Kiinalaisen yrttilääketieteen Cistanchen vaikutus varhaiseen alkion ja sikiön kehitykseen

Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com

Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*

[Abstrakti]Käytä sikaaAlkioidenin vitro -hedelmöityksestä tutkimusta ja vertailua varten. Lisäämisen vaikutusKiinalääketiedeAinesosiaCistancheja Astragalus kehitykseenvarhaiset alkiotmediumissa NCSU-23 todistettiin. Koe osoitti, että: (1) Tilavuussuhde 0,10%Cistancheja 0,10% Astragalus lisättiin viljelyliemeen, jaCistanchelisäysryhmä Blastokystinopeus (15,76 %) oli merkitsevästi korkeampi kuin nollaryhmässä (9,26 %) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0.05), joka osoittaa, ettäCistanchedeserticolavoi merkittävästi edistäävarhainen alkiokehitys. (2) Kun pitoisuus (V/V)Cistancheon 0,05% ja 0,10%, blastokystinopeus (17,02% ja 16,75%) on huomattavasti suurempi kuin nollaryhmä (0) (P)<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">KiinalääketiedeCistancheviljelyväliaineessa 2-soluisessa vaiheessa alkiorakkulaation kehitysnopeus (13,81 %) oli merkittävästi suurempi kuin 4-soluisessa vaiheessa (7,53 %) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistancheennen pilkkomista (13.67%) ) On hieman suurempi, mutta ero ei ole ilmeinen (P>0.05).

Koska kehitysympäristössä on eroja in vivo ja in vitro,Alkioidenvapaat radikaalit vahingoittavat sitä varhaisen sian in vitro -viljelyn aikanaAlkioiden, aiheuttaen solujen aineenvaihdunnan häiriöitä tai vaurioita DNA: lle, RNA: lle ja proteiineille [1]. Jäädytetyllä siemennesteellä tapahtuvan in vitro -hedelmöityksen kehittymisnopeuden parantamiseksi edelleen tässä kokeessa tutkittiin tietyn pitoisuuden lisäämistäCistancheja Astragalus parantaaalkiokehitysympäristö in vitro.

1. Materiaali ja menetelmät

1. 1 Viljelyolosuhteet:

Sian munasolujen in vitro -kypsytys, in vitro -hedelmöitys ja varhaisten alkioiden in vitro -viljely suoritettiin kaikki inkubaattorissa, jossa oli 5% CO2: ta ja suurin kyllästetty kosteus 39 ° C.

1.2 Reagenssit ja viljelyalusta:

Munasolujen kypsymisen perusneste on NCSU-23, munasolujen pesuneste on PVA-TL-HEPES-nestettä, lannoitusneste on Tris-puskuri (mTBM), joka sisältää 0,1% BSA: ta, ja siittiöiden pesuneste on Dubecco's, jossa on 0,1% BSA: ta. Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (DPBS), siittiöiden sulatusneste on BTS, kumulusneste on 1 mg/ ml hyaluronidaasi PBS, munasolujen leikkausneste on HEPES-puskuroitu NCSU-23 ja varhaisten alkioiden perusviljelynestettä täydennetään 0,4 %: lla BSA NCSU-23: lla, lisätään (V / V) 0,05% ~ 0,15% Cistanche tarpeen mukaan, käytä BTS: ää siemennesteen sulattamiseen. Esilämmitä ja tasapainota ennen käyttöä yli 4 tuntia inkubaattorissa, joka sisältää 5 % CO2-ilmaa ja jonka kyllästetty kosteus on enintään 39 °C [2].

1.3 Kiinalaisen lääkkeen Cistanchen kiehumismenetelmä:

Cistanche-liuos: Ota 5 g ja laita se 100 ml: n dekantterilasiin, lisää ultrapuhtaaseen veteen ja upota se ultrapuhtaaseen veteen, keitä suurella tulella ja pidä se kiehuvana 20 minuuttia, sitten kerää keitto; toista yllä oleva prosessi, kerää 3 kertaa peräkkäin, vakiotilavuus 100 ml: aan, 0,22 μm suodatin varaosa. Astragalus-liuos: Ota 5 g ja laita se 100 ml: n dekantterilasiin, lisää ultrapuhdista vettä ja upota se, keitä suurella tulella ja pidä sitä kiehuvana 20 minuuttia, sitten kerää lääkekeitto; toista yllä oleva prosessi, kerää 3 kertaa peräkkäin, aseta tilavuus 100 ml: aan, suodata 0,22 μm.

