Kaksi ihmisen aineenvaihduntaa pelastaa C. Elegansin mallin Alzheimerin taudista sytosolisen laskostumattoman proteiinivasteen kautta Ⅱ

Kuva 3 Karnosiini ja kinureenihappo estävät A 42 toksisuus acistanche malli AD (GMC).In vivo -seulontastrategia endogeenisten metaboliittien tunnistamiseksi, jotka estävät A 42 yhdistäminen on kuvattu (a). Seuloimme kuusi tunnistettua ehdokasmetaboliittia acistanche malliAlzheimer's sairaus. Metaboliitteja (kuvattu M:nä) syötettiin GMC-matojen L4-vaiheessa ja niiden vaikutukset arvioitiin aikuisiän päivänä 5 (i) liikkuvuuden avulla.määritys, joka määrittää kokonaisuudenkuntomatoista liikkuvuuden muutoksilla mitattuna kehon taipumisena minuutissa (BPM) ja (ii) NIAD{0}}värjäytyneen A:n kvantifiointi 42 aggregaattia (seulontatiedot näkyvät lisäkuvassa 1). Paneelitb–g näytä kinureenihapon ja karnosiinin karakterisointi pelastaaksesi acistanche AD malli. Paneelit (b jac) näyttää matojen liikkuvuuden mitattuna kehon taivutuksina minuutissa (BPM)Y-akseli vs. aikuisuuden päivät päälläX-akseli, käsitelty kasvavilla pitoisuuksilla karnosiinia (sininen) ja kinureenihappoa (punainen) verrattuna käsittelemättömiin matoihin (musta). Lisääntynyttä lyöntitiheyttä havaittiin madon elinkaaren aikana aina 15 vuoteen astiµM karnosiinia ja kinureenihappoa (b jac). Motiliteetti aikuisiän viidentenä päivänä, jolloin A.:n fenotyyppiset ilmentymät 42 ovat näkyvästi GMC-matossa, on signififiparantunut huomattavasti lisäämällä karnosiinia 15:eenµM ja kinureenihapolle 10µM (d jae). Tutkakaavio näyttää kokonaisuudenkunto/cistanche nopeuden funktiona, mutkat per minuutti (BPM) ja live-suhde, joka näkyy jokaisella sen akselilla (d jae). Aggregaattivärjäytyminen määritettiin sen jälkeen, kun matoja oli inkuboitu amyloidogeenispesifisen väriaineen NIAD-4 kanssa (f–g) (asteikkopalkki, 80μm). Valkoiset nuolet paneeleissa (f–g) osoita NIAD{0}}värjättyä A:ta 42 aggregaattia, jotka näyttävät väriltään oranssinpunaisilta. Kaikissa testatuissa pitoisuuksissa karnosiinikäsittelyn merkitfifihillitsi voimakkaasti A 42 aggregaatio verrattuna GMC-matoihin, kuten kuvassa (f). N2-kontrollimadot, jotka eivät ilmennä A 42, näytetään vertailua varten (asteikkopalkki, 80μm). Kuten karnosiini, aggregaatio A 42 esti kynureenihappokäsittelyllä, kuten kuvassa (g). Aggregaattien NIAD-4-seulonnassa noin 15–23 eläintä analysoitiin tilakohtaisesti GMC (AD) matojen ja∼10 eläintä per kontrolli (N2) mato. Kynureenihapon ja karnosiinin hyödylliset vaikutukset havaittiin vuonnan = 3 biologisesti riippumatonta koetta. Kaikki virhepalkit edustavat keskiarvon standardivirhettä (SEM). Tilastot suoritettiin käyttämällä yksisuuntaista ANOVAa, Dunnett's useita vertailuja käsittelemättömään A 42 ryhmä GraphPad Prismillä,p-arvot on merkitty tontteihin.

Kuva 4 Karnosiinilla ja kinureenihapolla ei ole suoria vaikutuksia A:han 42 yhdistäminen.2:n aggregoinnin kineettiset profiilitμM A 42 näytekarnosiinin tai kinureenihapon (esitetty eri väreillä) poissaolo (musta) ja lisääntyvien pitoisuuksien läsnäolo. AggregointiprosessiA 42 ei ole merkkififijommankumman metaboliitin läsnäolo kiihdyttää tai hidastaa voimakkaasti (korkeammat metaboliittien pitoisuudet 20, 50, 100 ja 500μM on esitetty lisäkuvassa 3). Virhepalkit ilmaistaan ​​kolmen teknisen toiston standardipoikkeamana.

