TUNEL Assay: Tehokas työkalu munuaisvaurion arviointiin

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakti:Terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP nick-end leimaus (TUNEL) -määritys on pitkään vakiintunut määritys, jota käytetään havaitsemaan solukuolemaan liittyvää DNA-fragmentaatiota (3'-OH DNA-päät) endonukleaasien toimesta. Koska nämä entsyymit ovat erityisen aktiivisia munuaisissa, TUNELia käytetään laajasti DNA-fragmentaation ja solukuoleman tunnistamiseen ja kvantifiointiin viljellyissä.munuainen solut sekä eläinten ja ihmisten munuaiset, jotka ovat seuraustamyrkyllinen tai hypoksinen vamma. TUNELin varhainen karakterisointi apoptoottisena määrityksenä on johtanut lukuisiin väärintulkintoihinmunuaissolu vahinkoa.Siitä huolimatta TUNELista on tulossa yhä suositumpimunuaisvaurioarviointi, koska sitä voidaan käyttää yleisesti viljellyissä ja kudossoluissa sekä kaikissa solukuoleman mekanismeissa. Lisäksi se on herkkä, tarkka, kvantitatiivinen, helposti liitetty tiettyihin soluihin tai kudososastoihin, ja se voidaan yhdistää immunohistokemian kanssa mahdollistamaan solutyyppien tai todennäköisten solukuoleman mekanismien luotettavan tunnistamisen. Perinteisesti TUNEL-analyysi on rajoittunut TUNEL-signaalin olemassaoloon tai puuttumiseen. Lisätietoa solukuoleman mekanismista voidaan kuitenkin saada TUNEL-kuvioiden analyysistä.

seksuaalisen kiihottumisen munuaishäiriön hoito cistanche-lisäjauheella

Johdanto DNA on ainoa molekyyli solussa, joka voidaan korjata, mutta sitä ei voida täysin syntetisoida uudelleen vaurion jälkeen. DNA:n tuhoutuminen on yksi monivaiheisen solukuolemaprosessin viimeisistä vaiheista, joka on mahdollisesti palautuva terminaaliseen DNA-fragmentoitumiseen asti. Siksi jälkimmäinen on peruuttamattoman solukuoleman yleinen ominaisuus ja mekaaninen merkki [1,2]. Solukuolemaan liittyvä DNA-fragmentaatio "visualisoidaan" tavallisesti terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP:n nick-end labeling (TUNEL) -määrityksellä, DNA-ladderingilla tai komeettamäärityksellä [3]. Pulssikenttäelektroforeesi [4] ja satunnaisoligonukleotidipohjainen synteesi (ROPS) [5] ovat kaksi muuta harvoin käytettyä toissijaista määritystä. Komeettamäärityksen käyttö rajoittuu vain in vitro (viljeltyihin soluihin), ja sen kvantifiointi on työvoimavaltaista [6]. Komeettamääritysten suorittaminen eristetyissä soluytimissä on mahdollista, mutta siihen liittyy muita hämmentäviä tekijöitä ytimien eristämisen aikana. Toinen, DNA laddering -määritys, ei ole kvantitatiivinen menetelmä, ja alkuperäinen toive siitä, että tikapuukuvio vs. sively tekisi eron apoptoosin ja nekroosin välillä, karkasi, koska tämä lähestymistapa osoittautui epäluotettavaksi [7]. Kolmesta päämenetelmästä TUNEL on herkin, vähiten aikaa vievä ja yleisimmin sovellettavissa oleva. Sitä voidaan käyttää viljellyissä soluissa ja kudoksissa sekä kaikissa solukuolemamekanismeissa. Se on tarkka, kvantitatiivinen, helposti yhdistettävissä tiettyihin soluihin tai kudososastoihin, ja se voidaan yhdistää immunohistokemian kanssa mahdollistamaan TUNEL-positiivisiin signaaleihin liittyvien solutyyppien tai soluvaurion mekanismien luotettavan tunnistamisen [2].

TUNELilla mitattavissa olevia DNA-katkoja tuottavat pääasiassa apoptoottiset endonukleaasit. Munuaisten aktiivisimmat endonukleaasit ovat deoksiribonukleaasi 1 (DNaasi I) ja endonukleaasi G (EndoG) [8–10]. DNaasi I on aktiivisin ja runsain apoptoottinen endonukleaasi nisäkkäissä [11]. Munuaiset, sylkirauhaset, haima ja suoli ovat elimiä, joiden tiedetään tuottavan suuria määriä DNaasi I:tä. Epiteelisolut sylkirauhasissa, haimassa ja suolessa erittävät DNaasi I:tä ruoansulatusentsyyminä ruoansulatuskanavassa. Jotkut solujen DNaasi I taistelee "vieraa" DNA:ta vastaan, joka tunkeutuu isäntäsoluihin [12]. Ei-erittynyt DNaasi I muodostaa piilotetun vaaran isäntäsolun DNA:lle, mutta normaalisti DNaasit eivät vaikuta isäntäsolun DNA:han ennen solun vaurioitumista tai kuolemaa. Munuaisissa DNaasi I:tä erittävät putkimaiset epiteelisolut, oletettavasti virtsan ja bakteerien tuhoamiseksi. Tämä toiminto tapahtuu todennäköisesti yhdessä proteinaasien, erityisesti mepriinin, kanssa, joka on virtsan tärkein proteinaasi [13]. Vaikka se suojaa infektiota vastaan, erittäin aktiivisen DNaasin läsnäolo munuaisissa tekee tästä elimestä alttiita vaurioille, jolloin DNaasin aktiivisuuden tiedetään olevan sytotoksista isäntäsoluille. DNaasit edistävät toksisten tai hypoksisten ärsykkeiden aiheuttamaa solukuolemaa ja tuhoavat kaikki solukuoleman seurauksena vapautuneet isäntämunuaisen DNA-solut.