Kiinalainen lääketiedeYrtti:Cistanche

1.4 Sian munasolujen in vitro -kypsytys:

Emakoiden munasarjat kerättiin Beijing Pengcheng Food Slaughterhousesta, laitettiin 0,9%: iin normaaliin suolaliuokseen, joka sisälsi antibiootteja noin 38 ° C: ssa, kuljetettiin takaisin laboratorioon 4 tunnin kuluessa ja pestiin normaalilla suolaliuoksella kolme kertaa. Käytä 10 ml: n ruiskua, jossa on 12-mittainen neula, munasolujen uuttamiseen munasoluilla, joiden halkaisija on 2-6 mm: n follikkelit munasarjan pinnalla. Pese 3 ~ 4 kertaa TL-HEPES-liuoksessa ja 3 ~ 4 kertaa NCSU-23: ssa, jota on tasapainotettu hiilidioksidihautomossa yli 4 tuntia. Siirrä 20 ~ 30 munasolua ryhmänä 100 μl: iin, lisää 10% PFF, 10 IU / ml HCG, 10 IU / ml PMSG, 10 ng / ml EGF NCSU-23 -pisaroita ja viljelmää noin 22 tunnin ajan, Vaihda väliaine NCSU-23-pisaroiksi, joissa on 10% PFF, 10 ng / ml EGF ja jatka viljelyä 44 ~ 46 h [3].

1.5 Siittiöiden kapasitaatio ja in vitro -hedelmöitys:

Valmistetaan mTBM-liuos ilman kofeiinia ja BSA:ta ja tasapainotetaan sitä 48 tunnin ajan inkubaattorissa, jossa on 5% CO2 ja suurin kyllästetty kosteus 39 °C, säätämällä pH-arvoa välillä 7,2 ~ 7,8; lisää kofeiinia ja BSA:ta 44 tuntia ennen käyttöä ja jatka tasapainottamista. Siemennesteen laatu testattiin, ja 10 ml sentrifugoitiin 900 r/min 3 minuutin ajan, suspensiota varten lisättiin 10 ml DPBS-liuosta, joka sisälsi 0,1% BSA:ta, ja sentrifugoidaan 900 r/min 3 minuutin ajan [3]; kun 1 ml TBM-liuosta oli suspendoitu, se kallistettiin 60 ° Ylävirran energiankeräyskäsittely suoritetaan inkubaattorissa, jossa on 5% CO2-ilmaa ja suurin kyllästetty kosteus 39 ° C 1 tunnin ajan [3 ~ 5]. Munasolujen ja cumulus-solukompleksi, joka kypsyy 44~ 46: een, asetetaan munasolujen pesuliuokseen, joka sisältää 0,1% hyaluronidaasia, ja kumulussolut poistetaan pipetoimalla ja sitten munasolut altistetaan. Pese 3 kertaa tasapainotetussa TBM: ssä ja laita lopuksi jokainen 10-15 kappaletta 50 μl: n TBM-ryhmään ja odota siittiöitä [6, 7]. Injektoidaan 50 μl kapasitaatiosta peräisin olevaa ylävirran siemennestettä TBM:ää sisältävien munasolujen pisaraan ja hedelmöitetään 6 tunnin ajan inkubaattorissa, jossa on 5% CO2 ja suurin kyllästetty kosteus 39 °C.

1.6 Hedelmöittyneiden munien varhainen kehittäminen ja havaitseminen:

6 tunnin hedelmöityksen jälkeen munasoluja hoidettiin NCSU-23: lla, joka puskuroitiin käyttönesteellä HEPES tai NCSU- 23: lla, jossa oli 0,4% BSA: ta alkionviljelynesteessä. 23 Huuhtele 3 kertaa, vaihda väliaine tasapainoiseksi 0,4%: n BSA NCSU-23 -pisaraksi ja inkuboi yli 8 päivää. Tarkista hypoteettisten hedelmöittyneiden munien jakonopeus 2. päivänä, tarkista morulan määrä (+blastokyst-määrä) 6. päivänä ja tarkista alkiorakkula-määrä 8. päivänä [8]. Kaikki tutkittiin ja tallennettiin vartalopeilin alle.

