosi putkimaisissa soluissa.

KUVA 8 | Eksogeeninen Wnt1 suojaa putkimaisia soluja hypoksia-reoksigenaatiovaurion (H/R) aiheuttamalta apoptoosilta in vitro

taiEdustavat FACS-analyysit osoittaa, että Wnt1 esti hypoksian/reoksigenaation (H/R) aiheuttaman soluapoptoosin. HKC-8-solut eristettiin esieksyntyneinä eksogeenisen Wnt1:n kanssa, minkä jälkeen inkubointi hypoksiset olosuhteet 48 tunnin ajan ja sitten reoksigenointi 2 tunnin ajan.(B) Grafiikkaesitys näyttää apoptoottisten solujen prosenttiosuuden eri ryhmissä ilmoitetulla tavalla. Sitä PE-merkityt annexin V -positiiviset solut laskettiin virtaussytometrialla. *P< 0.05="" versus="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" h/r="" (n="3).">jaEdustava länsimainen blot analyysit osoittavat FasL:n, p53:n, Baxin ja Parp-1:n proteiinien ilmentymisen HKC-8-soluissa.(D–G)Graafiset esitykset osoittavat FasL: n, p53: n, Baxin ja Parp-1 HKC-8-soluissa. *P< 0.05="" versus="" controls;="" †p="">< 0.05="" versus="" h/r="" (n="">

KESKUSTELU

Vaikka AKI:n esiintyvyys kasvaa ja se on suurin riski tekijä etenemiselle CKD: ksi, tehokkaita hoitoja ei ole AKI:n ehkäisyyn ja hoitoon. Useita tilanteita, kuten sydänkirurgia, putkimaiset kerrostumat ja antaminen nefrotoksisista lääkkeistä, voi johtaa AKI: n kehittymiseen (Mas-Font et ai., 2017). Tämä korostaa ennaltaehkäisevän toiminnan tarvetta AKI: n toimenpiteet.

Vaikka lukuisat tutkimukset tukevat myönteisiä vaikutuksia Wnt/β-kateniinin aktivaatio AKI: n patogeneesissä, se pysyy vaikeasti havaittavissa Wnt/β-kateniini-agonistien ennaltaehkäisevästä vaikutuksesta AKI:ssa. Yksi uusi havainto tässä tutkimuksessa on, että in vivo eksogeenisen Wnt1: n ilmentyminen ennen kuin ir voisi suojata hiiriä AKI: tä vastaan ja estä AKI: n eteneminen CKD: hen. In vivo eksogeenisen Wnt1: n ilmentyminen 2 päivää ennen munuaisten kahdenvälistä Ir pystyi aktivoimaan munuaisten β-kateniinia, mikä johti vähenemiseen munuaisten apoptoosi ja tulehdus AKI-hiirillä (1 päivä IR: n jälkeen). Lisäksi eksogeenisen Wnt1:n in vivo -ilmentyminen 3 päivän kuluttua ennen munuaisten yksipuolista IR:tä inhiboi endogeenistä Wnt/β-kateniinia signalointi ja estänyt munuaisfibroosin kehittymisen CKD-hiiret (11 päivää IR: n jälkeen). Sitä vastoin in vivo -ilmaisu eksogeeninen Wnt1 5 päivän kuluttua munuaisen ir:n osoitti indusoivan β kateniinin aktivaatiota ja nopeuttaa AKI: n etenemistä CKD: n etenemiseen (Xiao et ai., 2016). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että ajoitus Wnt/β-kateniini-agonistit ovat tärkeä tekijä, kun niitä käytetään AKI:n ehkäisyyn ja hoitoon.