Munuaisetovat suodatuselimiä, jotka poistavat myrkyllisiä yhdisteitä kehosta. Korkea DNaasi I -aktiivisuus munuaisissa tekee munuaissoluista erittäin herkkiä myrkyllisten yhdisteiden ja niiden aineenvaihduntatuotteiden aiheuttamille vaurioille. Tämä tekee TUNELista sopivimman ja soveltuvimman menetelmän munuaisvaurion mittaamiseen. Tässä katsauksessa keskitymme TUNELiin laajalti käytettynä, informatiivisena ja tarkana määrityksenä solukuoleman ja kudosvaurion mittaamiseksi munuaisissa. Keskustelemme TUNELin näkökohdista, koska se koskee munuaissairauksia ja vammoja, ja tunnistamme TUNELin ominaisuuksia, tekniikoita ja vajaakäytettyjä ominaisuuksia edistääksemme tämän tehokkaan määrityksen tuottavaa ja asianmukaista käyttöä munuaissairauksien tutkimuksessa, diagnostiikassa ja hoidossa. Keskustelemme myös erilaisista TUNEL-kuvamalleista, jotka voidaan yhdistää solukuoleman mekanismeihin. Tässä katsauksessa esiin tuodut seikat soveltuvat laajasti TUNELin käyttöön muissa elimissä kuin munuaisissa.

Avainsanat:TUNEL; solukuolema; munuaiset; DNAaasit; endonukleaasit; kudosvaurio

TUNEL-periaatteetTUNEL-määrityksen kehittivät vuonna 1992 Gorczyca et ai. [14] ja Gavrieli et ai. [15] käyttäen fluorokromi- ja avidiiniperoksidaasileimausta, vastaavasti. Tuolloin oli kipeä tarve uusille menetelmille apoptoosin arvioimiseksi, ja TUNEL täytti tämän aukon onnistuneesti. Alun perin markkinoituna määritysmenetelmänä DNA-juosteen katkeamisille apoptoosin aikana [14,16], mutta parempien määritysten puuttuessa, TUNELista tuli nopeasti standardimääritys apoptoosille [17,18]. Tutkijat huomasivat kuitenkin melkein välittömästi, että TUNEL mittasi umpimähkään DNA-fragmentoitumista, ei vain apoptoosiin liittyvää [19–21]. Siitä huolimatta apoptoottisten määritysten tarve oli niin suuri, että harvinaiset raportit TUNELin epäspesifisyydestä apoptoosille jätettiin yleensä huomiotta. Tämä johti valtavaan määrään vääriä positiivisia raportteja munuaisten ja muiden elinten apoptoosista siinä määrin, että jopa 2 0 prosenttia kaikista soluista raportoitiin apoptoottisiksi jopa ilman vaurioita [22–25], kun muutoksia Pieni kuin 0,01 prosenttia voisi olla tilastollisesti merkittävä todiste kudosvauriosta.

TUNEL-määritys on kokenut renessanssin viime vuosina sen jälkeen, kun apoptoositutkimusten nousukausi päättyi muutama vuosi sitten. PubMed-hakumme aikakauslehtiartikkeleista, joissa käytettiin termejä "munuainen" ja "TUNEL", tuotti yli 1500 tulosta vuosina 1992–2020. Vuonna 2019 julkaistiin 170 artikkelia, mikä on suurin määrä yhdessä vuodessa viimeisten 28 vuoden aikana (kuva S1) ja muodostavat suurimman osan tässä katsauksessa tutkituista artikkeleista. Lukuisat tutkimukset käyttivät TUNEL-positiivisuutta yleisenä mittana DNA-fragmentoitumiseen liittyvästä solukuolemasta muun tyyppisessä solukuolemassa apoptoosia lukuun ottamatta. Esimerkiksi ferroptoosi, äskettäin löydetty ohjelmoidun, ei-apoptoottisen solukuoleman muoto, jonka laukaisee oksidatiivinen vaurio, joka tapahtuu munuaisiskemia-reperfuusion (IR) aikana hiirillä, voidaan havaita TUNELilla [26]. Pyroptoosin, joka on ohjelmoidun solukuoleman tulehduksellinen muoto, joka eroaa apoptoosista ja nekroosista, on osoitettu liittyvän TUNEL-positiivisiin signaaleihin [27,28]. TUNEL-positiivisuutta havaittiin nekroptoosin aikana, mikä vaikutti munuaistiehyiden solujen asteittaiseen vähenemiseen rotilla, joille tehtiin subtotal nefrektomia [29]. Munuaisissa ja muissa kudoksissa positiivisia TUNEL-signaaleja on löydetty nekroosista [30,31], säätelemättömästä autofagiasta [32–35], anoikista [36,37], mitoottisesta katastrofista [35,38], autolyysistä [39], pautolyysistä. [39], proptoosi [40] ja aponeuroosi [30], jotka osoittavat, että TUNEL on todella universaali määritys peruuttamattomaan solukuolemaan.