1.7 Kokeellinen suunnittelu:

1.7.1 Perinteisen kiinalaisen lääketieteen ainesosien Cistanchen vaikutus varhaiseen alkion kehitykseen.

Wuzhishan sika[8] Kapasitaation, koeputkihedelmöityksen jälkeen hedelmöitys on valmis, ja pilkkoutumisen jälkeen alkiot vaihdetaan, kunnes ne lisätään 0,1%: iin (V/ V). Cistanchea, 0,1% astragalusta ja NCSU-23:a (0,4% BSA), joissa ei ollut tärkeitä ainesosia (tyhjä ryhmä), viljeltiin hedelmöittyneiden munien ja varhaisten alkioiden kehittymisen tarkkailemiseksi ja kahden perinteisen kiinalaisen lääketieteen komponentin vaikutusten arvioimiseksi varhaiseen in vitro -alkionkehitykseen Vaikutus.

1.7.2 Cistanchen pitoisuuden vaikutus alkioiden varhaiseen kehitykseen.

Wuzhishanin sian siemenneste kapasitoidaan ja sille tehdään in vitro -hedelmöitys. Kun lannoitus on valmis, neste vaihdetaan 0%: iin (tyhjä ryhmä), vastaavasti 0,05%, 0,1% ja 0,1%.. 15%: ssa Cistanche NCSU-23: ssa (0,4% BSA) tarkkaile hedelmöittyneiden munien kehitystä ja arvioi kiinalaisen lääkekomponentin Cistanchen eri pitoisuuksien vaikutusta varhaiseen in vitro -alkion kehitykseen.

1.7.3 Cistanche-lisäysjakson vaikutus varhaiseen alkion kehitykseen.

Wuzhishanin sian siemenneste on kapasitaatio ja sille tehdään in vitro -hedelmöitys. Lannoituksen päätyttyä hedelmöittynyt muna jakautuu 2-soluvaiheeseen ja hedelmöittynyt muna jakautuu 4-soluiseen vaiheeseen, neste vaihdetaan ja lisätään erikseen. 0,1% Cistanche NCSU-23 (0,4%BSA), tarkkaile hedelmöittyneiden munien kehitystä ja arvioi säleiden lisäämisen vaikutusta varhaiseen in vitro -alkion kehitykseen eri vaiheissa.

1.8 Tilastollinen analyysi:

Käytä SPSS13.0 chi-neliötestiä (χ2) ja varianssin yksisuuntaista analyysiä.

Cistanche-uutteen vaikutukset

2. Analyysin tulos

2. 1 Perinteisen kiinalaisen lääketieteen ainesosien vaikutus varhaiseen alkion kehitykseen

Kuten taulukosta 1 käy ilmi, Cistanche- ja Astragalus-ryhmässä morula-arvo ei poikennut merkittävästi nollaryhmän (P>0,05) nopeudesta. Näiden kahden ryhmän alkiorakkulanopeus oli korkeampi kuin tyhjän ryhmän, ja Cistanche-ryhmän blastokystinopeus oli erilainen kuin tyhjän ryhmän. Merkittävä (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">

2.2 Kiinalaisen lääkkeen ainesosan Cistanche pitoisuuden vaikutus alkion varhaiseen kehitykseen

Kuten taulukosta 2 on esitetty, Cistanchen lisäämisellä tilavuuspitoisuutena 0,05– 0,10% alkionviljelynesteessä on parempi edistävä vaikutus WZSP: n jäädytettyihin siittiöiden nesteiden in vitro -hedelmöitysalkioihin, ja blastokystien kehitysnopeus eroaa merkittävästi nollaryhmän (P) kehitysnopeudesta<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">

