Cistanche Deserticolan kokonaisglykosidit edistävät neurologisten toimintojen palautumista indusoimalla neurovaskulaarista regeneraatiota Nrf{0}}/Keap-1-reitin kautta MCAO/R-rotilla

Tausta:

Perinteisen kiinalaisen lääketieteen Cistanche deserticola on raportoitu pätevän sydän- ja aivoverisuonisairauksiin. Sen aktiiviset komponentit iskeemisen aivohalvauksen suojaamiseksi eivät kuitenkaan ole selviä. Pyrimme tutkimaan C. deserticolan aktiivisia komponentteja iskeemistä aivohalvausta vastaan ​​sekä sen mahdollisia mekanismeja.

Menetelmät:

Tutkimme C. deserticolan uutteiden, kokonaisglykosidien (TG), polysakkaridien (PS) ja oligosakkaridien (OS) aivoja suojaavia vaikutuksia keskimmäisen aivovaltimon okkluusio-reperfuusion (MCAO/R) rottamallissa. 2, 3, 5-Trifenyylitetratsoliumkloridivärjäystä (TTC) käytettiin aivoinfarktin tilavuuden arvioimiseen, ja Evansin sininen määritys otettiin käyttöön veri-aivoesteen (BBB) ​​läpäisevyyden arvioimiseksi. Sitten lausekkeet CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 ja Nrf{{ 13}} analysoitiin käyttämällä Western blot -menetelmää tai immunofluoresenssia, ja aktiivisuudet MDA, SOD, CAT ja GSH-Px analysoitiin käyttämällä kittejä.

Tulokset:

TGs-hoito vähensi merkittävästi neurologisia alijäämäpisteitä ja infarktien määrää, edisti angiogeneesiä ja hermoston uudelleenmuodostumista ja säilytti tehokkaasti veri-aivoesteen eheyden malliryhmään verrattuna. Lisäksi TG:t laskivat merkittävästi MDA-tasoja ja lisäsivät antioksidanttiaktiivisuutta (SOD, CAT ja GSH-Px) aivoissa. Samaan aikaan TG:t vähensivät Keap-1-ilmentymistä ja helpottivat Nrf-2-ytimen translokaatiota. Päinvastoin, PS- ja OSs-ryhmille ei havaittu suojaavia vaikutuksia.

Johtopäätös:

TG:t ovat C. deserticolan tärkeimmät aktiiviset komponentit MCAO/indusoitua aivovauriota vastaan, ja suojaus tapahtuu pääasiassa Nrf{0}}/Keap-1-reitin kautta.

KlikkausLuonnollinen Cistanche Deserticola -uutetuote

JOHDANTO

Aivohalvauksia pidetään tärkeimpänä kuolinsyynä ja vammautumisena maailmassa (Donnan et al., 2008). Lähes 87 prosenttia kaikista aivohalvaustapauksista laukaisee iskeeminen aivohalvaus (Ovbiagele ja Nguyen-Huynh, 2011). Tällä hetkellä tehokkain ja ainoa FDA:n hyväksymä lääke, jota käytetään iskeemisen aivohalvauksen hoitoon, on rekombinantti kudosplasminogeeniaktivaattori. Suuri osa aivohalvauspotilaista ei kuitenkaan reagoi tähän lääkkeeseen sen kapeasta terapeuttisesta aikaikkunasta ja vakavasta verenvuotokomplikaatioiden riskistä johtuen (Lee et al., 2012; Schellinger ja Kohrmann, 2014). Trombolyyttisen hoidon suuri haaste on iskemia/reperfuusio (I/R) -vaurio, jota pidetään pääasiallisena aivovaurion ja toimintojen tuhoutumisen syynä. Aivoiskemian jälkeinen reperfuusio lisää aivoverenvuodon riskiä samalla, kun se johtaa neurovaskulaariseen vaurioon ja tuottaa liiallisia reaktiivisia happilajeja (ROS), jotka vahingoittavat veri-aivoestettä (Alluri et al., 2015). Useat tutkimukset ovat vahvistaneet, että BBB:n häiriintyminen on tärkein syy iskeemisen aivohalvauksen patogeneesiin (Cao et al., 2016b).

BBB koostuu pääasiassa endoteelisoluista, perisyyteistä, astrosyyteistä, hermosoluista ja tyvikalvoista. BBB:n ydinkomponentit ovat aivojen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja, jotka on liitetty toisiinsa tiukoilla liitoksilla, mikä rajoittaa eksogeenisten molekyylien pääsyä aivoihin. Tiukkojen liitoskohtien patologiset muutokset – erityisesti okludiini, claudiini-5 ja zonula occludens-1 (ZO-1) – vaikuttavat merkittävästi BBB:n toimintaan iskeemisen aivohalvauksen aikana, erityisesti esteen läpäisevyyteen (Liu et al., 2014; Hu et ai., 2018; Liu et ai., 2019). I/R-jaksojen aikana liiallinen ROS on yksi tärkeimmistä tekijöistä, jotka johtavat suoraan aivohermosolujen vaurioitumiseen (Ding et al., 2014). ROS-ylituotanto johtaa tiettyjen liitoskohtien hajoamiseen ja BBB-häiriöihin, mikä johtaa eksogeenisten molekyylien pääsyyn aivoihin BBB:n kautta, mikä johtaa aivovaurion pahenemiseen (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Siksi BBB:n suojaamista antioksidanteilla on pidetty mahdollisena tapana ehkäistä reperfuusiovaurioita.

BBB:n hajoamisen lisäksi I/R voi johtaa neurovaskulaariseen vaurioon ja hermosolujen kuolemaan (Jung et al., 2010). Aivohalvauksen aikana lisääntynyt hermosolujen kuolema voi johtua oksidatiivisesta stressistä (Chi et al., 2018), ja useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ROS pahentaa aivohalvauksen vakavuutta ja neurologisia vaurioita (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et ai., 2006). Vaikka kliiniset tutkimukset eivät ole tuottaneet tyydyttäviä tuloksia, hermosolujen suojaus on edelleen lupaava strategia akuutin iskeemisen aivohalvauksen hoidossa (Moretti et al., 2015). Siten tehokkaiden hermosoluja suojaavien lääkkeiden löytäminen aivohalvauksen hoitoon on etu aivohalvauspotilaille.

Perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) ryhtyy toimiin puuttuakseen kehon sisäiseen epätasapainoon (Gaire, 2018). Iskeemisten aivohalvausten monimutkaisen patogeneesin vuoksi TCM:n ja sen aktiivisten aineosien monitekijäinen vaikutus on kriittinen rooli aivohalvausten hoidossa. Cistanche deserticola YC Ma, laajalle levinnyt kuivilla tai puolikuivilla alueilla kaikkialla Mongoliassa ja Luoteis-Kiinassa, on ollut laajalti käytetty TCM-yrtti erilaisten sairauksien, kuten unohtamisen ja masennuksen, hoitoon yli 1,000 vuoden ajan Kiinassa. . Nykyaikaiset farmakologiset tutkimukset osoittivat, että C. deserticolan raakauutteet osoittivat useita farmakologisia vaikutuksia, kuten oppimisen ja muistin tehostamista, hermosolujen suojaamista, immuniteetin parantamista, antioksidantteja, ikääntymistä estäviä ja väsymystä ehkäiseviä vaikutuksia (Ko ja Leung, 2007; Wang et al. , 2012; Li et ai., 2015). C. deserticolan kemiallinen analyysi osoitti, että sen pääaineosia ovat fenyylietanoidiglykosidit, iridoidiglykosidit, polysakkaridit ja oligosakkaridit (Jiang ja Tu, 2009). C. deserticolan aktiiviset komponentit aivojen suojaamiseksi eivät kuitenkaan ole kovin selviä.

C. deserticolan hermoja suojaava ominaisuus viittaa sen terapeuttiseen potentiaaliin kognitiivisiin sairauksiin, kuten aivohalvaukseen ja masennukseen, sekä Alzheimerin tautiin (Wang et al., 2017). Tutkimus C. deserticolan vaikutuksista aivohalvauksiin, mukaan lukien sen aktiiviset komponentit ja toimintamekanismit, on kuitenkin hyvin rajallista.

Tässä työssä tutkimme kolmen C. deserticola -uutteen, kokonaisglykosidien (TG:t, fenyylietanoidiglykosidit ja muut glykosidit), polysakkaridit (PS) ja oligosakkaridit (OS:t) suojaavaa vaikutusta aivojen I/R-vammoihin. Löytömme voivat osaltaan edistää C. deserticolan tarkkaa kliinistä käyttöä ja tarjota ehdokasaineen iskeemisen aivohalvauksen hoitoon.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Kemikaalit ja reagenssit

Cistanche deserticolan varret ostettiin Alashanista, Sisä-Mongoliasta, ja yksi kirjoittajista (P.-F. Tu) tunnistaa ne. TG:t, PS:t ja OS:t valmistettiin aiemmin raportoidulla menetelmällämme (Gao et al., 2015). TG:iden kvantitatiivinen analyysi suoritettiin korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC), kuten aiemmin on kuvattu (Li et al, 2019), ja sen kromatogrammi on esitetty kuvassa 1. TG:iden pääkomponentit ovat ekinakosidi, tubulosidi A, akteosidi, isoakteosidi, ja 2'-asetyylilakteosidi; niiden pitoisuudet ovat 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g ja 12,045 mg/g. PS:n ja OS:n pitoisuudet ovat 69,42 prosenttia ja 65,24 prosenttia määritettynä HPLC:llä ja fenoli-rikkihappoanalyysillä (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).