TUNEL-määritys perustuu 3'OH-päiden leimaamiseen 3'OH-päälle spesifisellä DNA-entsyymillä, terminaalisella deoksinukleotidyylitransferaasilla (TdT) (kuva). DNA-polymeraasin tai Klenow-fragmentin DNA-polymeraasin käyttö TdT:n sijasta voi auttaa määrittämään 3'OH-päiden tyypin (halkeamia, aukkoja tai ulkonevia oligoja), koska DNA-polymeraasit tarvitsevat templaatin (vastakkainen DNA-juoste) eivätkä siten leimaa. roikkuvat tai ulkonevat DNA-päät. On tärkeää muistaa, että 3ZOH-DNA-päiden tuotanto ei ole ainutlaatuista apoptoottisille (DNA:ta hajottaville) endonukleaaseille. 3'OH-DNA-päät ovat tärkeä "kommunikaattori"-signaali, yhteinen nimittäjä useimmille DNA-entsyymeille. Niitä tuottavat ja käyttävät lähes kaikki eukaryoottien DNA-entsyymit, mukaan lukien DNA:n korjaus (apuriini/apyrimidiini, AP) endonukleaasit, eksonukleaasit, DNA-polymeraasit, DNA-ligaasit, DNA-transferaasit ja topoisomeraasit. Lisäksi 3'Id 3z-sokeri- tai 3z-proteiinikonjugaatit voidaan muuntaa 3'OH-päiksi fosfataasien, glykosylaasien ja proteinaasien toimesta. Tästä syystä tarkka ymmärrys siitä, mitä mitataan, on välttämätöntä TUNELin onnistuneen soveltamisen ja sen tulosten tulkinnan kannalta.

Verrattuna kahteen muuhun DNA-fragmentaation mittausmenetelmään, DNA-tikapuun ja komeettamääritykseen, TUNELilla on se etu, että se perustuu DNA-päiden tunnistamiseen fragmenttien sijaan (kuva 2). Teoreettisesti TUNEL voi olla herkempi ja lineaarisempi alkuperäisen (alhaisen) DNA-fragmentaation tunnistamisessa kuin DNA-tikkaat tai komeetta, joilla molemmilla on pienten, erittäin liikkuvien fragmenttien kerääntymisen viivejakso. Joka tapauksessa tutkimuksissa, joissa TUNEL yhdistetään joko komeetan )41,42] tai DNA-portaiden [43,44] kanssa, on jonkin verran etua varhaisen DNA-fragmentoinnin havaitsemisessa maksimaalisella herkkyydellä.

TUNEL-sovelluksetTUNELia käytetään munuaisvaurioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin kliinisissä ja perustoksikologisissa tutkimuksissa monissa eri sovelluksissa, mukaan lukien lääketieteelliset hoidot [45], ympäristö [46], maatalouden [41] ja teollisuuden [47] altistuminen sekä eläinten [48]. ] ja elintarviketieteet [49]. TUNEL soveltuu kaikkiin solutyyppeihin, elimiin ja lajeihin, joissa on DNA:ta ja DNaaseja, mukaan lukien lähes kaikki lajit. TUNELia on käytetty munuaisvaurioiden tunnistamiseen ja kvantifiointiin useissa eri eläimissä, mukaan lukien seeprakala [50], japanilainen riisikala [51], kana [48], gerbiili [52], hiiret [41], rotta [45], kanit [53], minisiat [54] ja ihmiset [55]. TUNELin tärkeä etu on, että sitä voidaan käyttää sekä kiinteissä viljellyissä soluissa että kiinteissä kudoksissa. Tämä tarjoaa metodologisen johdonmukaisuuden vertailuun in vitro- ja in vivo -tulosten välillä tutkimuksissa, joissa mekanismeja voidaan tutkia viljellyissä munuaissoluissa, kun taas in vivo -vaikutukset arvioidaan eläinten munuaisissa. Mitä tahansa kokonaisten solujen ja kudosten väliltä voidaan myös käyttää, mukaan lukien viljellyt solusferoidit [56] ja ex vivo munuaisviipaleet [57,58].

TUNELin intensiteetti signaalin voimakkuuden tai TUNEL-positiivisten solujen lukumäärän suhteen voi vaihdella lajeittain riippuen DNaasien aktiivisuudesta. Kokemuksemme mukaan rotan munuaisella on aktiivisempi DNaasi I kuin hiiren munuaisella, ja TUNEL-positiivinen signaalinvoimakkuus korreloi tämän kanssa. Kun munuaista verrataan muihin elimiin, sen TUNEL-positiivinen signaali on erittäin voimakas ja samanlainen kuin muiden korkean DNaasi I -aktiivisuuden omaavien elimien, kuten suolisto ja sylkirauhanen. Spektrin toisessa päässä alhaisin TUNEL-positiivinen signaalivoimakkuus havaitaan aivoissa ja kasvain/syöpäsoluissa, joissa DNaasi I:n ilmentyminen on mitä todennäköisimmin inaktivoitunut vaihtoehtoisella silmukoitumisella koodaavalla alueella [59]. TUNEL-positiivinen signaali havaitaan kaikissa solutyypeissä munuaisissa. Tubulusepiteeli vaurioituu keskimäärin useammin kuin glomerulukset, erityisesti akuuteissa vammoissa (kuva 3A). Tämä korreloi hyvin tämäntyyppisissä soluissa vallitsevan DNaasi I -aktiivisuuden kanssa. Kokeissamme havaittujen sukupuoli- ja ikäerojen perusteella DNaasi I on runsaampi ja aktiivisempi miehillä kuin naarailla ja keski-ikäisillä eläimillä verrattuna vanhoihin tai vastasyntyneisiin eläimiin. Selkeää eroa TUNEL-positiivisuudessa ei kuitenkaan ole havaittavissa suhteessa sukupuoleen tai ikään, luultavasti siksi, että muut tekijät ovat korostuneita tai hallitsevia. Joissakin munuaismalleissa (kuten iskemia-reperfuusio) DNaasi I indusoituu [9]; kun taas toisissa se ei ole ja saattaa jopa olla tukahdutettu (esimerkiksi sisplatiinitoksisuus) [10]. Jos endonukleaasit aktivoituvat, sen on osoitettu tapahtuvan ensimmäisen 24 tunnin kuluessa munuaisvauriosta [9, 60, 61]. Siksi ei ollut yllättävää, että ainakin puolet TUNEL-sovelluksista munuaistutkimuksessa tässä katsauksessa käytettiin akuuttiin munuaisvaurioon (AKI), koska AKI:n arviointi tehdään usein 24–72 tunnin kuluessa vauriosta, jolloin endonukleaasit ovat aktiivisimpia. . AKI-tutkimusten luettelo on pitkä ja sisältää toksisia, septisiä, transplantaatioita ja hypoksisia vaurioita. Tässä työssä selvitimme näissä tutkimuksissa vaikuttavia malleja, altistustyyppejä, hoitoja, arviointien aikajanaa ja solutyyppejä. Tutkitut tutkimukset kattoivat munuaisvaurion akuutin ja sekamuotoisen akuutti-kroonisen muodon ja kroonisen munuaissairauden.

