Mitkä ovat Cistanche-polysakkaridin edut immuunitoiminnalle

Ota yhteyttä: emily.li@wecistanche.com

Cistanche-polysakkaridin immunologinen aktiivisuus ja mekanismi

Zeng Qunli, Zheng Yifan, Lu Zhiliang

[Abstrakti]Tavoite: TutkiaimmuunitoimintaCistanchePolysakkaridi(CDPS) ja sen mekanismiimmuunisäätely in vitro. Menetelmät: CDPS:n säätelyvaikutuksen tarkkailuun käytettiin tiatsolisinisen kolorimetristä menetelmää (MTT).Cistanche-polysakkaridi) IQS DEX TNF:llä, joka estää hiiren kateenkorvan lymfosyyttien proliferaatiota in vitro; CDPS (Cistanche-polysakkaridi) käytettiin solusyklin ja solusyklin analyysin suorittamiseen virtaussytometriaa käyttäen. Intrasellulaarisen Ca2:n määritys. Tulokset: CDPS (Cistanche-polysakkaridi) korkeammalla pitoisuudella voi vastustaa ISQDEX:n estävää vaikutusta lymfosyyttien lisääntymiseen ja korkean pitoisuuden TNF:n estävää vaikutusta lymfosyyttien lisääntymiseen ja synergisoida pienen pitoisuuden TNF:n proliferaatiota edistävää vaikutusta lymfosyyteihin; 100 ug/ml 200 ug/ml CDPS (Cistanche-polysakkaridi) voi merkittävästi lisätä solujen määrää jakautumisvaiheessa; korkeampi pitoisuus (100 ug/ml) CDPS (Cistanche-polysakkaridi) voi merkittävästi edistää Ca-ionin pitoisuutta hiiren tymosyyteissä. Johtopäätös: CDPS (Cistanche-polysakkaridi) voi edistää solujen siirtymistä jakautumisvaiheeseen, ja päätellään, että sen edistävä vaikutus hiiren kateenkorvan lymfosyyttien lisääntymiseen liittyy sen kalsiumin vapautumisen edistämiseen hiiren kateenkorvan lymfosyyteissä.

Cistanche(CistancheDeserticolaYC Ma) on harvinainen ja arvokas kiinalainen lääkemateriaali maassani. Se on listattu ylimmäksi arvosanaksi "Shen Nong's Materia Medicassa".Cistanchesen tehtävänä on ravita verta, ravita munuaisia ​​ja auttaa yangia, kosteuttaa suolistoa ja hidastaa ikääntymistä. Nykyaikainen farmakologinen tutkimus osoittaa tämänCistanchePolysakkaridivoi parantaa kehoaimmuunitoiminto, edistää DNA-synteesiä, vahvistaa fyysistä voimaa, parantaa älykkyyttä ja sillä on ilmeisiä ikääntymistä estäviä vaikutuksia [1]. Kirjoittaja tutki CDPS:n säätelyä(Cistanche-polysakkaridi), polysakkaridikomponenttiCistanche, päälläimmuunitoimintohiiren lymfosyyteistä.

Cistanche-polysakkaridiedistäminenleviäminenlymfosyytit

1 Materiaali ja menetelmät

1.1 Reagenssit ja lääkkeet.

RPM, I 1640 alusta: GIB-CO; HEPES: FARCO; L-glutamiini: Shanghai Dongfeng Reagent Factory; Penisilliini ja streptomysiini: North China Pharmaceutical Factory; Concanavalin (ConA), MTT: SIGM A Company; Phytohemagglutinin (PHA): Shanghai Medical Laboratory; Isoproterenoli (ISO): Shanghai Tianfeng Pharmaceutical Factory; Merkaptoetanoli: Fluka Company; Vastasyntyneen vasikan seerumi: Sijiqing Bioengineering Company; Deksametasonin (DEX) esitteli tohtori Ma Liang, Zhejiangin yliopiston lääketieteellisen korkeakoulun ensimmäinen osasairaala; Kasvaimen suppressoritekijän (TNF) tarjosi Yu Yuehan, professori, solujen laitos, School of Life Sciences, Zhejiangin yliopisto; Loput reagenssit ovat kaikki kotimaisia ​​analyyttisiä laatuja.