Ekinakosidin (A0282), tubulosidi A:n (A0942), akteosidin (A0280), isoakteosidin (A0281) ja 2'-asetyylilakteosidin (A0943) standardiviitteet ostettiin Chengdu Must Biotechnologylta (Sichuan, Kiina). Kaikkien standardien puhtausaste on yli 98 prosenttia. Nissl tahra H&E -sarjat ostettiin Bosterilta (Wuhan, Kiina). Edaravone (T0407-1) ​​ostettiin Target Molilta (Shanghai, Kiina). Kanin anti-rotta MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) ja hiiren anti-rotta CD31 (ab24590) ostettiin Abcam Inc:ltä (Cambridge, MA, USA). Rabbit anti-rotta Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) ja Occludin (BS72035) ostettiin Bioworld Technologylta (Nanjing, Kiina). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, USA) oli kanin anti-rotta Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T) lähde. GAPDH (HRP-60004) ostettiin Proteintech Group, Inc:ltä (Chicago, USA).

Toissijaiset vasta-aineet toimitti Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kiina). Hoechst 33258 hankittiin Beyotimelta (Jiangsu, Kiina).

Eläimet

Sprague-Dawley-rotat (urospuoliset, paino 250–300 g) hankittiin Vital River Laboratory Animal Technologylta (Peking, Kiina) ja niitä pidettiin ilmastoiduissa huoneissa, joita pidettiin 12 tunnin valo/pimeä-syklissä. Kaikki eläinkokeet suoritettiin eläintutkimuksen ARRIVE-ohjeiden mukaisesti (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010), ja Pekingin yliopiston terveystieteiden keskuksen Institutional Animal Care and Use Committee (LA2019123) hyväksyi.

Eläinkoeprotokollat

Rotat altistettiin MCAO/R:lle, kuten aiemmin on kuvattu (Wang et ai., 2018). Lyhyesti sanottuna vasen yhteinen kaulavaltimo (CCA), ulkoinen kaulavaltimo (ECA) ja sisäinen kaulavaltimo (ICA) paljastettiin, ja 3-0 nylon-monofilamenttiommel lisättiin ECA:sta ICA:han, kunnes se saavutti keskiosan. aivovaltimo (MCA). 1,5 tunnin MCA-tukoksen jälkeen reperfuusio simuloitiin poistamalla filamentti. Kirurgisen toimenpiteen aikana kaikkien rottien ruumiinlämpö pidettiin 37,0 asteessa.

Lääkehallinto

Rotat jaettiin satunnaisesti kuuteen ryhmään käyttämällä SPSS-ohjelmiston versiota 22.0 kuvatulla tavalla (Jiang et al., 2014): normaali ryhmä (NOR); malliryhmä (MOD); edaravoniryhmä (positiivinen lääke, 6 ml/kg, EDI); TGs-ryhmä (280 mg/kg, TGs); PSs-ryhmä (280 mg/kg, PSs) ja OSs-ryhmä (280 mg/kg, OSs). TG:t, PS:t ja OS:t annettiin kerran päivässä MCAO/R:n jälkeen 14 päivän ajan. NOR- ja MOD-ryhmät käsiteltiin normaalilla suolaliuoksella. Eläinten numerot on esitetty taulukossa 1.

Painon ja modifioitujen neurologisten alijäämäpisteiden (NSS) mittaaminen

Kehon painoa seurattiin 14. päivänä käyttämällä ADVENTURE™ Digital Scale -vaakaa (OHAUS, New Jersey, USA). Massa arvioitiin FJ Wangin (Wang et al., 2018) kuvaaman menetelmän mukaisesti pienin korjauksin.

2, 3, 5-Trifenyylitetratsoliumkloridi (TTC) värjäys

Infarktin tilavuus mitattiin aiemmin kuvatulla tavalla (Wang et al., 2015). Lyhyesti sanottuna aivot leikattiin seitsemään tasavälein sijaitsevaan koronaaliseen lohkoon (2 mm). Nämä leikkeet värjättiin 2-prosenttisella TTC:llä (Coolaber, Peking, Kiina) 37 asteessa 15 minuutin ajan. Infarktin tilavuus (prosenttia)=(ipsilateraalisen iskeemisen aivopuoliskon tilavuus − kontralateraalisen iskeemisen aivopuoliskon tilavuus) / kontralateraalisen iskeemisen aivopuoliskon tilavuus × 100.

Nissl ja H&E värjäys

Rotat nukutettiin syvästi, ja koko aivot poistettiin sitten nopeasti kallosta ja kiinnitettiin käyttämällä 4 % paraformaldehydiä ja upotettiin parafiinivahaan ja leikattiin 7 um:n paksuisiksi viipaleiksi. Leikkeet värjättiin Nissl:llä ja H&E:llä. Tässä tutkimuksessa kuhunkin kudosnäytteeseen otettiin valomikroskoopilla kuusi satunnaista 200 × 200 µm kenttää. Nisslin ruumiiden määrä laskettiin IPP-ohjelmistoversiolla 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Evans Blue Assay

Rotille injektoitiin 2 % EB:tä (Coolaber Science & Technology Co., LTD) MCAO/R:n jälkeen. Kaksi tuntia myöhemmin rotat nukutettiin ja koko aivot poistettiin sitten nopeasti ja homogenisoitiin asetonissa. Supernatantit analysoitiin 620 nm:ssä 800 TS:n absorbanssilukijalla (BioTek, USA).

Katalaasin (CAT), superoksididismutaasin (SOD), malondialdehydin (MDA) ja glutationiperoksidaasin (GSH-Px) aktiivisuuden mittaaminen

Kaikki seeruminäytteet sentrifugoitiin nopeudella 4, 000 × rpm 15 minuuttia 4 asteessa ja analysoitiin sitten MDA:n, CAT:n, SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuuksien havaitsemiseksi valmistajan ohjeiden mukaisesti (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Kiina).

Western Blotting -analyysi

Kustakin rotasta kerätyt aivokudokset (100 mg) homogenisoitiin ja hajotettiin RIPA-lyysipuskurissa ja analysoitiin sitten proteiinipitoisuuden havaitsemiseksi käyttämällä BCA-kittiä (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Kudosten kokonaisproteiinit ladattiin 10-prosenttisille SDS-PAGE-geeleille ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Kalvo estettiin käyttämällä 5-prosenttista rasvatonta maitoa, minkä jälkeen sitä inkuboitiin yön yli primääristen vasta-aineiden kanssa 4 °C:ssa. Sitten kalvoa inkuboitiin sekundaarisen vasta-aineen kanssa. Western blot -analyysi analysoitiin käyttämällä Kodak Digital Imaging Systemiä (5200 Multi, Tanon, Kiina).

Immunofluoresenssianalyysi

Suoritettiin immunofluoresenssivärjäys CD31:lle, a-SMA:lle, ZO-1:lle, claudin5:lle, okludiinille, PDGFRb:lle, SYN:lle, PSD95:lle, MAP-2, Nrf-2 ja Keap-1. Primääriset vasta-aineet Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okkludiini, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 ja Keap-1 laimennettiin yhteen. :200 ja 1:100. Alexa Flur 488 hiiren anti-kanin IgG:n ja rodamiinin (TRITC) vuohen anti-kanin IgG:n sekundaariset vasta-aineet laimennettiin molemmat suhteeseen 1:200. Tumat värjättiin Hoechst 33258:lla. Kuvat otettiin käyttämällä Vectra® Polaris™ Automated Quantitative Pathology Imaging System -järjestelmää (PerkinElmer, USA). Proteiinin ilmentyminen analysoitiin käyttämällä IPP-ohjelmistoversiota 6.0.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot kuvattiin keskiarvona ± SD. SPSS-ohjelmiston versio 22.{1}} suoritettiin tilastollista analyysia varten. Eri ryhmien vertailussa käytettiin yksisuuntaista ANOVAa. P < 0,05 katsottiin tilastolliseksi eroksi.

TULOKSET

TG:t lisäävät kehon painoa ja vähentävät aivovaurioita MCAO/R-rotilla

14 päivän parannuksen jälkeen TG:llä, PS:llä, Oss:lla ja EDI:llä I/R-rottien ruumiinpainot, neurologiset puutteet ja infarktitilavuudet arvioitiin. Tulokset osoittivat, että kehon painot MOD-ryhmässä laskivat suuresti, kun taas alentuneet painot TG-, PS- ja EDI-ryhmissä lisääntyivät (kuvio 2A). EDI ja TG:t alensivat merkittävästi neurologisia alijäämäpisteitä (kuva 2B). NOR-ryhmän rottien aivoviipaleet olivat syvän punaisia, eikä niissä ollut infarkteja, kun taas MOD-ryhmän rotilla oli laaja ipsilateraalinen aivoinfarkti. TGs-hoidon jälkeen infarktin tilavuudet pienenivät merkittävästi (kuvat 2C, D). PS- ja OS-käsittely ei osoittanut selvää vaikutusta yllä oleviin indekseihin. Yllä olevat tiedot osoittivat, että TG:t pystyivät merkittävästi lievittämään I/R-indusoitua aivovauriota, mutta PS:t ja OS:t eivät voineet.