Se, havaitaanko TUNEL-positiivisen signaalin aiheuttamaa munuaisvauriota tubuluksissa vai glomeruluksissa, riippuu vaurioittavan aineen tai sairauden tyypistä. Esimerkiksi ihmisten lupusnefriitin ja nikkelin nanohiukkasten vaurion kuvattiin sisältävän tiukasti glomerulaarisia TUNEL-positiivisia signaaleja [62,63]. Toisaalta iskemia-reperfuusio ja streptotsotosiinin aiheuttama diabeettinen nefropatia rotilla tuottivat TUNEL-positiivisia soluja vain tubuluksiin [64,65]. Proksimaaliset tubulukset, Henlen silmukka, distaaliset tubulukset ja kollektiiviset tiehyet ovat usein TUNEL-positiivisia iskemia-reperfuusiomalleissa. TUNEL-positiivisia soluja sekä glomeruluksissa että tubuluksissa kuvattiin rotilla, jotka altistettiin lääkkeille, kuten syklosporiini A:lle [66] ja doksorubisiinille [67] tai kulutustuotemateriaaleille, kuten sinkkioksidin nanohiukkasille [68], sekä diabetes mellituksen rottamallissa [68]. 69]. Septisen shokin aiheuttama AKI ihmisillä liittyi myös sekä glomerulaarisiin että tubulaarisiin TUNEL-positiivisiin soluihin [70]. kuristunut suljetun silmukan ohutsuolen tukos aiheutti TUNEL-positiivisuuden munuaisessa 3 tunnissa [87].

AKI voi ilmaantua elinsiirron ja hypoksisten vammojen jälkeen. Allograftin hylkiminen ihmisillä liittyy yleisesti TUNEL-positiivisten solujen nousuun [88,89]. Kylmän iskemian jälkeen TUNEL-positiivisia soluja havaittiin tavallisesti 2–24 tunnin sisällä reperfuusion aikana [90] tai tarkemmin sanottuna 14–17 tunnin kuluttua iskemiasta [91], ja joskus meitä havaitaan vielä 7 päivän kuluttua. transplantaatin hyljintä [92]. Samoin iskemia-reperfuusiomalleissa TUNEL-positiivisia soluja havaittiin useimmiten 24 tuntia reperfuusion jälkeen [44, 93, 94] tai välillä 4 [95, 96] ja 72 tuntia [97]. Sekä transplantaatio- että iskeemisissä AKI-tutkimuksissa TUNEL-positiiviset solut paikannettiin distaalisiin ja proksimaalisiin tubulusepiteelisoluihin [44,93]. Hiiressämunuaisetiskemia-reperfuusiovaurion jälkeen TUNEL-positiivisten solujen kuvattiin keskittyneen kortikomedullaariseen liitoskohtaan, joka on iskeemisen vaurion tavallinen kohde [98].

Ihmisen siirrossa havaittiin sekamuotoisia akuutteja ja kroonisia vaurioita, joissa myrkylliset altistukset, sairaustilat ja/tai arvioinnit olivat sekä akuutteja (eli tunnit, päivät) että kroonisia (eli viikot, kuukaudet, vuodet) samassa tutkimuksessa. hyljintä (biopsia 1 viikosta 3 vuoteen siirron jälkeen) [88], sian hepatiitti E -virusinfektio (7 ja 14 päivää rokotuksen jälkeen) [52], CO2 pneumoperitoneumin aiheuttama stressi hydronefroottisessamunuaiset(2 viikkoa hydronefroosi, 2 päivää pneumoperitoneumin jälkeen) [53], käärmeen myrkyn aiheuttama mesangiaalinen proliferatiivinen glomerulonefriitti (1-14 päivää injektion jälkeen) [99], yksipuolinen virtsanjohtimen tukos (1-14 päivää tukos) [100], uranyyliasetaattialtistus (1–28 päivän altistus) [101], aristokolihapponefropatia (5 ja 30-vuorokausialtistus) [102] ja vastasyntyneen hyperoksia (testattu 1–60 päivää syntymän jälkeen, alttiina hyperoksialle ensin 14 päivää) [103]. Neljätoista päivää vaikutuksen jälkeen on hyvin yleinen arviointiajankohta tämän tyyppisillemunuaisvauriot[52,53,99,101,103]. Suurimmassa osassa tapauksista TUNEL-positiiviset solut lokalisoituivat tubuluksiin ja kollektiivisiin kanaviin. Ainoa poikkeus oli käärmeen myrkkymyrkyllisyys, joka vaurioitti ensisijaisesti glomeruluksia [99].