1.2 Koeeläimet.

ICR-hiiret, urospuoliset, 68 viikkoa vanhat, painovat 18-20g, 22, ostettiin Zhejiang Experimental Animal Centeristä.

1.3 Cistanche-polysakkaridin uuttaminen [2]:

CistanchePolysakkaridiuutetaan laboratoriossamme! Raakalääkkeen murskaamisen jälkeenCistanche, se upotetaan kuumaan etanoliin, uutetaan kiehuvaan veteen ja saostetaan etanoliin. Neutraali entsyymi yhdistettynä Sewag-menetelmään proteiininpoistoon, anionin DEAE-Sephadex A- 50 -vaihtokromatografiaan ja Sephacry S-200 -geelisuodatuskromatografiaan CDPS:n yksittäisen komponentin saamiseksi (Cistanche-polysakkaridi)). Pidä kuivana, käytä epätäydellistä RPMI1640:tä tietyn pitoisuuden saavuttamiseksi ennen käyttöä ja steriloi ultrasuodatuksella

1.4 Pernan ja kateenkorvan lymfosyyttien valmistaminen [3]:

The mice were sacrificed by neck removal. The spleen or thymus was taken aseptically and sieved through a 200-mesh steel mesh. The Hanks solution containing porridge newborn calf serum was used to prepare a single-cell suspension. After centrifugation at 1500 r/min for 10 min, red blood cells were lysed with 0.01 mol/L Tris-NHCl hypotonic solution for 1 min, and then washed with Hanks liquid centrifugation. Finally, the cells were suspended in RPMI1640 containing 10% fresh calf serum for complete culture Solution (containing 2 mmol/LL glutamine, 100 mmol/L sodium pyruvate, 1 mmol/L mercaptoethanol, add penicillin 100 U/ml and streptomycin 100 μg/ml just before use), trypan blue count, live For cells>93, säädä pernasolujen pitoisuus arvoon X 10 /ml ja tymosyyttien pitoisuus arvoon × 10 astetta /ml

1.5 Lymfosyyttien lisääntymisreaktio:Mosmanmnin menetelmän [4] mukaan parannus: 96-kuoppasoluviljelylevy, lisää 10/ml pernasolususpensiota tai vettä 10/ml tymosyyttisuspensiota 100M1 ja eri konsentraatioita lääkkeitä 10041 jokaiseen kuoppaan. Viljele CO2,37C:n inkubaattorissa 72 tuntia. Lisää 8 μ1 MTT:tä (5 mg/ml) jokaiseen kuoppaan 4 tuntia ennen viljelyn päättymistä. Viljelyn lopussa imetään 150"1 supernatanttia kustakin kuopasta ja lisätään 0,5 N isopropanolihydrokloridia 150M1. Ravista varovasti mikroravistelijalla, jotta siniset kiteet liukenevat kokonaan. Mittaa OD570 mikrolevynlukijalla. Aseta jokainen koe. pisteen kolmena rinnakkaisena kuopana.

1.6 Solusykliin kohdistuvan vaikutuksen määrittäminen [5]:

{{0}}kuoppasoluviljelylevy, lisää 4 10 astetta/ml tymosyyttisuspensiota 1 ml jokaiseen kuoppaan, lisää erilaisia ​​reagensseja ja polysakkaridiliuosta 2 ml:aan vahvassa CO:ssa, 37 inkubaattoria 72 tunnin viljelyn jälkeen sentrifugoi 1500 r/min 15 minuutin ajan, hävitä supernatantti, lisää 7 ​​ui etanolia saostuneiden solujen kiinnittämiseksi, säilytä 4 °C:ssa valmiustilatestausta varten, pese solut kahdesti PBS:llä, sentrifugoi nopeudella 1500 r/min 15 minuuttia, hävitä Supernatantti ja lisää Kun 0,5 ml 0,1 RNaasiA:ta oli digestoitu 4 °C:ssa 30 minuuttia, 50 ug/ml bromiasetaattia värjättiin 30 minuuttia 4 °C:ssa, ja solunäytteiden fluoresenssin intensiteetti mitattiin FACScan-virtaussytometrillä. Jokaiselle näytteelle kerättiin 10,000 solutestipistettä, ja datassa käytettiin Mul-tricycle-ohjelmistoanalyysiä.