TG:t parantavat histopatologisia vaurioita MCAO/R-rotilla

Joidenkin TG-, PS- ja OS-hoidon vaikutusten määrittämiseksi histopatologisiin vaurioihin tehtiin H&E-värjäys patologisten vaurioiden paljastamiseksi. NOR-ryhmän aivojen histomorfologiset rakenteet järjestyivät säännöllisesti. Morfologian muutokset TGs-ryhmissä olivat vähäisempiä kuin MOD-ryhmässä. PS- ja OSs-hoitoryhmät eivät kuitenkaan osoittaneet merkittävää morfologian muutosten paranemista (kuvio 3).

TG:t heikentävät hermovaurioita I/RIn aiheuttamien rottien jälkeen

Nissl-värjäys osoitti iskeemisen alueen penumbrassa olevien neuronien histopatologiset muutokset. Kuten kuvassa 4 esitetään, normaaleissa hermosoluissa oli selkeä tuma ja ehjä rakenne. MOD-ryhmässä neuroneilla oli laajentuneet solujen väliset tilat. Kauniit ruumiit katosivat, kutistuivat ja värjäytyivät syvästi. Näitä muutoksia havaittiin kuitenkin harvoin EDI-, TG- ja PS-ryhmissä. Nämä tulokset osoittivat, että TG:t ja PS:t voivat merkittävästi heikentää iskemian/reperfuusion aiheuttamaa hermosoluvauriota.

TG:t vaimentavat BBB-häiriöitä I/RT-käsiteltyjen rottien jälkeen

Evans blue -määritys on klassinen menetelmä BBB:n läpäisevyyden muutoksen tutkimiseen. Koetulokset osoittivat, että lisääntynyttä Evans-sinistä havaittiin MOD-ryhmässä, kun taas Evans-sininen oli merkittävästi vähentynyt TG- ja EDI-käsitellyissä rotissa. Lisäksi PS:iden ja OS-hoitoryhmien välillä ei ollut merkittävää eroa (kuvio 5). Nämä tulokset viittasivat siihen, että TG:t voivat merkittävästi heikentää BBB-häiriöitä.

TG:t edistävät angiogeneesiä I/R-vaurioituneilla rotilla

Uusimmat tutkimukset osoittavat, että angiogeneesillä on kriittinen rooli neurologisessa toiminnallisessa palautumisessa ja ennustetuloksissa akuutin iskeemisen aivohalvauksen jälkeen (Yuen et al., 2015). TG:iden, PS:ien ja OS:ien vaikutusten arvioimiseksi angiogeneesiin CD31:tä ja a-SMA:ta käytettiin kapillaarilukujen kvantifiointiin. Immunofluoresenssivärjäys osoitti, että MOD-ryhmä aiheutti huomattavan alenemisen CD31:n (kuviot 6A, B) ja aSMA:n (kuviot 6C, D) ekspressioissa I/R-rottien iskeemisten alueiden penumbrassa normaaleihin rottiin verrattuna. Tämä tulos osoitti, että I/R voi aiheuttaa verisuonivaurioita iskeemisten pallonpuoliskojen aivokuoren penumbrassa. TG- ja EDI-käsittely lisäsi kuitenkin huomattavasti kapillaaritiheyttä, angiogeneesiä ja arteriogeneesiä, kuten CD31:n ja a-SMA:n lisääntyneet ilmentymät osoittavat. Nämä tulokset viittaavat siihen, että TG:t voisivat edistää angiogeneesiä I/R-rottien iskeemisessä penumbrassa, mutta PS:t ja OS:t eivät voineet.

TG:t lisäävät tiiviiden liitosproteiinien ilmentymistä I/R-vaurioituneilla rotilla

BBB-häiriöt voivat nostaa aivojen vesipitoisuutta ja kudosten turvotusta, mikä johtaa aivovammaan. Tiivis liitosproteiinit ovat tärkeitä BBB:n rakenteellisia komponentteja (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Sen testaamiseksi, voisiko TG:iden, PS:iden ja OS:iden hoito aivohalvauksen jälkeen vaikuttaa BBB:n eheyteen, ZO-1, claudin-5 ja okludiinin ilmentyminen suoritettiin immunofluoresenssianalyysillä. Tulokset osoittivat, että claudin-5, ocludin ja ZO-1 ilmentymät olivat selvästi vähentyneet MOD-ryhmässä. Ne kuitenkin lisääntyivät huomattavasti 14 päivän kuluttua sen antamisesta. PS- ja OSs-ryhmät eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia näissä proteiiniekspressioissa (kuvio 7). Nämä tiedot osoittivat, että TG:t voisivat säädellä tiiviitä liitosproteiinien ilmentymiä ja ylläpitää BBB:n eheyttä I/R-vaurion jälkeen.

TG:t lisäävät perisyyttien kattavuutta kapillaareissa I/R-vaurioituneiden rottien kohdalla

Perisyyttien peittämisellä kapillaareilla on kriittinen rooli BBB:n eheyden ylläpitämisessä (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Näin ollen testasimme, voitaisiinko perisyyttien kattavuutta lisätä TG-, PS- ja OS-hoidolla. Immunofluoresenssin intensiteettianalyysin tulokset osoittivat, että sekä PDGFRb:n että CD31:n ilmentyminen väheni dramaattisesti MOD-ryhmässä. TG:iden antaminen I/R-rotille toipui merkittävästi tai jopa lisäsi PDGFRb:n ja CD31:n ilmentymisintensiteettiä, mutta eroa ei havaittu PS- ja OSs-hoitoryhmissä (kuvio 8). Siten TG:iden hoito voisi lisätä merkittävästi perisyyttien kattavuutta. Nämä havainnot vahvistivat edelleen, että TG:t voivat säilyttää BBB:n eheyden I/R:n jälkeen.

TG:t edistävät hermoston uudelleenmuodostumista I/R-vaurioituneilla rotilla

Lukuisten tutkimusten mukaan aivohalvauksen jälkeinen neurogeneesi voi parantaa merkittävästi toiminnallista palautumista (Grefkes ja Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Synaptophysin (SYN), postsynaptic density 95 (PSD-95) proteiineja ja mikrotubuluksiin liittyvää proteiinia 2 (MAP-2) käytettiin markkereina tutkimaan hermosolujen plastisuutta aivokuoren iskeemisessä penumbrassa. TG-, PS- ja OS-hoidon vaikutusten arvioimiseksi neurogeneesiin I/R-vaurioituneilla rotilla suoritettiin immunofluoresenssi ja Western blot SYN-, PSD95- ja MAP{8}}-ilmentymistä varten. Kuten kuvista 9 ja 10 näkyy, SYN-, PSD95- ja MAP{12}}-ilmentymistasot I/R-rotilla 14 päivän reperfuusion jälkeen laskivat NOR-rottiin verrattuna, kun taas TG:t ja PS:t paranivat merkittävästi. säätelevät niiden ilmentymistasoja. OSs-ryhmässä ei tapahtunut merkittävää muutosta MOD-ryhmään verrattuna. Tiedot osoittivat, että TG:t ja PS:t paranivat dramaattisesti edistämään hermoston uudelleenmuodostumista I/R-vaurion jälkeen.

TG:t muuttavat Nrf{0}} ja Keap-1 ilmaisuja I/R-vaurioituneissa rotissa

Oksidatiivinen stressi on tärkein patogeeninen mekanismi I/R-vauriossa (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Tutkimukset vahvistivat, että Nrf-2 on antioksidanttivasteiden pääsäätelijä (Thompson et al., 2015). Tutkiaksemme Nrf-2- ja Keap-1-välitteisiä oksidatiivisia vasteita I/R-vaurion jälkeen arvioimme Keap-1:n sytoplasman ilmentymisen sekä tuman translokaation. Samaan aikaan tutkittiin myös Nrf{7}}:n ilmentyminen I/R-vaurioituneiden rottien aivokudoksissa (kuvat 10 ja 11). Immunofluoresenssianalyysin mukaan Nrf{10}}:n havaittiin sijaitsevan pääasiassa sytoplasmassa NOR-ryhmässä. TGs-ryhmässä Nrf-2:n ilmentyminen sytoplasmisessa lokalisoinnissa väheni, mutta tumassa lisääntyi, ja myös Keap-1:n ilmentymistä havaittiin. Tiedot osoittivat, että TG:iden aivojen suojaus voi liittyä Nrf-2 ja Keap-1 modulaatioon.

TG:t vaimentavat aivokudosten oksidatiivista stressiä I/R-vaurioituneilla rotilla

TG:iden antioksidatiivisten vaikutusten vahvistamiseksi SOD:n, CAT:n, GSH-Px:n ja MDA:n aktiivisuudet arvioitiin I/R-vaurioituneissa rotissa. Kuvassa 12 MDA:n pitoisuus kasvoi huomattavasti MOD-ryhmässä ja samalla SOD:n, CAT:n ja GSH-Px:n aktiivisuudet vähenivät normaaleihin rottiin verrattuna. Sitä vastoin TG-käsittely johti merkittävään MDA-pitoisuuden laskuun ja SOD:n, CAT:n ja GSH-Px:n aktiivisuuden lisääntymiseen. Nämä tulokset vahvistivat edelleen TG:iden antioksidanttiaktiivisuuden.