Napsauta tätä saadaksesi lisätietoja siitä, kuinka Cistanche kohtelee AD:ta

Karnosiini ja kinureenihappo eivät suoraan estä A42-aggregaatiota. Sen testaamiseksi, voisiko karnosiini tai kinureenihappo estää suoraan A 42 yhdistämisen, teimme ThTflfluoresenssia sitova kemiallinen kinetiikkamääritys (katso"menetelmät" jakso). Emme kuitenkaan havainneet näiden kahden metaboliitin suoria vaikutuksia A:n aggregaatioon 42, ainakin testaamamme suhteellisen laajalla pitoisuusalueella (kuva 1).4 ja täydentävä kuva 3), jotka sisältävät fysiologisesti merkityksellisiä, mikä osoittaa, että läsnä pitäisi olla toinen mekanismi, joka toimii aggregaattien poistamiseksi. Koska tämän mekanismin läsnäolo ei sulje pois sitä mahdollisuutta, että muilla endogeenisillä metaboliiteilla voi olla suora vaikutus A 42 yhdistäminen, mahdollisestimuodostavat itse aggregaatteja tai edistävät A:n faasierottelua 42 sytoplasmassa, ehdotamme, että se on hyvinmielenkiintoista testata muiden endogeenisten metaboliittien tällaista suoraa vaikutusta proteiinien aggregaatioon.

Cistanchen vaikutus

Karnosiini ja kinureenihappo lisäävät HSF{0}}- ja molekyylikaperonien tasoja. Tämän jälkeen tutkimme karnosiinin ja kinureenihapon vaikutuksia HSF{0}}:n, HSR:n pääsäätelijän, ilmentymiseencistanche. HSF-1 tehostaa lämpösokkiproteiinigeenejä, jotka toimivat molekyylikaperoneina ylläpitäen normaalia proteiinin konformaatiota solustressin aikana, laskostuvat uudelleen väärin laskostuneet proteiinit ja kohdistavat peruuttamattomasti vaurioituneita proteiineja hajoamista varten.42–44 (Kuva.5 ja täydentävä kuva 5). Käytimme tunnistamiseen validoitua vasta-ainettacistanche HSF-1 immunosaostuksella ja massaspektrometrialla45, HSF{0}}:n tutkimiseen karnosiinilla tai kynureenihapolla käsiteltyjen matojen lysaateista. Havaitsimme kohonneita HSF-1-tasoja molemmilla metaboliiteilla hoidon jälkeen (kuva 1).5a). HSF{0}}-tasot nousivat annoksesta riippuvalla tavalla vasteena sekä karnosiini- että kynureenihappohoidolle (kuva 1).5a). Vuonnacistanche kahdella metaboliitilla käsiteltyä lysaattia havaitsimme HSF-1 -vyöhykkeen kohdassa∼100 kDa. HSF-1 säätelee ensisijaisesti molekyylikaperoneja koodaavien geenien ilmentymistä, erityisesti lämpösokkiproteiineja HSP90, HSP70 ja HSP40, jotka toimivat HSP70:n kochaperoneina.46–48. Tarkastelimme HSF{0}}-säädeltyjen chaperonien tasoja ja havaitsimme, että HSP90- ja HSP70-tasot olivat kohonneita GMC-madoissa, joita hoidettiin 15μM-kinureenihappo, mutta ei 15μM-karnosiini verrattuna käsittelemättömiin GMC-matoihin ja villityypin matoihin (kuva 1).5b, c). Sekä DNJ-12 että DNJ-19 osoittivat kohonneita tasoja vasteena karnosiini- ja kynureenihappohoitoon verrattuna hoitamattomiin GMC-madoihin ja hoidettuihin villityypin N2-madoihin (kuva 1).5d, e). Sitä vastoin emme havainneet merkkejäfifiDNJ{0}}-tasot eivät voi muuttua metaboliittikäsittelyn aikana (kuva 1).5f). DNJ-12 ja DNJ-19 ovat luokan A J-proteiinin (HSP40) kochaperoneja, jotka on karakterisoitu in vivo ja in vitro niiden proteiinien hajoamistoimintojen vuoksi, jotka edistävät organismin terveyttä.48. J-proteiineilla on myös aiemmin karakterisoitu olevan disaggregaasiaktiivisuutta acistanche polyQ-malli, jossa luokan A (DNJ-12 ja DNJ-19) ja B (DNJ-13) kompleksoidut J-proteiinin rinnakkaissaperonit mahdollistavat hajautustoiminnan yhdistämällä HSP{{5} } ja HSP-70 sekä erikseen että synergistisessä yhteistyössä48,49. Tietomme viittaavat siihen, että HSF{0}}-tason nousu karnosiini- ja