1.7 Solunsisäisen kalsiumionipitoisuuden määrittäminen [6]

Ota hiiren tymosyytit samalla tavalla kuin edellä. Suspensoi epätäydelliseen RPMIl640-viljelyalustaan ​​ja säädä solukonsentraatio arvoon × 10'/ml. Lisää 1 ml tymosyyttisuspensiota ja 1 µM jokaiseen koeputkeen Fluo-3AM-värjäysliuos 5 µ1, 2 % F-275 µ1, 37 °C:ssa 30 minuutin inkubaation jälkeen, pese kahdesti epätäydellisellä RPM1640:llä, 1500r/ min, sentrifugoi 10 minuuttia, hylkää supernatantti ja lisää eri pitoisuuksia polysakkarideja ja polysakkarideja saostettuihin soluihin ConA:n jälkeen fluoresenssin intensiteetti mitattiin FACScan-virtaussytometrillä. Jokaisesta näytteestä kerättiin 10,{16}} solutestipisteen tiedot ja analysoitiin CELLQUEST-ohjelmistolla. 1.8 Varianssianalyysissä käytettiin tilastollisia menetelmiä ja solusykli ja kalsiumionimittaus analysoitiin virtaussytometrin ohjelmistolla.

Cistanche-polysakkaridi cistanche deserticolasta

2 tulosta

2.1 Cistanche-polysakkaridi in vitro estää hiiren kateenkorvan lymfosyyttien lisääntymistä ISO DEX TNF:llä

Adrenergisen reseptorin agonisti isoproterenoli (ISO) ja lisämunuaiskuoren hormoni deksametasoni (DEX) estävät lymfosyyttien proliferaatiota CDPS.Cistanche-polysakkaridi) korkeammalla pitoisuudella (75 125ug/ml) voi vastustaa ISO DEX:n estävää vaikutusta lymfosyyttien lisääntymiseen (P<0.01) as="" shown="" in="" figure="" 1.="" tumor="" necrosis="" factor="" (tnf="" β)="" on="" lymphocytes="" at="" high="" concentration="" cdps="">Cistanche Polysakkaridi) (125 ug/ml) korkeammalla pitoisuudella voi vastustaa TNF:n estävää vaikutusta ja edistää synergistisesti lymfosyyttien lisääntymistä alhaisella TNF-pitoisuudella (kuva 2)

2.2 Cistanche Polysakkaridi säätelee kateenkorvan lymfosyyttisykliä

CDPS (CistanchePolysakkaridi) 25ug/ml 100ug/ml 200#g/ml kolme pitoisuutta vaikutti hiiren kateenkorvan lymfosyytteihin 72 tunnin ajan, DNA-pitoisuus soluista mitattiin FACS:lla ja proliferaatioindeksi (PI) laskettiin kaavan mukaan. Tulokset osoittavat, että sekä 100 ug/ml että 200 ug/ml voivat merkittävästi lisätä solujen määrää jakautumisvaiheessa, ja molempien proliferaatioindeksi (68,0 prosenttia, 56,6) on merkittävästi korkeampi kuin kontrolliryhmällä (44,6) ja 200 ug/ml. ryhmä on hieman pienempi kuin 100 ug/ml ryhmässä, koska pitoisuudella 200 ug/ml sen vaikutus solujen lisääntymiseen on tullut laskevaksi [7]. PI-arvo (47,5 prosenttia) 25 ug/ml:n ryhmässä ei ollut merkittävästi korkeampi kuin kontrolliryhmän.