KESKUSTELU

Monet tutkimukset viittaavat siihen, että TCM C. deserticolalla on laaja biologinen aktiivisuus, esimerkiksi se parantaa kykyä oppia, muistia ja immuniteettia (Dong et al., 2007; Jiang ja Tu, 2009; Wang et al., 2017; Xia et al., 2018). C. deserticolan aktiiviset komponentit hermosolujen suojaamiseksi jäävät kuitenkin epäselväksi. Nykyisen työn tavoitteena on seuloa C. deserticolan aktiiviset komponentit iskeemistä aivohalvausta vastaan ​​MCAO/R-mallilla. Kolmea C. deserticola -uutetta (TG:t, PS:t ja OS:t) käytettiin arvioimaan niiden vaikutuksia MCAO/R-rotissa sekä mahdollisia mekanismeja. Aivohalvaus on yleinen akuutti aivoverenkiertosairaus. Epidemiologiset tutkimukset osoittavat, että aivohalvaus on yleisempi miehillä kuin naisilla (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik ja Bushnell, 2017).

Siten kokeessamme urosrottia hyväksyttiin testeihin. Tuloksemme osoittivat, että I/R-induktio kiihdytti oksidatiivista stressiä ja infarktin määrää, rikkoen BBB:n ja johti hermo- ja aivoverisuonivaurioihin. Seulonnan jälkeen TG:iden havaittiin vähentävän infarktin määrää ja edistävän hermoston uudelleenmuodostumista ja angiogeneesiä. Lisäksi TG:iden havaittiin säilyttävän BBB:n eheyden I/R-vaurion jälkeen. Päinvastoin, PS:t ja käyttöjärjestelmät eivät merkittävästi helpota I/R-vammoja. Siten TG:itä pidetään C. deserticolan pääasiallisena aktiivisena jakeena hermosolujen suojaamiseksi, mahdollisesti edistämällä hermoston uudelleenmuodostumista, angiogeneesiä ja BBB:n eheyttä aktivoimalla Nrf2/Keap{1}}-reittiä.

Kasvavat todisteet osoittavat, että tehokkaan kollateraalisen verenkierron luominen on merkittävästi tärkeää infarktin ja iskeemisen penumbran muodostumisen välttämiseksi, ja se on kriittinen hoito iskeemisen aivohalvauksen varhaisessa vaiheessa (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Verisuonten endoteelisolujen ja sileän lihaksen solujen lisääntyminen iskeemisen infarktin jälkeen määrää kollateraalisen verenkierron muodostumisen.

Iskemiamalleilla on kuitenkin yleinen ilmiö - eli oksidatiivinen stressi esiintyi laajalti aivojen mikroverisuonissa. Tutkimustulokset ovat osoittaneet, että suuri määrä antioksidantteja voi häiritä BBB:n toimintaa ja angiogeneesin ominaisuuksia (Mentor ja Fisher, 2017). CD31 ja a-SMA ovat verisuonten endoteelisolujen ja vastaavasti sileän lihassolujen markkereita (Saboor et al., 2016). C. deserticolan uutteiden edellä mainitun soluproliferaation vaikutuksen tutkimiseksi tutkimme CD31:n ja a-SMA:n ilmentymiä aivoiskeemisessä penumbrahomogenaatissa. Tietomme osoittivat, että TG:t paransivat hämmästyttävästi CD31:n ja a-SMA:n ilmentymiä. PS- ja OS-ryhmien välillä ei kuitenkaan ollut merkittäviä eroja. Siksi päätimme, että TG:t voivat vähentää aivovaurioita edistämällä angiogeneesiä lisäämällä CD31:n ja a-SMA:n ilmentymiä, kun taas PS:t ja OS:t eivät tarjonneet tällaista suojaa aivovaurioilta. Nämä tulokset vahvistivat edelleen, että vain TG:t voivat estää aivo-I/R-vaurion.

Iskeemisen aivohalvauksen voidaan ajatella olevan seurausta aivoiskemiasta, joka johtuu hermosolujen plastisuuden heikkenemisestä tai aivoalueiden uudelleenmuodostumisesta. Suurin osa aivohalvauspotilaista kärsii neurologisista vajauksista. Neurogeneesin aktivointi on lupaava strategia aivohalvauspotilaille heidän neurologisten toimintojensa parantamiseksi (Cramer ja Chopp, 2000). Neurogeneesi osallistuu suoraan neurologisten toimintojen palautumiseen aivojen I/R-vaurion jälkeen (Zhang et al., 2019). Aiemmat tutkimukset osoittavat, että TG:t voivat parantaa hippokampuksen pyramidisolujen eloonjäämisastetta ja indusoida neurogeneesiä (Lian et al., 2017). Oksidatiivinen stressi aiheuttaa neuronien menetystä monien sairauksien, kuten Parkinsonin, aivohalvauksen ja niin edelleen, aikana (Duan ja Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2 transkriptoi monia geenejä, jotka liittyvät neurosuojaukseen promoottorialueellaan, mukaan lukien pääasiassa SOD-, MDA-, CAT- ja glutamyylikysteiiniligaasit jne (Satoh et al., 2006). SYN-, PSD-95- ja MAP-2-proteiineja, jotka liittyvät läheisesti synaptiseen muodostumiseen ja neurotransmissioon, voidaan pitää iskeemisen penumbra-alueen tutkimushermosolujen plastisuuden markkereina. Tutkittuamme havaitsimme, että parantaminen TG:illä voisi merkittävästi lisätä PSD95:n, SYN:n ja MAP:n ilmentymiä-2, mikä osoittaa, että TG:iden aivojen suojaus korreloi hermosolujen parantuneen plastisuuden kanssa I/R:n aikana. On kuitenkin sääli, että PS:iden ja käyttöjärjestelmäryhmien välillä ei ole selvää eroa. Nämä tulokset osoittivat, että TG:t voivat lisätä neuroplastisuutta aivojen I/R-vaurion jälkeen.

Aivohalvauspotilaiden kuvantamistutkimus osoitti, että BBB-häiriötä voidaan pitää iskeemisten aivojen silmiinpistävänä ominaisuutena (Bang et al., 2007). TJ:t, jotka koostuvat sytoplasmaproteiineista, kalvon läpäisevistä proteiineista ja kapillaarin endoteelisolujen välisistä liitosadheesiomolekyyleistä, ovat erittäin tärkeitä BBB:n eheyden ylläpitämisessä (Ye et al., 2019). Näistä ZO-1, claudin-5 ja okludiini ovat TJ:iden tärkeimmät proteiinit. Kasvavat todisteet osoittavat, että iskemian aiheuttama BBB:n lisääntynyt läpäisevyys korreloi yleensä ZO-1-, claudiini--5- ja okludiini-muutosten kanssa (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et ai., 2017; Liu et ai., 2018).

Tässä työssä tulokset osoittivat, että vaikka TG:t saattoivat lisätä merkittävästi ZO-1-, claudin-5- ja okkludiiniproteiinien ilmentymistä MCAO-indusoiduissa aivokudoksissa, eivät PS:t eivätkä OS:t. BBB koostuu aivojen endoteelisoluista ja liittyy läheisesti perisyytteihin (Nyul-Toth et al., 2016). Perisyytit ovat elintärkeitä BBB:n eheydelle (Bell et al., 2010). Iskeeminen aivohalvaus laukaisee perisyyttikuoleman ja irtoamisen aivojen endoteelisoluista akuutissa vaiheessa, mikä horjuttaa mikroverisuonia ja muuttaa BBB:n ominaisuuksia (Zechariah et al., 2013). Tietomme osoittivat, että TG:t voivat lisätä perisyyttien peittoa hiussuonissa ja lisätä ZO-1, claudin-5 ja okludiinin ilmentymistasoja. Nämä ilmiöt osoittivat, että TG:t pystyivät suojaamaan tehokkaasti BBB:n eheyttä aivo-I/R-vaurion jälkeen. Yhteenvetona voidaan todeta, että TG:t voivat heikentää aivovaurioita useilla tavoilla, kuten edistämällä angiogeneesiä, parantamalla hermosolujen plastisuutta ja ylläpitämällä BBB:n eheyttä.

Sitten tutkimme signalointireittiä tutkiaksemme TG:n aivojen suojauksen taustalla olevaa mekanismia. I/R-vaurion prosessi on monitekijäinen, joten patogeneesissä on mukana lukuisia mekanismeja. Oksidatiivinen stressi on perusriskitekijä, joka edistää I/R-indusoitua aivovauriota (Suda et al., 2013), kuten BBB-rakenteen vaurioita, verisuonten endoteelin toimintahäiriöitä ja iskeemisen hermosoluvaurion pahenemista (Xiong et al., 2015; Caglayan). et ai., 2019; Priestley et ai., 2019).