Krooninenmunuainensairaus (CKD), joka määritellään taudin esiintymiseksimunuainenvaurio tai alentunut glomerulussuodatusnopeus (GFR) ihmisillä yli 3 kuukauden ajan, on myös yleinen TUNEL-arvioinnin kohde, joka voi määrittää, liittyykö krooninen munuaistauti eteneväänmunuaisvaurio.Yleisimmin tutkittu krooninen sairaus, johon TUNELia käytetään, on diabeettinen nefropatia. TUNEL-positiivisuudella tunnistettu vaurio esiintyi tubuluksissa ja podosyyteissä [69] diabeetikoilla, joilla diabeteksen puhkeaminen oli ennen TUNEL-testausta [104 105] ja 2-16 viikkoa streptotsotosiinihoidon jälkeen jyrsijöillä [106 107]. Samanlainen TUNEL-positiivinen histopatologia raportoitiin immunoglobuliini A -nefropatiassa [22]. Lupusnefriitissä ja membranoproliferatiivisessa glomerulonefriitissä TUNEL-positiivisuus havaittiin pääasiassa munuaiskeräsissä [62,108,109]. Toisaalta sisplatiinin [110], klorokiinin [45], doksorubisiinin [67], finasteridin [23], takrolimuusin [111] ja levetirasetaamin [24] lääketurvallisuustutkimuksissa havaittiin enimmäkseen tubulusvaurioita. Samoin tubulaaristen TUNEL-positiivisten solujen tunnistama jatkuva akuutti vaurio on kuvattu virtsahapponefropatiaa [112], metioniinin puutetta [48], ympäristömyrkkyille mikrokystiini-LR [50] ja kadmiumia [113] koskevissa tutkimuksissa sekä yhteys kalsiumoksalaatin kanssamunuainenkivet [114] ja kalkkiutuvat nanohiukkaset [115]. Vaikka etenevän munuaisvaurion tunnistaminen CKD:n aikana TUNEL-määrityksellä on hyödyllinen diagnostinen työkalu, TUNEL-määrityksen yhdistäminen immunohistokemiaan (IHC) olisi ehkä vieläkin informatiivisempi vaurion mekanismin määrittämisessä.

TUNELin kvantifiointi- ja kolokalisointitekniikat

TUNELin kvantifiointimenetelmät vaihtelevat. Suurimmassa osassa raportteja TUNEL-positiiviset solut/ytimet kvantifioidaan prosentteina kokonaissoluista/ytimistä [83 116 117]. Tämä vaikuttaa oikealta, vaikka TUNEL-positiivisten solujen määrä ei todennäköisesti vastaa tarkalleen kuolleiden solujen määrää. Jotkut solut eivät ehkä ole saavuttaneet tunnistettavia DNA-fragmentoitumisen tasoja, kun taas toiset ovat jo voineet eliminoida makrofagit. Myös TUNEL-positiivisten solujen lukumäärän neliöyksikköä (mm2) kohden kvantifiointia käytetään [118], mutta tämä menetelmä vaikuttaa vähemmän täsmälliseltä, koska se riippuu alueiden sijainnista ja solutyyppisisällöstä. Kortikaaliset osat sisältävät enimmäkseen glomeruluksia, tubuluksia, verisuonia ja ydinsäteitä, kun taas ydinosat sisältävät pääasiassa Henlen silmukoita, keräyskanavia ja verisuonia. Kvantitointi "per Fifield" riippuu varmasti siitä, mikä kenttä on [72 119], ja kvantifiointi "per osa" on vielä enemmän määrittelemätön [61 120]. Huonosti tunnistetut mittaukset, kuten "histologinen pistemäärä" [121], "apoptoottinen indeksi" [113], "apoptoosinopeus" [92], "apoptoosin prosenttiosuus" [122] tai käsittelemättömän kontrollin prosenttiosuus [123,124], näyttävät olevan olla vielä vähemmän tarkoituksenmukaisia ​​ja tehdä tulkinnasta vaikeaa eikä verrattavissa useimpiin tutkimuksiin.

Solukuolema viereisissä soluissa alkaa epätasaisesti, koska se riippuu vaskularisaatiosta, solusyklistä ja muista muuttujista. Tämä johtaa usein solujen epätasaiseen TUNEL-värjäytymiseen kudoksessa [45,96,125]. Yllättäen TUNEL-positiivisen signaalin yleistä intensiteettiä ei käytetä TUNEL-mittaukseen, vaikka se riippuu suoraan DNA:n fragmentaatioasteesta. Tämä johtuu ehkä siitä, että solujen katsotaan kuolleiksi riippumatta TUNEL-signaalin voimakkuudesta, koska solu ei voi olla "kuollut", jos TUNEL-värjäys on voimakkaampaa. Vaikka on vaikeaa verrata tutkimuksia, joissa käytetään monia erilaisia ​​menetelmiä TUNEL-tulosten kvantifiointiin, TUNEL-positiivisten solujen määrä kontrollieläimissä on yleensä alle 2 prosenttia [75,99,100,116,126]. Akuutti vamma liittyy ~5–40-kertaiseen lisääntymiseen TUNEL-positiivisuudessa [79,126,127]. Kroonisen vamman aikana TUNEL-positiivisten solujen määrä on hieman pienempi, ~2–20--kertainen [29,43,65] verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin.

Alkuperäinen diaminobentsidiinivärjäykseen (DAB) perustuva TUNEL-määritys suunniteltiin valomikroskopiaa varten [14,15]. Tätä perinteistä menetelmää käytettiin edelleen kahdessa kolmasosassa tässä katsauksessa tutkituista tutkimuksista ja suurimmassa osassa ihmisbiopsiatutkimuksista. Kvantifiointi tehdään manuaalisella solulaskennalla, ja vaikka se on tarkka, se vie aikaa. Usein kvantifiointia ei käytetä ollenkaan, ja tulokset esitetään käyttämällä käsiteltyjen ja värjättyjen näytteiden kuvia yksinkertaisena todisteena solukuolemasta. Automaatio voi nopeuttaa kvantifiointiprosessia [128,129]. DAB:ta ei kuitenkaan voida yhdistää minkään muun värjäyksen kanssa samassa näytteessä, joten DAB-pohjainen TUNEL voi tarjota vain kuolleiden solujen määrän ilman solutyypin (paitsi visuaalista tunnistusta) tai solukuolemamekanismin tunnistamista.