kinureenihappo edistää molekyylikaperonien ja kochaperonien, erityisesti DNJ-12 ja DNJ-19, lisääntynyttä tasoa poistamaan A 42 aggregaattia. Sitten kysyimme, johtuivatko muutokset proteiinitasoissa muuttuneesta transkriptiosta suorittamalla reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (RTqPCR). Ei merkkiäfifiei voi kertaistaa muutoksia mRNA-tasoissahsf- 1, daf-21,jahsp-70 havaittiin jommallakummalla metaboliitilla hoidon jälkeen. Proteiinitietojemme mukaisesti havaitsimme kuitenkin, että mRNA-tasotdnj-12 jadnj-19 lisääntyivät molemmilla metaboliiteilla. Kiehtovaa mRNA-tasot fordnj-13 oli myös kohonnut karnosiinissa, mutta ei kinureenihapolla hoidetuissa matoissa, huolimatta siitä, ettei merkkififiproteiinitasolla havaittiin kallistusmuutoksia (kuva 1).6a). Kysyimme lisäksi, laukaisevatko nämä metaboliitit ER:hen liittyvän UPR:n (UPRER) tai mitokondriot (UPRmt) tutkimalla mRNA-tasojahsp-4jahsp-6, UPR:n kanoniset merkitERja UPRmt, vastaavasti50,51. Ei ollut mitään merkkejäfifiei voi muuttaa näissä kahdessa markkerissa verrokkeihin verrattuna (kuva 1).6b), jolloin nämä vasteet suljetaan pois aggregaattien puhdistumisen taustalla olevista mekanismeista tässä tutkimuksessa. Sen määrittämiseksi, estävätkö karnosiini- ja kinureenihappohoito A 42 myrkyllisyys ja aggregaatio HSF-1 ja

Kuva 5 Karnosiini ja kinureenihappo aktivoivat sytosolisen laskostumattoman proteiinivasteen HSF-1--riippuvaisen mekanismin kautta.Western blot -tutkimukset osoittavat proteiinitasojen erilaista nousua hoidettaessa kahdella metaboliitilla (a–f). Karnosiinilla ja kynureenihapolla hoidettaessa havaitsemme molekyylikaperonien ja niiden kochaperonien proteiinitasojen suhteellista nousua matolysaateissa verrattuna kontrolleihin, käsittelemättömään N2:een ja GMC:hen.n = ∼3000 matoa per tila; mittasimme 3–4 toistoa per ehto; vain edustava Western blot -tutkimus esitetään jokaiselle tilalle. Kuvassa kuvatuista kokeista.3, merkkififiliikkuvuuden lisääntyminen ja vastaava lasku NIAD{0}}värjäytyneiden aggregaattien määrässä havaittiin annoksella 15μmolempien metaboliittien M. Kaikki virhepalkit kuvaavat keskiarvon standardivirhettä (SEM).a–f näytä HSF-1, alavirran molekyylikaperonien ja J-proteiinien nauhat eli HSP-90, HSP-70, DNJ-12, DNJ-19 ja DNJ{{ 5}} sekä N2 (villityyppi) että GMC (AD-malli) matoille. Jokaisessa Western blot -kokeessa käytimme tubuliinisignaalia proteiinin kokonaispitoisuuden normalisoimiseksi kussakin kaistassa. Sitten normalisoimme chaperone/co-chaperone-nauhan jokaisen tilan vastaavalla tubuliinivyöhykkeellä samasta kokeesta, joka ajettiin rinnakkaisessa geelissä, intensiteettien kuvaamiseksi ImageJ:ssä. Kunkin tilan geelit ajettiin vastaavasti samaan aikaan käyttäen samaa ajopuskuria, samassa elektroforeettisessa kennossa ja samassa Western blot -siirtosandwichissa kalvoille. Näitä kalvoja kehitettiin edelleen käyttämällä sopivia vasta-aineita (katso"menetelmät" osa, täydentävä kuva 5). Tilastot suoritetaan GraphPad Prismissa käyttäen tavallista yksisuuntaista ANOVAa; käytimme Dunnettia's useiden vertailujen testi käsittelemättömän (H2O) kanssa jokaiselle N2- ja GMC-metaboliitilla käsitellylle ryhmälle;p-arvot on ilmoitettukuvaalipaneelit.

Sähköposti:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950