Siten oksidatiivisesta stressistä on tullut houkutteleva terapeuttinen kohde I/R-indusoidussa aivovauriossa. Vaiheen 2 entsyymejä, joita välittää ydintekijä E2- liittyvä tekijä-2 (Nrf-2), on pidetty tärkeänä keinona, jolla hermosolut suojaavat itseään oksidatiiviselta stressiltä (Suzuki ja Yamamoto , 2015; Ya et ai., 2018). Kasvavat todisteet osoittavat, että Nrf-2:n aktivaatio I/R:n aikana on mahdollinen terapeuttinen kohde hermosuojalle (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, joka on tärkeä endogeenisen antioksidanttipuolustuksen säätelijä, välittää hemioksigenaasi 1:n (HO-1) ja muiden antioksidanttientsyymien, kuten NAD(P)H-kinonioksidoreduktaasi 1:n (NQO1), tasoa, SOD, CAT, GSH ja MDA (Siow et al., 2007; Ding et al., 2014). Lisäksi Nrf{17}}:lla on tärkeä säätelijätehtävä angiogeneesissä. Tämä tutkimus osoittaa, että Nrf-2 voidaan merkittävästi parantaa ja aktivoida verisuonten kehitysprosessissa (Wei et al., 2013).

Kuten aiemmin on kuvattu (Jiang ja Tu, 2009), TG:t sisältävät paljon bioaktiivisia yhdisteitä, esimerkiksi ekinakosidia, tubulosidi A:ta, akteosidia, isoakteosidia ja 2'-asetyylilakteosidia, ja osa niistä osoitti hermoja suojaavia toimintoja aivo-I/R-vaurion jälkeen ( Peng et ai., 2016). Ekinakosidilla on monia farmakologisia vaikutuksia, kuten hapettumista estävä, vanhenemista estävä, hermosolujen suojaus, tulehdusta ehkäisevä, piristymisen edistäminen, maksan suojaus, luun muodostumisen edistäminen ja kasvainten vastainen vaikutus (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et ai., 2018; Ji et ai., 2019; Xu et ai., 2019).

Äskettäin ekinakosidi on tunnistettu tehokkaaksi keskushermoston antioksidantiksi (Lu et al., 2016). Ekinakosidi voi alentaa MDA-pitoisuutta ja parantaa SOD:n ja GSHPx:n aktiivisuutta iskemiassa aivovauriossa, ja molekyylitelakointianalyysi osoitti, että ekinakosidi saattaa sitoutua Keap-1, mikä johtaa Nrf-2-ytimen translokaatioon (Li et al., 2018). Tutkimus Xia osoitti, että akteosidi voi vähentää infarktin määrää ja aivojen vesipitoisuutta parantaakseen neurologisia puutteita MCAO/R-rotilla lieventämällä oksidatiivista stressiä (Xia et al., 2018). Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että isoakteosidi voi lisätä solujen antioksidanttientsyymien, SOD:n ja CAT:n aktiivisuutta H2O2-käsitellyissä V79-4-soluissa (Chae et al., 2005). Yllä olevien TG:iden sisältämien aktiivisten yhdisteiden raporttien perusteella on mahdollista päätellä, että TG:t voisivat suojata iskeemiseltä aivohalvaukselta antioksidanttireittien kautta.

Raportoin fenyylietanoidiglykosidien (PhG) hermoja suojaavista vaikutuksista H2O2--indusoituun apoptoosiin PC12-soluissa Nrf2/ARE-reitin kautta (Li et al., 2018). Nämä PhG:t tukahdutettiin merkittävästi laukaisemalla Nrf2-tuman translokaatio ja lisäämällä HO-1:n, NQO1:n, glutamaatti-kysteiiniligaasin katalyyttisen alayksikön (GCLC) ja glutamaatti-kysteiiniligaasin modifiointialayksikön (GCLM) ekspressiota (Li et al., 2018). Gong et ai., 2019).

Siksi nämä havainnot viittaavat siihen, että Nrf{0}}/ARE-reitillä on ratkaiseva rooli PhGs-välitteisissä hermosolujen suojaavissa vaikutuksissa. Samoin tässä tutkimuksessa havaitsimme, että TG:t voivat alentaa MDA-tasoa ja lisätä SOD-, CAT- ja GSH-Px-tasoja I/R-rotissa. Samaan aikaan TG:t voivat lisätä Nrf2-ilmentymistä tumassa, vähentää vastaavaa ilmentymistä sytoplasmassa ja vähentää merkittävästi Keap{4}}-ilmentymistä. Siksi Nrf-2/Keap-1-reitti voi olla osallisena TG:n välittämissä hermostoa suojaavissa vaikutuksissa. Tämän reitin lisävalidointi suoritettaisiin in vitro soluviljelmällä happi-glukoosin puutteen/uudelleenhapetuksen vauriomalleilla tulevaisuudessa. Lisäksi C. deserticola -uutteita annettiin tutkimuksessamme 14 päivän ajan yhtäjaksoisesti. Koska aikuisen neurogeneesi vaikuttaisi hermoja suojaavien vaikutusten tulkintaan 14 päivän reperfuusion aikana, neurogeneesiä ei voida sulkea pois nykyisestä koesuunnitelmastamme tutkiessamme CT:iden hermoja suojaavaa vaikutusta. Tämä on tutkimuksemme rajoitus.

Yhteenvetona voidaan todeta, että C. deserticolan TG:t voivat tehostaa angiogeneesiä ja neurogeneesiä sekä ylläpitää BBB:n eheyttä I/R-vauriorotissa, mutta eivät PS:itä ja OS:itä. Vaikutukset voivat johtua Nrf{0}}/Keap-1-reitin aktivoinnista.

TIETOJEN SAATAVUUSLAUSUNTO

Kirjoittajat antavat tämän artikkelin päätelmiä tukevan raakadatan kenen tahansa pätevän tutkijan saataville ilman aiheetonta varauksetta.

EETIIKKA LAUSUNTO

Tämä työ suoritettiin Pekingin yliopiston eläinkokeiden ohjeiden mukaisesti. Tutkimusprotokollat ​​hyväksyi Institutional Animal Care and Use Committee Peking University Health Science Centerissä (LA2019123).

TEKIJÄT

YJ, KZ ja PT suunnittelivat tutkimuksen. FW teki tutkimuksen. FW ja RL analysoivat tiedot. FW, RL ja JC kirjoittivat käsikirjoituksen ja HPLC-analyysin. JC, KZ, YJ ja PT korjasivat käsikirjoituksen.

RAHOITUS

Tätä tutkimusta tukivat National Key Research and Development Project (2017YFC1702400, 2019YFC1711000), National Natural Science Foundation of China (81773932) ja National Key Technology T&K -ohjelma "New Drug Innovation" of China (2018ZX09711001-008-003 ).

VIITTEET

Alluri, H., Anasooya Shaji, C., Davis, ML ja Tharakan, B. (2015). Happiglukoosin puute ja uudelleenhapetus in vitro iskemia-reperfuusiovauriomallina veri-aivoesteen toimintahäiriöiden tutkimiseen. J. Vis. Exp. 99, e52699. doi: 10.3791/52699

Armulik, A., Genove, G., Mae, M., Nisancioglu, MH, Wallgard, E., Niaudet, C., et ai. (2010). Perisyytit säätelevät veri-aivoestettä. Nature 468 (7323), 557–561. doi: 10.1038/luonto09522

Bang, OY, Buck, BH, Saver, JL, Alger, JR, Yoon, SR, Starkman, S., et ai. (2007). Hemorragisen transformaation ennustaminen rekanalisaatiohoidon jälkeen T2*-läpäisevyysmagneettikuvauksella. Ann. Neurol. 62 (2), 170–176. doi: 10.1002/ana.21174

Bell, RD, Winkler, EA, Sagare, AP, Singh, I., LaRue, B., Deane, R. et ai. (2010). Perisyytit säätelevät tärkeimpiä neurovaskulaarisia toimintoja ja hermosolujen fenotyyppejä aikuisen aivoissa ja aivojen ikääntymisen aikana. Neuron 68 (3), 409-427. doi: 10.1016/j.neuron.2010.09.043

Caglayan, B., Kilic, E., Dalay, A., Altunay, S., Tuzcu, M., Erten, F., et ai. (2019). Allyyli-isotiosyanaatti heikentää oksidatiivista stressiä ja tulehdusta moduloimalla Nrf2/HO-1- ja NF-kappaB-reittejä traumaattisessa aivovauriossa hiirillä. Mol. Biol. Rep. 46 (1), 241–250. doi: 10.1007/s{10}}

Cao, G., Jiang, N., Hu, Y., Zhang, Y., Wang, G., Yin, M., et ai. (2016a). Ruskogeniini heikentää aivoiskemian aiheuttamaa veri-aivoesteen toimintahäiriötä estämällä TXNIP/NLRP3-tulehdusaktivaatiota ja MAPK-reittiä. Int. J. Mol. Sci. 17 (9), 1–17. doi: 10.3390/ijms17091418

Cao, G., Ye, X., Xu, Y., Yin, M., Chen, H., Kou, J., et ai. (2016b). YiQiFuMai-jauheinjektio parantaa veri-aivoesteen toimintahäiriötä ja aivoturvotusta hiirten fokaalisen aivoiskemia-reperfuusiovaurion jälkeen. Drug Des. Dev. Siellä. 10, 315–325. doi: 10.2147/dddt.S96818

Chae, S., Kim, JS, Kang, KA, Bu, HD, Lee, Y., Seo, YR, et ai. (2005). Clerodendron trichotomumin isoakteosidin antioksidanttivaikutus. J. Toxicol. Ympäristö. Terveys A 68 (5), 389–400. doi: 10.1080/15287390590900750