Vaikka ihmisillä tehdyt tutkimukset perustuvat ylivoimaisesti DAB-pohjaiseen TUNELiin valomikroskopiaa käyttäen, noin puolet eläinkokeista käyttää FL-fluoresenssimikroskopiaa (kuva 3). Fluoresoiva TUNEL on visuaalisesti houkutteleva, helposti tulkittavissa ja sillä on useita merkittäviä etuja. TUNEL-positiivisten ytimien tai värin keskimääräisen intensiteetin tunnistamisen avulla tapahtuvan tarkan kvantifioinnin lisäksi FL-fluoresoiva TUNEL-signaali voidaan kolokalisoida muiden värien kanssa histokemiaa varten (esim. DAPI) (kuva 3A) tai IHC (kuva 3B). Jälkimmäisessä proteiinimarkkerien käyttö voi auttaa tunnistamaan TUNEL-positiivisia signaaleja, jotka liittyvät erilaisiinmunuainenosastoihin tai antaa tietoa solukuoleman tyypistä. Emme löytäneet esimerkkejä TUNELista yhdistettynä kaksois-IHC-vasta-ainevärjäykseen. Vaikka tällainen yhdistelmä olisi erittäin informatiivinen esimerkiksi solukuolemamekanismin tunnistamiseksi tietyissä solutyypeissä, tällaiseen värjäykseen liittyvät tekniset vaikeudet voivat painaa etuja suuremmat.

Tunnistusmunuainensolutyyppi ei todellakaan ole ongelma kokeneellemunuainenpatologi [104]. Tämän vuoksi lisämarkkereiden käyttö solutyypin tunnistamiseen, esimerkiksi CD31:n käyttö endoteelisolujen tunnistamiseen [130], on harvinaista. Usein käytetään kuitenkin IHC-proteiinimarkkereiden käyttöä kudosvaurion karakterisointiin. Useimmat tutkimukset käyttävät TUNEL-positiivisuutta ainoana todisteena apoptoosista. Muissa tutkimuksissa sen tunnustaminen, että TUNEL-positiivisuus ei ole spesifinen apoptoosille, on johtanut moniin morfologisiin (esim. hematoksyliini- ja eosiini- tai periodiinihappo-Schiff-värjäys), biokemiallisiin ja IHC-markkereihin, jotka yhdistetään TUNEL-värjäykseen apoptoosin vahvistamiseksi. Yleisimmin käytetty kaspaasista riippuvaisen apoptoosin markkeri on pilkottu (aktiivinen) kaspaasi-3 käyttämällä vasta-ainetta, joka ei tunnista täysikokoista kaspaasia-3 [131,132]. Sekä TUNEL- että katkaistu kaspaasi-3 -määritykset osoittivat yksinomaan tubulaarista, ei glomerulaarista, värjäytymistä rotan iskemia-reperfuusiossa [64]. Muissa kaspaasitutkimuksissa käytettiin kaspaasia-1 [27], -9 [53], -11 [28] ja -12 [75]. Muita apoptoottisia markkereita olivat B-solulymfooma 2 (Bcl2) -proteiiniperhe Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] ja Bad. [43]; apoptoottinen reseptori Fas [52] ja apoptoottinen reseptori-ligandi FasL [66]; forkhead box (FOX) -proteiinin transkriptiotekijät Fox01 [133] ja Fox03 [27]; ja sytokromi c [53]. Tuumorinekroositekijä-alfan (TNF) IHC:llä tunnistettiin tulehdus [134]; kasvaimen kasvutekijät TGF [66] ja TGF- 1 [135]; seriini/treoniinikinaasi 1 (SGK1) [135]; elektroninsiirtoflavoproteiini, beeta-alayksikkö (ETF ) [136]; Januskinaasi-2 (JAK2) [137]; signaalimuunnin ja transkription 3 aktivaattori (STAT3) [137]; ydintekijän kappa-kevytketjun tehostaja aktivoitujen B-solujen (NF-KB) [137] ja sen estäjäproteiini IkB [137]. vartenmunuainenvaurion arviointi, munuaisvauriomolekyyli-1 (KIM-1) [24], akvaporiini-1-kanava (AQP-1) [45], hypoksian aiheuttama tekijä {{7} }alfa-transkriptiotekijä (HIF-1 ) [103], Asc-tyypin aminohappokuljettaja-1 (Asc-1) [121], rapamysiinin (mTOR) [131]-kinaasin nisäkäskohde ja transglutaminaasi II:ta [89] käytettiin. Oksidatiivista munuaisvauriota tutkittiin käyttämällä markkereita, kuten 8-hydroksiguanosiinia (8OHdG) [102], neutrofiiligelatinaasiin liittyvää lipokaliinia (NGAL) [102], NAD-riippuvaista deasetylaasi sirtuiinia-1 (SIRT1) [138]. ja hemioksygenaasi 1 (HO-1) [90]. Kinaaseja tutkittiin intensiivisesti, mukaan lukien c-Jun N-terminaalinen kinaasi (JNK) -reitti [101], fosfoinositidi-3-kinaasi/proteiinikinaasi B/nukleaarinen tekijä erytroidi 2- liittyvä tekijä 2:n transkriptiotekijä (PI3K/). Akt/Nrf2) -reitti [46], panneksiini-1 (PANX1) plasmamembraaniraon liitosproteiini [26] ja mitogeenin aktivoima proteiinikinaasi/solunulkoisen signaalin säätelemä kinaasi (MAPK/ERK) [26]. Apoptoottisten endonukleaasien tutkimukset käsittelivät kaspaasilla aktivoitua DNaasi (CAD) [139], DNaasi I [108] ja EndoG [139], ja DNA-vauriomarkkereita olivat kasvainproteiini p53 (p53) [99] ja dynamiiniin liittyvä proteiini 1 (PARP1). ) [66]. Jotkut tutkimukset pitivät myös endoplasmisen retikulumin stressivälitteisen apoptoosin ja kudosvaurion arviointia hyödyllisenä [75].

