Munuaisten fibrogeneesiohjelmaa ohjaavat oksidatiivista aineenvaihduntaa säätelevät mikroRNA:t

Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc, d.

Santiago Lamesa,**

Fysiologisten ja patologisten prosessien ohjelma, Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Espanja

b Genomic Facility, Parque Científico de Madrid, Madrid, Espanja

c Patologian laitos, Hospital Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Espanja

d Lääketieteen ja lääketieteen erikoisalojen osasto, yliopistosairaalan "Príncipe de Asturias" tutkimussäätiö, IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Espanja

Avainsanat: MikroRNAS, Munuaisfibroosi, Rasvahappohapetus, Solunulkoinen matriisi, CPT1A, Mitokondriot

cistanche-kehonrakennus on erittäin hyvä munuaisten toiminnalle

A B S T R A C T

Liiallinen ekstrasellulaarisen matriisin (ECM) kerääntyminen on fibroottisten sairauksien tunnusmerkki. Munuaisissa se on yleisten sairauksien viimeinen yhteinen reitti, joka johtaa krooniseen munuaisten vajaatoimintaan. Vaikka sytokiineilla, kuten TGF-, on olennainen rooli myofibroblastitransformaatiossa, viimeaikaiset työt ovat osoittaneet, että mitokondrioiden toimintahäiriön ja viallisen rasvahappohapettumisen (FAO), jotka vaarantavat munuaisten tubulusepiteelisolujen pääenergialähteen, on ehdotettu olevan perustavanlaatuisia vaikuttajia. munuaisfibroosin kehittymiseen ja etenemiseen. MikroRNA:iden (miRNA:iden), jotka säätelevät geeniekspressiota transkription jälkeen, on raportoitu säätelevän munuaisten fibrogeneesiä. Tunnistaaksemme miRNA:t, jotka osallistuvat munuaisfibroosin aineenvaihduntahäiriöihin, suoritimme miRNA-sarjan seulonnan unilateraalisen virtsanjohtimen tukkeuman (UUO) hiirimallissa. MiR-150-5p ja miR-495-3p valittiin niiden yhteyden ihmisen patologiaan, niiden roolin mitokondrioiden aineenvaihdunnassa ja niiden kohdistuksen perusteella rasvahappoja kuljettavaan entsyymiin CPT1A. Löysimme miR-150-5p:n ja miR-495-5p:n 2-- ja 4-kertaisen nousun sekä UUO- että foolihapon aiheuttaman nefropatian (FAN) malleissa. , kun taas TGF- 1 tehosti niiden ilmentymistä ihmisen munuaisten tubulusepiteelisolulinjassa HKC-8. Nämä miRNA:t synergisoituivat TGF:n kanssa sen profibroottisen vaikutuksen suhteen tehostamalla fibroosiin liittyviä markkereita Acta2, Col{16}} ja Fn1. Bioenergeettiset tutkimukset osoittivat FAO:hon liittyvän hapenkulutusnopeuden (OCR) laskun HKC-8-soluissa molempien miRNA:iden läsnä ollessa. Johdonmukaisesti niiden mitokondrioihin liittyvien kohdegeenien CPT1A, PGC1 ja mitokondriaalisen transkriptiotekijä A:n (TFAM) ilmentymistasot vähenivät puoleen näille miRNA:ille altistuvissa munuaisten epiteelisoluissa. Sitä vastoin emme havainneet muutoksia mitokondrioiden massassa ja transmembraanipotentiaalissa (ΔѰm) tai mitokondrioiden superoksidiradikaalianionituotannossa. Tietomme tukevat sitä, että miR-150 ja miR- 495 voivat edistää munuaisten fibrogeneesiä pahentamalla aineenvaihdunnan vajaatoimintaa, joka liittyy kriittisesti tubulaarisiin epiteelisoluihin, mikä lopulta johtaa fibroosiin.