Cheon, SY, Cho, KJ, Kim, SY, Kam, EH, Lee, JE ja Koo, BN (2016). Apoptoosisignaalia säätelevän kinaasi 1:n esto heikentää matriksin metalloproteinaasi 9:n aktiivisuutta aivojen endoteelisoluissa ja sitä seuraavaa apoptoosia hermosoluissa iskeemisen vaurion jälkeen. Edessä. Solun neurosci. 10, 213. doi: 10.3389/fncel.2016.00213

Chi, H., Chang, HY ja Sang, TK (2018). Hermosolujen kuoleman mekanismit suurissa hermosolujen rappeutumissairauksissa. Int. J. Mol. Sci. 19 (10), 1-18. doi: 10.3390/ ijms19103082

Crack, PJ, Taylor, JM, Flentjar, NJ, de Haan, J., Hertzog, P., Iannello, RC, et ai. (2001). Suurentunut infarktin koko ja pahentunut apoptoosi glutationiperoksidaasin-1 (Gpx-1) knockout-hiiren aivoissa vasteena iskemialle/reperfuusiovauriolle. J. Neurochem. 78 (6), 1389–1399. doi: 10.1046/j.{9}}.2001.00535.x

Crack, PJ, Taylor, JM, Ali, U., Mansell, A. ja Hertzog, PJ (2006). NF-kappaB:n mahdollinen vaikutus hermosolujen kuolemaan glutationiperoksidaasi-1-poistohiirellä vasteena iskemia-reperfuusiovauriolle. Aivohalvaus 37 (6), 1533–1538. doi: 10.1161/01.Str.0000221708.17159.64

Cramer, SC ja Chopp, M. (2000). Toipuminen tiivistää ontogenian. Trends Neurosci. 23 (6), 265–271. doi: 10.1016/s0166-2236(00)01562-9

Daneman, R., Zhou, L., Kebede, AA ja Barres, BA (2010). Perisyyttejä tarvitaan veri-aivoesteen eheydelle alkion synnyn aikana. Nature 468 (7323), 562–566. doi: 10.1038/luonto09513

Ding, Y., Chen, M., Wang, M., Wang, M., Zhang, T., Park, J., et ai. (2014). Asetyyli-11-keto-beeta-Boswellihapon aiheuttama neurosuojaus iskeemisessä aivovauriossa sisältää nrf2/HO-1-puolustusreitin. Sci. Rep. 4, 7002. doi: 10.1038/srep07002

Ding, Y., Chen, M., Wang, M., Li, Y. ja Wen, A. (2015). Jälkihoito 11--keto-beeta-boswelliinihapolla parantaa aivoiskemia-reperfuusiovauriota: Nrf2/HO-1 -reitti mahdollisena mekanismina. Mol. Neurobiol. 52 (3), 1430–1439. doi: 10,1007/s12035-014-8929-9

Dong, Q., Yao, J., Fang, JN ja Ding, K. (2007). Cistanche deserticola YC Ma:n kahden kylmällä vedellä uutettavan polysakkaridin rakenteellinen karakterisointi ja immunologinen aktiivisuus. Hiilihydraatti. Res. 342 (10), 1343–1349. doi: 10.1016/j.carres.2007.03.017

Donnan, GA, Fisher, M., Macleod, M. ja Davis, SM (2008). Aivohalvaus. Lancet 371 (9624), 1612–1623. doi: 10.1016/s0140-6736(08)60694-7

Duan, Q. ja Si, E. (2019). MicroRNA-25 pahentaa Abeta1-42--indusoitua aivotursohermosolujen vauriota Alzheimerin taudissa heikentämällä KLF2:ta Nrf2-signalointireitin kautta hiirimallissa. J. Cell Biochem. 120 (9), 15891–15905. doi: 10.1002/jcb.28861

ElAli, A. (2016). Neurovaskulaarisen yksikön signaloinnin merkitys vamman ja korjauksen välisen hienovaraisen tasapainon säätelyssä iskeemisen aivohalvauksen jälkeen. Neural Regener. Res. 11 (6), 914–915. doi: 10.4103/1673-5374.184485

Gaire, BP (2018). Yrttilääketiede iskeemisessä aivohalvauksessa: haasteita ja näkymiä. Leuka. J. Integr. Med. 24 (4), 243–246. doi: 10.1007/s11655-018-2828-2

Gao, Y., Jiang, Y., Dai, F., Han, Z., Liu, H., Bao, Z., et ai. (2015). Tutkimus laksatiivisista aineosista Cistanche deserticolassa YC Ma. Mod. Leuka. Med. 17 (04), 19–22 plus 26. doi: 10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.003

Gong, X., Xu, Y., Ren, K., Bai, X., Zhang, C. ja Li, M. (2019). Paraboea martinin fenyylietanoidiglykosidit suojaavat rotan feokromosytooma (PC12) -soluja vetyperoksidin aiheuttamalta soluvauriolta. Biosci. Biotechnol. Biochem. 83 (12), 2202–2212. doi: 10.1080/09168451.2019.1654359

Grefkes, C. ja Ward, NS (2014). Kortikaalinen uudelleenjärjestely aivohalvauksen jälkeen: kuinka paljon ja kuinka toimiva? Neuroscientist 20 (1), 56-70. doi: 10.1177/ 1073858413491147

Guzik, A. ja Bushnell, C. (2017). Aivohalvauksen epidemiologia ja riskitekijöiden hallinta. Continuum (Minneap Minn) 23 (1, Cerebrovascular Dis), 15–39. doi: 10.1212/con.0000000000000416

Hu, S., Wu, Y., Zhao, B., Hu, H., Zhu, B., Sun, Z., et ai. (2018). Panax notoginseng -saponiinit suojaavat aivojen mikrovaskulaarisia endoteelisoluja happi-glukoosin puutteelta/reperfuusion aiheuttamalta estehäiriöltä aktivoimalla PI3K/Akt/Nrf2-antioksidanttisignalointireittiä. Molekyylit 23 (11), 1-17. doi: 10,3390/molekyylit 23112781

Iwasawa, E., Ichijo, M., Ishibashi, S. ja Yokota, T. (2016). Kollateraalisen verenkierron akuutti kehitys ja terapeuttiset näkymät iskeemisessä aivohalvauksessa. Neural Regener. Res. 11 (3), 368–371. doi: 10.4103/1673-5374.179033

Ji, S., Li, S., Zhao, X., Kang, N., Cao, K., Zhu, Y., et ai. (2019). Fenyylietanoidiglykosidien, Torenoside B:n ja Savatiside A:n suojaava rooli Alzheimerin taudissa. Exp. Siellä. Med. 17 (5), 3755–3767. doi: 10.3892/tuote.2019.7355

Jiang, Y. ja Tu, PF (2009). Cistanche-lajin kemiallisten aineosien analyysi. J. Chromatogr. 1216 (11), 1970–1979. doi: 10.1016/ j.chroma.2008.07.031

Jiang, T., Yu, JT, Zhu, XC, Wang, HF, Tan, MS, Cao, L., et ai. (2014). Akuutti metformiinin esikäsittely antaa hermosuojan fokaalista aivoiskemiaa vastaan ​​aktivoimalla etukäteen AMPK-riippuvainen autofagia. Br. J. Pharmacol. 171 (13), 3146–3157. doi: 10.1111/bph.12655

Jiang, X., Andjelkovic, AV, Zhu, L., Yang, T., Bennett, MVL, Chen, J., et ai. (2018). Veri-aivoesteen toimintahäiriö ja toipuminen iskeemisen aivohalvauksen jälkeen. Prog. Neurobiol. 163-164, 144–171. doi: 10.1016/j.pneurobio.2017.10.001

Jung, JE, Kim, GS, Chen, H., Maier, CM, Narasimhan, P., Song, YS, et ai. (2010). Reperfuusio ja neurovaskulaarinen toimintahäiriö aivohalvauksessa: perusmekanismeista mahdollisiin hermosuojausstrategioihin. Mol. Neurobiol. 41 (2-3), 172–179. doi: 10,1007/s12035-010-8102-z

Kilkenny, C., Browne, WJ, Cuthill, IC, Emerson, M. ja Altman, DG (2010). Biotieteiden tutkimusraportoinnin parantaminen: ARRIVE-ohjeet eläintutkimuksen raportointiin. PLoS Biol. 8 (6), e1000412. doi: 10.1371/lehti. bio.1000412

Ko, KM ja Leung, HY (2007). Kiinan Yang ja Yin vahvistavat yrtit lisäävät ATP:n tuotantokapasiteettia, antioksidanttiaktiivisuutta ja immunomodulatorisia vaikutuksia. Leuka. Med. 2, 3. doi: 10.1186/1749-8546-2-3

Kondo, T., Reaume, AG, Huang, TT, Carlson, E., Murakami, K., Chen, SF, et ai. (1997). CuZn-superoksididismutaasin aktiivisuuden väheneminen pahentaa hermosolujen vaurioita ja turvotuksen muodostumista ohimenevän fokaalisen aivoiskemian jälkeen. J. Neurosci. 17 (11), 4180–4189. doi: 10.1523/JNEUROSCI.{8}}