Kun otetaan huomioon suuri määrä tutkittuja mekanistisia tutkimuksia ja TUNELin yhdistäminen IHC-markkereihin solukuolemamekanismien tunnistamiseksi, voidaan odottaa monia tutkimuksia, joissa käytetään kolokalisaatiota näiden kahden välillä. Analyysi voidaan suorittaa pikselikohtaisella kolokalisaatiolla TUNEL-positiivisten solujen ja IHC-markkerien välillä, IHC-markkerin keskimääräinen intensiteetti TUNEL-positiivisilla alueilla tai TUNEL-positiivinen signaali tarkoittaa intensiteettiä IHC-markkeripositiivisilla alueilla. Valitettavasti tätä TUNELin etua on käytetty vain muutamissa tutkimuksissa. TUNEL-positiiviset solut kolokalisoitiin katkaistulla kaspaasilla-3munuainentubulukset asetaminofeenin toksisuuden aikana rotilla [74]. IHC-kolokalisaatio TUNEL-positiivisella signaalilla mahdollisti mesangiaalisolujen solukuoleman tunnistamisen Habu-nefriitin aikana [99]. Valomikroskopiassa kolokalisointi mekaanisilla toksisuuden markkereilla tehtiin sarjaleikkeinä, kuten Ott et ai. [89].

TUNEL-ongelmat ja rajoitukset

TUNELin kanssa työskennellessä voi ilmetä useita mahdollisia ongelmia, ja niitä tulee odottaa. Yksi on, että 30OH DNA:n päät eivät esiinny ainoastaan ​​solukuoleman aikana endonukleaasitoiminnan seurauksena, vaan myös normaalina välituotteena lähes kaikissa entsymaattisissa reaktioissa DNA:n kanssa. Ensisijainen solutoiminto, joka tuottaa 30OH-päät, on DNA-synteesi, jossa lukuisat Okazaki-fragmentit voivat teoriassa tuottaa väärän positiivisen TUNEL-signaalin, erityisesti erittäin herkissä määrityksen modifikaatioissa. Aikanamunuaisvaurio,DNA-korjaus voi myös myötävaikuttaa vääriin TUNEL-positiivisiin signaaleihin AP-endonukleaasitoiminnan seurauksena. Kemiallisen (vetyperoksidi, bleomysiini) tai fysikaalisen (gammasäteilytys) vaurion aiheuttama massiivinen oksidatiivinen munuaisvaurio voi lisätä 30OH-päiden määrää, mikä lisää vääriä positiivisia TUNEL-lukemia lukuun ottamatta endonukleaasivälitteistä DNA-fragmentaatiota.

Useammin ja todennäköisemmin väärin asetetut TdT-reaktion koeolosuhteet (aika, lämpötila, entsymaattinen aktiivisuus tai kofaktorit) voivat johtaa keinotekoisesti kohotettuun TUNEL-positiivisen signaalin taustaan. Vaikka on edelleen epäselvää, mitä pidetään normaalina lähtötilanteena käsittelemättömille munuaiskudosnäytteille, näyttää uskottavalta, että noin 1 prosentti solujen kokonaismäärästä olisi kohtuullinen määrä. Varmasti 10 prosentin tai korkeampi tausta on selkeä todiste joko karakterisoimattomista ja jalostamattomista määritysolosuhteista tai poikkeamisesta sopivista näytteen säilytysolosuhteista.

Toinen odotettavissa oleva ongelma on alhainen DNaasi I -aktiivisuus joissakin solutyypeissä (esim.munuainenosat (esim. glomerulukset) tai patologiset kudokset (esim. kasvaimet). Näiden solujen tulisi olettaa osoittavan alhaista TUNEL-positiivisuutta, ei siksi, että ne ovat vaurioresistenttejä, vaan koska endonukleaasiaktiivisuus ei riitä tuottamaan mitattavissa olevaa signaalia TUNELissa. Kokemuksemme mukaan jopa muutokset välillä {{0}},01 prosenttia ja 0,1 prosenttia TUNEL-positiivisista soluista voivat olla tilastollisesti merkittäviä ja niitä voidaan käyttää vankana todisteena munuaisvauriosta (toisesta kudoksesta).

Lopuksi TUNEL-värjäytymisen kvantifiointiongelma syntyy, kun DNA-fragmentoitumisen määrä on liian suuri, esimerkiksi solukuoleman myöhäisissä vaiheissa tai voimakkaiden vaurioiden yhteydessä, jolloin jäljelle jäävää DNA:ta ei voida kunnolla värjätä DAPI:lla, koska DNA:ta on purettu. kaksoiskierre (kuva 3D). Näissä tapauksissa TUNEL-positiiviset signaalit "roikkuvat ilmassa" eivätkä näytä olevan yhteydessä ytimeen. Patologin vastuulla on tulkita nämä TUNEL-positiivisiksi soluiksi eikä artefaktiksi. Fluoreseiinileimatun TUNELin tapauksessa on olemassa vaara, että tausta-autofluoresenssi kudoksessa tunnistetaan TUNEL-positiivisuudeksi [140]. Näissä tapauksissa suositellaan vaihtamista punaiseen spektriin TUNEL [51,54].