2.3 Cistanche-polysakkaridin vaikutus kalsiumionipitoisuuteen hiiren tymosyyteissä

Kokeelliset tulokset osoittavat, että korkeampi pitoisuus (100 ug/ml) CDPS (Cistanche-polysakkaridie) voi merkittävästi edistää kalsiumionipitoisuuden nousua hiiren tymosyyteissä Verrattuna kontrolliryhmään, on merkittävä ero (P<0.01), and="" there="" is="" a="" certain="" effect="" relationship="" with="" the="" action="" time="" (figure="">

3 Keskustelu

Cistanche, joka tunnetaan yleisesti nimellä"aavikon ginseng", on kuiva, hilseilevä mehevä varsiCistanche.Cistanchesillä on ravitseva munuaisyang, ravitseva essenssi, veri ja suoli. Se kuuluu eräänlaiseen aivolisäke-lisämunuaiskuoren jännitykseen tai sillä on lisämunuaiskuoren kaltainen hormonivaikutus. Arvokas kiinalainen lääketiede, joka voi säädelläimmuunitoimintokehosta. Aiemmat tutkimustuloksemme osoittavat, että CDPS (Cistanche-polysakkaridi) in vitro voivat edistää kateenkorvan T-lymfosyyttien lisääntymistä, joita ConA PHA ei ole aktivoinut tai aktivoinut. Yhdessä ConA PHA:n kanssa on olemassa kahdenlaisia ​​T-solustimulaattoreita, uskomme, että CDPS (Cistanche-polysakkaridi) on T-solujen huonojuvantti, ja havaitsimme myös, että CDPS (Cistanche-polysakkaridi) voivat lisätä merkittävästi hiiren pernan lymfosyyttien eritystä suuremmilla pitoisuuksilla [8]

Joissakin tutkimuksissa on havaittu, että rekombinantti-TNF voi aiheuttaa normaalien hiiren ja ihmisen T-lymfosyyttiklustereiden apoptoosia in vitro, ja IIL{0}} IL-1 IFN-4 voi mahdollisesti estää tämän vaikutuksen. deksametasonin (DEX) kanssa Se voi estää lymfosyyttien lisääntymistä estämällä lymfosyyttien ilmentymistä ja IL-2:n eritystä ja säätelemällä korkean affiniteetin IL-2R:n tuotantoa. Tässä kokeessa havaittiin, että korkeampi CDPS-pitoisuus (CistanchePolysakkaridi) voivat vastustaa TNF:n korkean pitoisuuden vaikutuksia lymfosyyttien lisääntymiseen. Esto, synergistinen TNF:n alhaisen pitoisuuden kanssa edistääkseen lymfosyyttien lisääntymistä ja voi estää ISQ DEX:n estävän vaikutuksen lymfosyyttien lisääntymiseen. Nämä vaikutukset ovat juuri CDPS:n kautta (CistanchePolysakkaridi) edistää T-lymfosyyttien proliferaatiota ja ovat autokriinisiä T-solujen IL{0}} ja muiden sytokiinien loppuunsaattamiseksi.