Lee, M., Saver, JL, Alger, JR, Hao, Q., Starkman, S., Ali, LK, et ai. (2012). Veri-aivoesteen läpäisevyyden poikkeamat posteriorisen verenkierron iskeemisessä aivohalvauksessa: esiintymistiheys ja suhde hemorragiseen transformaatioon. J. Neurol. Sci. 313 (1-2), 142–146. doi: 10.1016/j.jns.2011.08.048

Li, N., Wang, J., Ma, J., Gu, Z., Jiang, C., Yu, L. et ai. (2015). Kaukoherbahoidon neuroprotektiiviset vaikutukset potilailla, joilla on kohtalainen Alzheimerin tauti. Evid-Based Complement Altern. Med. 2015, 103985. doi: 10.1155/2015/103985

Li, M., Xu, T., Zhou, F., Wang, M., Song, H., Xiao, X., et ai. (2018). Neljän fenyylietanoidiglykosidin neuroprotektiiviset vaikutukset H(2)O(2)-indusoituun apoptoosiin PC12-soluissa Nrf2/ARE-reitin kautta. Int. J. Mol. Sci. 19 (4), 1–17. doi: 10.3390/ijms19041135

Li, R., Zhao, M., Tu, P. ja Jiang, Y. (2019). Viiden fenyylietanoidiglykosidin samanaikainen määritys Cistanches Herbassa käyttämällä monikomponenttien kvantitatiivista analyysiä yhdellä markkerilla. J. Chin. Pharm. Sci. 28 (08), 537–546. doi: 10.5246/jcps.2019.08.051

Lian, J., Wang, L., Zhao, F., Lin, S., Yan, X., Jia, J., et ai. (2017). Cistanchen glykosidien vaikutukset synaptiseen morfologiseen plastisuuteen vanhenemiskiihdytetyillä hiirillä. J. Baotou Medl Coll. 33 (08), 78–80. doi: 10.16833/j.cnki.jbmc.2017.08.036

Liu, Y., Wang, D., Wang, H., Qu, Y., Xiao, X. ja Zhu, Y. (2014). HET0016:n suojaava vaikutus aivoturvotukseen ja veri-aivoesteen toimintahäiriöön aivoiskemian/reperfuusion jälkeen. Brain Res. 1544, 45–53. doi: 10.1016/ j.brainres.2013.11.031

Liu, P., Zhang, R., Liu, D., Wang, J., Yuan, C., Zhao, X., et ai. (2018). Veri-aivoesteen läpäisevyyden ja tiiviiden liitosproteiinien muutosten aika-arviointi pysyvän fokaalisen iskemian rottamallissa. J. Physiol. Sci. 68 (2), 121–127. doi: 10,1007/s12576-016-0516-6

Liu, S., Chang, L. ja Wei, C. (2019). Sonic hedgehog -reitti välittää Tongxinluo-kapselin aiheuttamaa suojaa veri-aivoesteen häiriötä vastaan ​​iskeemisen aivohalvauksen jälkeen hiirillä. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 124 (6), 660–669. doi: 10.1111/bcpt.13186

Lu, CW, Lin, TY, Huang, SK ja Wang, SJ (2016). Ekinakosidi estää glutamaatin vapautumista estämällä jännitteestä riippuvaisen Ca(2 plus) -pääsyn ja proteiinikinaasi C:n rotan aivokuoren hermopäätteissä. Int. J. Mol. Sci. 17 (7), 1–13. doi: 10.3390/ijms17071006

McGrath, JC, Drummond, GB, McLachlan, EM, Kilkenny, C. ja Wainwright, CL (2010). Ohjeet eläinkokeiden ilmoittamiseen: ARRIVE-ohjeet. Br. J. Pharmacol. 160 (7), 1573–1576. doi: 10.1111/j.{7}}.2010.00873.x

Mentor, S. ja Fisher, D. (2017). Aggressiivinen antioksidanttinen pelkistävä stressi heikentää aivojen endoteelisolujen angiogeneesiä ja veri-aivoesteen toimintaa. Curr. Neurovasc Res. 14 (1), 71–81. doi: 10.2174/1567202613666161129113950

Moretti, A., Ferrari, F. ja Villa, RF (2015). Neuroprotektio iskeemiselle aivohalvaukselle: nykytila ​​ja haasteet. Pharmacol. Siellä. 146, 23–34. doi: 10.1016/j.pharmthera.2014.09.003

Nyul-Toth, A., Suciu, M., Molnar, J., Fazakas, C., Hasko, J., Herman, H., et ai. (2016). Erot veri-aivoesteen molekyylirakenteessa aivokuoressa ja valkoisessa aineessa: in silico, in vitro ja ex vivo -tutkimus. Olen. J. Physiol. Sydän Circ. Physiol. 310 (11), H1702–H1714. doi: 10.1152/ajpheart.00774.2015

Ovbiagele, B. ja Nguyen-Huynh, MN (2011). Aivohalvauksen epidemiologia: lisäämme ymmärrystämme sairauden mekanismista ja hoidosta. Neurotherapeutics 8 (3), 319-329. doi: 10.1007/s13311-011-0053-1

Page, S., Munsell, A. ja Al-Ahmad, AJ (2016). Aivohypoksia/iskemia hajottaa selektiivisesti tiiviit liitoskompleksit kantasoluista peräisin olevissa ihmisen aivojen mikrovaskulaarisissa endoteelisoluissa. Nesteet CNS 13 (1), 16. doi: 10.1186/s12987-016-0042-1

Peng, F., Chen, J., Wang, X., Xu, C., Liu, T. ja Xu, R. (2016). Muutokset fenyylietanoidiglykosidien tasoissa, antioksidanttiaktiivisuudessa ja muissa laatuominaisuuksissa cistanche deserticola -viipaleissa höyrykäsittelyllä. Chem. Pharm. Sonni. (Tokio) 64 (7), 1024–1030. doi: 10.1248/CPB.c16-00033

Priestley, JRC, Fink, KE, McCord, JM ja Lombard, JH (2019). NRF2-aktivointi Protandimilla heikentää suolan aiheuttamaa verisuonten toimintahäiriötä ja mikrovaskulaarista harvinaistumista. Microcirculation, 26 (7), e12575. doi: 10.1111/sekalaiset 12575

Saboor, F., Reckmann, AN, Tomczyk, CU, Peters, DM, Weissmann, N., Kaschtanow, A., et ai. (2016). Nestiiniä ilmentävät verisuonen seinämän solut edistävät keuhkoverenpainetaudin kehittymistä. euroa Hengitä. J. 47 (3), 876-888. doi: 10.1183/13993003.{9}}

Satoh, T., Okamoto, SI, Cui, J., Watanabe, Y., Furuta, K., Suzuki, M., et ai. (2006). Keap1/Nrf2-reitin aktivointi hermosolujen suojaamiseksi elektrofiilisillä [elektrofiilisten korjaus] faasin II indusoreilla. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (3), 768–773. doi: 10.1073/pnas.0505723102

Schellinger, PD ja Kohrmann, M. (2014). Laskimonsisäiselle trombolyysille rekombinanttikudostyyppisellä plasminogeeniaktivaattorilla on 4.{2}}tunnin aikaikkuna. Stroke 45 (3), 912–913. doi: 10.1161/ insultaha.113.002700

Sealy-Jefferson, S., Wing, JJ, Sanchez, BN, Brown, DL, Meurer, WJ, Smith, MA, et ai. (2012). Ikä- ja etniset sukupuolierot aivohalvausriskissä. Gend Med. 9 (2), 121–128. doi: 10.1016/j.genm.2012.02.002

Shi, Z., Wu, Y., Zhu, Y., Cui, Wang, M., Yin, H., et ai. (2019). Betaiinin, mannitolin, fruktoosin, glukoosin ja sakkaroosin kvantitatiivinen määritys Cistanches Herbassa HPLC-ELSD:llä. Mod. Leuka. Med. 32 (6), 1–11. doi: 10.13313/ j.issn.{8}}.20190320006

Singh, D., Reeta, KH, Sharma, U., Jagannathan, NR, Dinda, AK ja Gupta, YK (2019). Monometyylifumaraatin neurosuojaava vaikutus iskemia-reperfuusiovaurioon rotilla: Nrf2/HO1-reitin rooli infarktin äärellä. Neurochem. Int. 126, 96–108. doi: 10.1016/j.neuint.2019.03.010

Siow, RC, Ishii, T. ja Mann, GE (2007). Antioksidanttigeenin ilmentymisen modulointi 4-hydroksinonenaalilla: Nrf2/ARE-transkriptioreitin aterosuojaava rooli. Redox Rep. 12 (1), 11–15. doi: 10,1179 / 135100007x162167

Suda, S., Katsura, K., Kanamaru, T., Saito, M. ja Katayama, Y. (2013). Valproiinihappo vaimentaa iskemia-reperfuusiovauriota rotan aivoissa estämällä oksidatiivista stressiä ja tulehdusta. euroa J. Pharmacol. 707 (1-3), 26–31. doi: 10.1016/j.ejphar.2013.03.020

Suzuki, T. ja Yamamoto, M. (2015). Keap1-Nrf2-järjestelmän molekyyliperusta. Vapaa Radic. Biol. Med. 88 (Pt B), 93–100. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2015.06.006