TUNEL-kuviot lisätietojen lähteenä

Useita TUNEL-kuvioita voidaan selvästi erottaa ja käyttää mahdollisen mekanismin ja vamman asteen määrittämiseen (taulukko 1, kuva 3). Yleensä vain ytimiä sisältävän TUNEL-kuvion tuottaa lievä vaurio, kun taas voimakkaampi vaurio (eli kohonnut altistus) johtaa voimakkaampaan värjäytymiseen ja tumien tai solujen hajoamiseen. Tarkkaan apoptoottinen TUNEL-kuvio on tuman fragmentoituminen apoptoottisten kappaleiden muodostumisen seurauksena (kuva 3E). Pieniä TUNEL-positiivisten ytimien fragmentteja, jotka ovat todennäköisesti apoptoottisia kappaleita, havaittiin rotan iskemia-reperfuusiossa 24–72 tunnin kohdalla [97]. Apoptoottisia kappaleita havaittiin myös TUNEL-leimauksella ytimistä munuaisten tubulusepiteelissä ja interstitiumissa 14 päivää iskemia-reperfuusiovaurion jälkeen rotilla [141]. Kasvavat laventeliöljyannokset vähensivät vain ytimiä sisältäviä TUNEL-kuvioita ja muuttivat ne nekroosin kaltaiseksi TUNELiksi, jossa oli sytoplasmista vuotoa [94]. Jälkimmäinen oli seurausta ydinvaipan tuhoutumisesta proteaasien ja lipaasien vaikutuksesta nekroosissa. Sytoplasminen TUNEL (kuva 3F), joka nähtiin TUNEL-positiivisena sytoplasmana, havaittiin valomikroskopiassa rabdomyolyysimallissa rotan tubuluksissa [142] ja podosyyteissä, joita viljeltiin korkean glukoosin läsnä ollessa, ja diabeettisessa nefropatiassa hiirillä [135]. Sytoplasminen TUNEL kuvattiin myös munuaisiskemia-reperfuusiossa hiirillä käyttäen FL-fluoresoivaa TUNEL:ia [98] ja iskemia-reperfuusiossa rotilla valomikroskopiaa käyttäen [143]. Elohopeakloridin aiheuttama syvä ja yksinomaan putkimainen vaurio, jossa on voimakas sytoplasminen TUNEL-värjäys, mikä viittaa ydinkalvovaurioon [60]. Jos vamma jatkuu tai vahingollisen aineen annos kasvaa, sytoplasminen TUNEL voidaan muuntaa "sotkuiseksi" hajaantuneen TUNELin kuvaksi (kuva 3G), joka johtuu solutuhon myöhäisvaiheista johtuen nekroosista ja solujen sytoplasman ja roskien roiskumisesta. Esimerkiksi sekä sytoplasminen että dispergoitu TUNEL havaittiin sisplatiinilla hoidetuissa hiirissä [71,72] ja rotissa [144] ja podosyyttivauriossa streptotsotosiini-indusoiduissa diabeettisissa rotissa [145]. Dispergoitunut nekroottinen TUNEL havaittiin myös uranyyliasetaatin aiheuttaman nefrotoksisuuden aikana hiirillä [101]. Lopuksi toinen TUNEL-signaalimuuttuja, johon on kiinnitettävä huomiota, on TUNEL-positiivisten signaalien intensiteetti, joka voi vaihdella solusta toiseen riippuen kunkin solun kokemien katkojen lukumäärästä (vamman astetta), kuten eräissä tutkimuksissa on dokumentoitu [45,96,125 ]. Malleissa, joissa havaitaan vaihtelevaa TUNEL-signaalin voimakkuutta, suositellaan kvantifiointia sekä TUNEL-positiivisten kohteiden lukumäärän että värjäytymisen keskimääräisen intensiteetin perusteella.

Johtopäätökset

Apoptoottisten endonukleaasien, erityisesti DNaasi I:n ja EndoG:n, korkean aktiivisuuden vuoksi munuaisissa, TUNELin käyttömunuaisten tutkimus ja diagnoosion erittäin informatiivinen. Siitä voi tulla vieläkin hyödyllisempää, jos TUNELia käytetään sen alkuperäisen käytön jälkeen apoptoosin tunnistamismenetelmänä. TUNELin soveltaminen yksinomaan apoptoosin tutkimuksiin on hyvä esimerkki siitä, kuinka tiede voidaan vahingossa johtaa väärin väärin käytetyllä menetelmällä. Huolimatta siitä, että TUNELia käytetään enimmäkseen akuuttien vaurioiden määrityksessä, sitä voidaan soveltaa menestyksekkäästi sekä AKI:n että CKD:n arvioimiseen. CKD:ssä TUNEL-positiivisuuden asteen pitäisi kuitenkin olettaa olevan alhaisempi kuin akuutissa vammassa. Koska endonukleaasien (pääasiassa DNaasi I) aktiivisuus on paljon korkeampi tubulusepiteelissä kuin muissa munuaisosastoissa, munuaisten tubulusten vauriot nähdään yleensä näkyvämpinä. Keräs- tai verisuonivaurioita voidaan kuitenkin tutkia myös TUNELilla, jos vaurio todella tapahtuu näissä osastoissa. FL-fluoresoivan TUNELin kolokalisointi IHC-markkereilla mahdollistaa solutyyppien ja solukuolemamekanismien tunnistamisen ja yhdistämisen TUNEL-signaaleihin. TUNEL-kvantitointi voi antaa arvokasta tietoa solukuoleman astetta, ja kuva-analyysiohjelmiston käyttäminen voi olla erittäin hyödyllistä tässä suhteessa. Ottaen huomioon TUNEL-kuvioiden moninaisuuden, edustavia kuvia suositellaan vahvasti määritettäväksi ja esitettäväksi

TUNEL-signaalit, joita pidetään positiivisina. Lopuksi TUNEL-kuvioita tulisi käyttää lisätietojen, kuten solukuoleman mekanismin ja toksisuuden asteen, lähteenä. Esimerkiksi TUNEL-positiivisten apoptoottisten kappaleiden erottaminen toisistaan, sytoplasmisten TUNEL-signaalien läsnäolo tai hajallaan olevat TUNEL-kuviot voivat auttaa tunnistamaan apoptoottiset vs. nekroottiset TUNEL-positiiviset solut tutkimus- ja diagnostisten tulosten tarkempaa tulkintaa varten.

seksuaalisen kiihottumisen munuaishäiriön hoito