Viime vuosina on tehty paljon tutkimuksia kasvipolysakkaridien immunofarmakologisista vaikutuksista, mutta vain vähän tutkimuksiaimmuunipolysakkaridien säätelymekanismi, erityisesti lymfosyytteihin vaikuttavien polysakkaridien signaalinvälitysreitti Ca2:n toisena lähettinä. Ei ole raporttia. Tämä kokeilu suoritti alustavaa tutkimusta tällä alueella. Solunsisäisiä signalointimolekyylejä ovat cAM R Ca, IP3 DG cGMP jne., joiden joukossa Ca":lla on erittäin tärkeä fysiologinen vaikutus soluihin. Solunsisäisen Ca²-pitoisuuden nousu on tärkeä ilmiö lymfosyyttien aktivaation ja proliferaation alkuvaiheessa. Tämä prosessi tapahtuu pääasiassa ensimmäisten kymmenien sekuntien tai minuuttien aikana, kun stimulaattorit aktivoivat soluja. Klassinen tapa aktivoida T-soluja on fosfatidyyli-inositoli (PIB) fosfatidyylilihaksen metaboloimiseksi. Alkoholin metaboliitti 1,4.5-inositolitrifosfaatti (IP3) voi edistää sisäverkkoon varastoidun Ca":n vapautumista sitoutumalla sisäverkon reseptoreihin, lisäämällä solunsisäisen Ca2-tasoa ja solunsisäisen Ca:n pitoisuutta. * lisää. Korkea voi edistää NF-AT:n (aktivoitujen T-solujen nudeic factor) tuotantoa, jälkimmäinen edistää IIL-2-geenin ilmentymistä.Kokeet osoittavat, että korkeampi pitoisuus (100 ug/ml) ) CDPS:stä (CistanchePolysakkaridi) on tehokas 5 10 min. Aika vaikuttaa merkittävästi Ca*-pitoisuuden lisäämiseen hiiren tymosyyteissä, ja sillä on synergistinen vaikutus ConA:n kanssa. Siksi spekuloimme, että CDPS (Cistanche-polysakkaridi) edistää kalsiumin vapautumista hiiren kateenkorvan lymfosyyteissä solunsisäisen kalsiumionipitoisuuden lisäämiseksi. Lisäys edistää IL-2-geenin ilmentymistä ja johtaa T-solujen lisääntymiseen, mikä on yksi teoreettisista perusteista.CistanchePolysakkariditsäätelevä vaikutus kehoon

Cistanche-polysakkaridi

Viitteet

1. IN XiuHin, SU Yuke (Yleinen farmakologisen tutkimuksen tilanneCistancheSka 【J】. Perinteiset kiinalaiset ja yrttilääkkeet ((kiinalainen kasviperäinen lääke). 1993.24(10. 550-552(kiinaksi))

2. ZHANG Weijiee (yhdistepolysakkaridin [M] biokemiallinen tekniikka. Hangzhou Zhejiang University Press (Zhejiang University Press), 1994.16-17 (kiinaksi)

3. MA Bo- (Ma Baoli). Immunologiatekniikka【M1. Shanghai Medical University Press (Shanghai Medical University Press), 1984 188-190. (n kiinalaisia))

4. Mosmann T. Rapilolomeerinen määritys kasvun ja eloonjäämisen helpottamiseksi proliferaatioon ja sytotoksisuuden poistoon [JJ Immun Meth.1983, 6 55- 58.

5. WU is-hi, WU shailing, Acai-n, et al (Wu Jiahui, Wu Shuibing. Li Carian jne.), Sinin vaikutus syklisten solujen lisääntymiseenimmuunielinanalyysi virtaussytometriaa käyttäen [J]. Chinese immunology (Chinese Journal of Immunology), 1994, 10x5: 278-281. (Kiinassa)

6. TAO aksiini. JIYong-yong, GAO Qi-rong ym. (Tao Jiaxian, Ji Yongpu Gao Qirong jne.). FACS-analyysi solunsisäisen C2:n muutoksista elaktivaation aikana [J] Chinese Journal of Immunology (China Journal of Immunology), 1993, 9 (2): 97-10L. (kiinaksi)

7. ZENGQu-li.MAO Jum-hao, LU, kuten; Puhdistus d polysakdaridiCistancheDeserticolaYC Mfa ja sen immunomoduloivat vaikutukset Tellfunction[J].burnal of Zhejiang Medical University (Journal of Zhejiang Medical University), 1998.27 (3: 108-111. (kiinaksi)

8. Sarin A, Michelle C C. Perre AH Cytotoxic Efed of TNF and Lymphotoxin on T Lymphoblak. J Immunol, 1995, 1553716-3721.