Tenreiro, MM, Ferreira, R., Bernardino, L. ja Brito, MA (2016). Veri-aivoesteen soluvaste vaurioille: Mahdolliset biomarkkerit ja terapeuttiset kohteet aivojen regeneraatiolle. Neurobiol. Dis. 91, 262–273. doi: 10.1016/j.nbd.2016.03.014

Thompson, JW, Narayanan, SV, Koronowski, KB, Morris-Blanco, K., Dave, KR ja Perez-Pinzon, MA (2015). Signalointireitit, jotka johtavat iskeemiseen mitokondrioiden hermosuojaukseen. J. Bioenerg. Biomembr. 47 (1-2), 101–110. doi: 10.1007/s10863-014-9574-8

Wang, T., Zhang, X. ja Xie, W. (2012). Cistanche deserticola YC Ma "Desert ginseng": arvostelu. Olen. J. Chin. Med. 40 (6), 1123–1141. doi: 10.1142/s0192415x12500838

Wang, X., Wang, S., Wang, J., Guo, H., Dong, Z., Chai, L., et ai. (2015). Xueshuantongin neurosuojaava vaikutus injektioon (lyofilisoitu) ohimenevässä ja pysyvässä rotan aivoiskemiamallissa. Evid-Based Complement Altern. Med. 2015, 134685. doi: 10.1155/2015/134685

Wang, D., Wang, H. ja Gu, L. (2017). Perinteisen kiinalaisen yrttistanchen masennuslääke ja kognitiiviset parantavat toimet. Evid-Based Complement Altern. Med. 2017, 3925903. doi: 10.1155/2017/3925903

Wang, FJ, Wang, SX, Chai, LJ, Zhang, Y., Guo, H. ja Hu, LM (2018). Xueshuantong-injektio (lyofilisoitu) yhdistettynä lyofilisoituun salvianoliinjektioon suojaa fokaaliselta aivoiskemialta/reperfuusiovauriolta rotilla vähentämällä oksidatiivista stressiä. Acta Pharmacol. Synti. 39 (6), 998–1011. doi: 10.1038/aps.2017.128Wei, Y., Gong, J., Thimmulappa, RK, Kosmider, B., Biswal, S. ja Duh, EJ (2013). Nrf2 toimii soluautonomisesti endoteelissä sääteleen kärkisolujen muodostumista ja verisuonten haarautumista. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110 (41), E3910–E3918. doi: 10.1073/pnas.1309276110

Xia, D., Zhang, Z. ja Zhao, Y. (2018). Akteosidi heikentää oksidatiivista stressiä ja hermosolujen apoptoosia rotilla, joilla on fokaalinen aivoiskemia-reperfuusiovaurio. Biol. Pharm. Sonni. 41 (11), 1645–1651. doi: 10.1248/bob.b18-00210

Xiong, W., MacColl Garfinkel, AE, Li, Y., Benowitz, LI ja Cepko, CL (2015). NRF2 edistää hermosolujen selviytymistä neurodegeneraatiossa ja akuutissa hermovauriossa. J. Clin. Sijoittaa. 125 (4), 1433–1445. doi: 10.1172/jci79735

Xu, HT, Zhang, CG, He, YQ, Shi, SS, Wang, YL ja Chou, GX (2019). Schnabelia centifolia (Benth.) PDCantino -lajin fenyylietanoidiglykosidit edistävät osteoblastien lisääntymistä. Phytochemistry 164, 111-121. doi: 10.1016/j.phytochem.2019.05.003

Ya, BL, Liu, Q., Li, HF, Cheng, HJ, Yu, T., Chen, L., et ai. (2018). Virtsahappo suojaa fokaalista aivoiskemiaa/reperfuusion aiheuttamalta oksidatiiviselta stressiltä aktivoimalla Nrf2:ta ja säätelemällä neurotrofisten tekijöiden ilmentymistä. Oksid. Med. Cell Longev 2018, 6069150. doi: 10.1155/2018/6069150

Ye, ZY, Xing, HY, Wang, B., Liu, M. ja Lv, PY (2019). DL-3-butyyliftalidi suojaa veri-aivoestettä iskemian/hypoksian aiheuttamilta vaurioilta säätelemällä tiiviitä proteiineja. Leuka. Med. J. (engl.) 132 (11), 1344–1353. doi: 10,1097/cm9,00000000000000232

Yu, Q., Li, X. ja Cao, X. (2016). Cistanche deserticolasta peräisin olevan fenyylietanoidiglykosidirikkaan uutteen sydänsuojaavat vaikutukset iskemian reperfuusion aiheuttamassa sydäninfarktissa rotilla. Ann. Vasc. Surg. 34, 234–242. doi: 10.1016/j.avsg.2016.04.002

Yu, N., Wang, Z., Chen, Y., Yang, J., Lu, X., Guo, Y., et ai. (2017). Kahdentoista Jing-kuoppapisteen parantava vaikutus pysyvän keskiaivojen iskemian aiheuttamaan aivoturvotukseen suojaamalla veri-aivoesteen tiukkoja liitoksia. BMC Complement Altern. Med. 17 (1), 470. doi: 10,1186/s12906-017-1979-6

Yu, W., Gao, D., Jin, W., Liu, S. ja Qi, S. (2018). Propofoli estää oksidatiivista stressiä vähentämällä sukkinaatin iskeemistä kertymistä fokaalisen aivoiskemia-reperfuusiovaurion yhteydessä. Neurochem. Res. 43 (2), 420–429. doi: 10.1007/s11064-017-2437-z

Yuen, CM, Chung, SY, Tsai, TH, Sung, PH, Huang, TH, Chen, YL jne. (2015). Kehonulkoinen shokkiaalto vaimentaa tehokkaasti aivoinfarktitilavuutta ja parantaa rotan neurologista toimintaa akuutin iskeemisen aivohalvauksen jälkeen. Olen. J. Transl. Res. 7 (6), 976–994.

Zechariah, A., ElAli, A., Doeppner, TR, Jin, F., Hasan, MR, Helfrich, I. et ai. (2013). Verisuonten endoteelin kasvutekijä edistää aivojen kapillaarien perisyyttipeittoa, parantaa aivojen verenkiertoa myöhemmän fokaalisen aivoiskemian aikana ja säilyttää metabolisen penumbran. Stroke 44 (6), 1690–1697. doi: 10.1161/strokeaha.111.000240

Zhang, QY, Wang, ZJ, Sun, DM, Wang, Y., Xu, P., Wu, WJ, et ai. (2017). Uudet terapeuttiset vaikutukset iskeemiseen aivohalvaukseen: BBB:n eheyden uudet mekanismit. Oksid. Med. Cell Longev 2017, 7150376. doi: 10.1155/2017/7150376

Zhang, R., Xu, M., Wang, Y., Xie, F., Zhang, G. ja Qin, X. (2017). Nrf2-lupaava terapeuttinen kohde aivohalvauksen oksidatiivista stressiä vastaan. Mol. Neurobiol. 54 (8), 6006–6017. doi: 10.1007/s12035-016-0111-0

Zhang, A., Yang, X., Li, Q., Yang, Y., Zhao, G., Wang, B., et ai. (2018). Cistanche deserticolasta peräisin olevien vedellä uutettavien polysakkaridien immunostimulatorinen aktiivisuus kasvien adjuvanttina in vitro ja in vivo. PLoS One 13 (1), e0191356. doi: 10.1371/journal.pone.0191356

Zhang, Y., Wang, K., Chen, H., He, R., Cai, R., Li, J., et ai. (2018). Isodon terricolous (D.Don) Kudon juuresta peräisin olevat tulehdusta estävät lignaanit ja fenyylietanoidiglykosidit. Phytochemistry 153, 36-47. doi: 10.1016/ j.phytochem.2018.05.017

Zhang, K., Zhang, Q., Deng, J., Li, J., Li, J., Wen, L., et ai. (2019). ALK5-signalointireitti välittää neurogeneesiä ja toiminnallista palautumista aivoiskemian/reperfuusion jälkeen rotilla Gadd45b:n kautta. Cell Death Dis. 10 (5), 360. doi: 10,1038/s41419-019-1596-z

Eturistiriita:

Kirjoittajat vakuuttavat, että tutkimus tehtiin ilman kaupallisia tai taloudellisia suhteita, jotka voitaisiin tulkita mahdolliseksi eturistiriitaksi.

Käsittelyeditori ilmoitti tarkasteluhetkellä olevansa jaettu, vaikkakaan ei tehnyt muuta yhteistyötä tekijöiden KZ:n ja YJ:n kanssa.

Copyright © 2020 Wang, Li, Tu, Chen, Zeng ja Jiang. Tämä on avoimen pääsyn artikkeli, jota jaetaan Creative Commons Attribution License -lisenssin (CC BY) ehtojen mukaisesti. Käyttö, jakelu tai jäljentäminen muilla foorumeilla on sallittua edellyttäen, että alkuperäiset kirjoittajat ja tekijänoikeuksien omistajat mainitaan ja että alkuperäiseen julkaisuun tässä lehdessä viitataan hyväksytyn akateemisen käytännön mukaisesti. Näiden ehtojen vastainen käyttö, jakelu tai jäljentäminen ei ole sallittua.

For more information:1950477648nn@gmail.com