2.3 Kiinalaisen lääkkeen ainesosan Cistanche-jakson lisäämisen vaikutus alkion varhaiseen kehitykseen

Kuten taulukosta 3 käy ilmi, testauksen ja analyysin jälkeen Cistanchen lisäämisellä 0,10 %:n tilavuuskonsentraatiopitoisuudella 2-soluisessa vaiheessa on parempi edistävä vaikutus WZSP:n pakastettuun siittiönesteeseen koeputkihedelmöitysalkiossa, eikä ennen pilkkomista ole merkittävää eroa (P>0,05). Oli kuitenkin merkittävä ero verrattuna 4 solun (P) lisäämiseen<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">

3. Keskustelu

Verrattuna normaaliin kehitykseenAlkioidenin vivo, hedelmöittyneen IVF:n kehitysympäristöAlkioidenon merkittävästi erilainen. Prosessin aikanaalkiokasvua ja jakautumista, tuotetaan suuri määrä nro, vapaita radikaaleja ja joitakin myrkyllisiä aineita, mikä on epäedullista alkion kasvulle. Normaalisti alkioiden kehittyminen kehossa voi poistaa nämä epäsuotuisat tekijät sisäisen ympäristön aineenvaihdunnan kautta; nämä epäsuotuisat tekijät kertyvät aina koeputkihedelmöityksen alkion kasvuympäristöön. PerinteinenKiinalääketiedeainesosaCistanchesen tehtävänä voi olla pitoisuuksien puuttuminen ja tiettyjen vapaiden radikaalien poistaminen, jotta voidaan edelleen parantaa pakastetun siemennesteen aiheuttaman koeputkihedelmöityksen kehittymisnopeutta. Tutkitussa kokeessa lisättiin tietty pitoisuusCistancheja Astragalus. Tulokset vahvistivat, että Astragalusilla ei ollut tehokasta vaikutusta in vitro -viljelyympäristön parantamiseen. Oikea pitoisuusCistancheon tiettyä edistävää vaikutustavarhainen alkiokehitys, mutta kun keskittyminenCistancheylittää tietyn pitoisuuden, sillä on myös estävä vaikutusalkiokehitys.

Tutkimme edelleenCistanche, perinteinenKiinalääketiedekomponentti, eri vaiheissa, ja kokeessa havaittiin, ettävarhaiset alkioton korkeampi kehitysaste myöhemmässä vaiheessa, kuncistanchelisätään 2-soluisessa vaiheessa. Mahdollinen syy johtuu reseptorin ulkoisesta ympäristöstä. Typpioksidi (NO) on signaalimolekyyli ja sytotoksinen tekijä, jolla on laaja valikoima biologisia vaikutuksia. NO:n vaikutusvarhainen alkiokehitys olisi jäljitettävävarhainen alkiokehitysvaihe, joka voi johtua yhdestä 2-solulohkon (2-solulohkon) syystä nisäkkäiden alkioviljelmässä, ja sikojen in vitro -lohko tapahtuu 4-soluvaiheessa [9]. PerinteisenKiinalääketiedeainesosat voivat poistaa NO: n vapaan radikaalin jossain määrin ja lievittää epäsuotuisia tekijöitäalkiokasvu [10].

Cistanche

Viittaukset

[1] Komportti M. Kolme vapaiden radikaalien aiheuttaman soluinfuryn mallia[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.

[2] Pan Dengke. Tutkimus kloonatun sian somaattisolun kehitykseen vaikuttavista tekijöistäAlkioiden[D]. Peking: Kiinan maatalousyliopisto, 2005.

[3] Zhang Yunhai. Kloonattujen sikojen tuotantoa koskeva tutkimusAlkioidenkäyttäen somaattisten solujen tumansiirtotekniikkaa [D]. Peking: Kiinan maatalousyliopisto, 2005.

[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun ym. Naudan seerumin ja sian follikulaarisen nesteen lisäämisen vaikutukset kypsymisen aikana sian munasolujen ydinkypsytykseen javarhainen alkiokehitys koeputkihedelmöityksen jälkeen [J]. Heilongjiangin karjanhoito ja eläinlääketiede, 2002, (8):1- 3.