Tutkimukset viittaavat siihen, että Wnt/β-kateniinin jatkuva aktivaatio signalointi voisi ajaa AKI: n etenemisen CKD: hen. ICG001 estää selektiivisesti Wnt/β-kateniinia/CREB:tä sitovaa proteiinia (CBP) signalointi ja on parhaillaan kliinisessä tutkimuksessa eri Syöpiä. Olemme aiemmin osoittaneet, että ICG-011:n antaminen 5 päivän kuluttua siitä, kun IR palautti munuaisten toiminnan ja esti AKI: n eteneminen CKD: ksi, mistä on osoituksena munuaisten väheneminen, mistä on osoituksena munuaisten väheneminen fibroosi (Xiao et ai., 2016). Lisäksi ICG-001:n antaminen alkaen 3 päivää sen jälkeen, kun yksipuolinen virtsaputken tukkeuma (UUO) oli pystyy vaimentamaan munuaisten fibroottisia vaurioita CKD:n UUO-malleissa hiiret (Hao et ai., 2011). Tämä tutkimus osoitti kuitenkin, että ICG-001:n esikäsittely 3 päivää ennen infrapunavaikutusta munuaisten Wnt/β-kateniinisignaloinnista tai AKI:n etenemisestä CKD: llä. Tämä ei ole yllättävää, koska Wnt/β-kateniini-signalointi ilmaistaan hyvin alhaisina pitoisuuksina vahingoittumattomissa aikuisten munuaisissa (Tan et ai., 2014). Tilintarkastustuomioistuimen havainnot viittaavat kuitenkin siihen, että ajoitus ja ICG-001:n antamisen kesto on ratkaisevan tärkeää sen määrittämiseksi terapeuttinen tulos.

Wnt/β-kateniinin suojaavan vaikutuksen taustalla olevat mekanismit voi sisältää apoptoosin ja eloonjäämisreittien modulaation. Tubuluksen β-kateniinin geneettinen ablaatio edistää putkimaista apoptoosia IRI:n tai foolihappokäsittelyn jälkeen, kun taas aktivaatio Wnt/β-kateniini tukahduttaa apoptoottisia proteiineja (Wang et ai., 2009; Zhou et ai., 2012). Tässä tutkimuksessa eksogeeninen Wnt1 esti merkittävästi putkisoluapoptoosia molemmissa IRI:ssä AKI: n ja H / R: n aiheuttamien solumallien hiirimallit AKI: stä. Tämä viittaa siihen, että apoptoosi voi olla mahdollinen mekanismi eksogeenisen Wnt1:n AKI:hen kohdistuvan ennaltaehkäisevän vaikutuksen taustalla ja AKI CKD: n etenemiseen. Tämä tutkimus osoitti myös eksogeenisen Wnt1:n estävä vaikutus NF-κB-aktivaatioon sekä AKI että CKD, mikä osoittaa tulehduksellisen suppression vastaus. On kuitenkin huomattava, että vähennetäänkö tulehdus on toissijainen vaikutus suojaan tai eksogeenisen Wnt1:n välittämät suojamekanismit jäävät jäljelle määritettävä. Lisätutkimuksia tarvitaan selvyyden selvittämiseksi tarkka mekanismi eksogeeniselle Wnt1-välitteiselle suojaukselle AKI: tä vastaan ja AKI: n estämisestä CKD: n etenemiseen.

Käytä Wnt/β-kateniinimodulaattoreita AKI: n ja CKD: n estämiseen ja hoitoon

JOHTOPÄÄTÖS

Yhteenvetona voidaan todeta, että tämä tutkimus tarjoaa todisteita, jotka tukevat Wnt/β-kateniinin aktivoinnin ennaltaehkäisevä vaikutus IR:hen liittyvään AKI:hen ja CKD:hen, vaikka tarkan selvittämiseksi tarvitaan enemmän työtä mekanismit, joilla eksogeeninen Wnt1 suojaa AKI:ltä ja CKD: llä. Kun otetaan huomioon Wnt/β-kateniinisignaloinnin kaksoisrooli AKI:ssä ja CKD, tämä tutkimus korostaa ajoituksen merkitystä kun käytetään Wnt/β-kateniinimodulaattoreita ehkäisyyn ja AKI: n hoito. Tulevat tutkimukset, joissa käytetään farmakologisempaa ja geneettiset lähestymistavat sekä optimaalinen hoidon ajoitus ja kesto on perusteltu Wnt/β-kateniinin vaikutuksen tutkimiseksi agonistit AKI: n ehkäisyssä ja hoidossa.

ALKAEN: Eksogeeninen Wnt1 estää akuutin munuaisvaurion ja sen myöhemmän etenemisen krooniseen munuaissairauteen,Xue Hong^1†, Yanni Zhou^2†, Dedong Wang^3†, Fuping Lyu⁴, Tianjun Guan³, Youhua Liu^1,5ja Liangxiang Xiao^{3 *}

Rintama. Physiol., 8. marraskuuta 2021 | https://doi.org/10.3389/fphys.2021.745816