1. Esittely

Krooninen munuaissairaus (CKD) on kliininen tila, jossa munuaisten toiminnan heikkeneminen säilyy. Sitä pidetään yleensä peruuttamattomana ja progressiivisena. Se on tärkeä kansanterveysongelma, joka voi koskea 12–14 prosenttia väestöstä [1]. Sitä voi esiintyä noin 30–40 prosentilla potilaista, joilla on erittäin yleisiä sairauksia, kuten diabetes mellitus ja verenpainetauti, missä se vaikuttaa osaltaan kehityksen ja ennusteen määräämiseen. Sairauden etiologiasta riippumatta kroonisen munuaisten vajaatoiminnan eteneminen johtaa tubulus-interstitiaaliseen ja glomerulaariseen fibroosiin [2]. Tubulo-interstitiaalinen fibroosi sisältää tubulaarisen tyvikalvon ja peritubulaaristen kapillaarien välisen tilan laajentamisen matriisiproteiinien (ECM) (pääasiassa tyypin I ja III kollageenin ja fibronektiinin) kerrostumisen seurauksena tulehdussolujen, tubulussolujen katoamisen ja myofibroblastien kertymisen yhteydessä. [3].

Transformoivaa kasvutekijää (TGF-) pidetään tärkeänä kaikkialla esiintyvänä pro-fibroottisena sytokiinina ja myofibroblastien erilaistumisen pääsäätelijänä fibroosissa [4]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että rasvahappojen hapettumisen (FAO) globaali vika, joka johtaa kompromissiin tubulaaristen epiteelisolujen pääenergialähteessä, on tärkeä rooli munuaisfibroosin kehittymisessä [5,6]. TGF- suppressoi FAO:ta SMAD3-- ja PGC1A-riippuvaisella tavalla ja vaikuttaa siten rasvahappojen oton ja hapettumisen transkription säätelijöihin, mukaan lukien CPT1A [5]. Muutokset FAO:ssa johtavat lopulta solunsisäiseen lipidien kertymiseen ja ATP:n ehtymiseen, mikä johtaa fibroosiin [5,7]. Siten strategiat, joiden tarkoituksena on palauttaa kroonisessa munuaissairaudessa esiintyvä aineenvaihduntahäiriö, voivat tarjota terapeuttisia vaihtoehtoja [8].

MikroRNA:t (miRNA:t) ovat nousseet kriittisiksi geeniekspression säätelijöiksi vaikuttaessaan transkription jälkeiseen säätelyyn. Munuaisissa miR:illä on osoitettu olevan ratkaiseva rooli nefrogeneesissä, homeostaasissa ja taudeissa [9]. MiRNA:t kykenevät myös säätelemään fibroottisia prosesseja, ja niitä on kutsuttu "fibroosiksi" [10]. Lisäksi, koska tehokasta hoitoa munuaisten fibrogeneesin estämiseksi tai palauttamiseksi ei ole [11], miRNA:n ilmentymisen manipulointia miRNA-mimeikkojen tai inhibiittoreiden in vivo -kuljetuksella on ehdotettu lupaavaksi terapeuttiseksi strategiaksi CKD:lle [12]. Lisäksi kiertävät miRNA:t voivat muodostaa diagnostisia ja jopa prognostisia biomarkkereita [13].

MiRNA-välitteinen munuaisfibroosin hallinta tapahtuu pääasiassa säätelemällä TGF- 1-signalointia solu- ja kontekstiriippuvaisella tavalla käyttämällä Smad-reittiä yhtenä pääkohteista [14]. Aiemmassa työssämme olemme tunnistaneet useita miRNA:ita, joilla on vaikutusta munuaisfibroosiin säätelemällä spesifisiä aineenvaihduntareittejä [15,16]. miR-9-5p:n liiallinen ilmentyminen estää tubulaaristen epiteelisolujen erilaistumista ja ohjelmoi uudelleen fibroosiin liittyvän aineenvaihduntahäiriön [16], kun taas miR-33:n, joko geneettisen tai farmakologisen, toiminnan menetys johtaa lisääntyneeseen FAO ja lipidien kertymisen estäminen putkimaisissa epiteelisoluissa. Tämä liittyy lisääntyneeseen energian saantiin, parantuneeseen mitokondrioiden bioenergetiikkaan ja kokeellisen munuaisfibroosin ehkäisyyn [15]. Siten solujen bioenergetiikkaa säätelevät miRNA:t pystyvät säätelemään myös munuaisten fibrogeneesiä. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet miRNA-pohjaista strategiaa unilateral ureteral obstructio (UUO) kroonisen munuaisvaurion mallissa tunnistaaksemme miRNA:t, jotka osallistuvat munuaisten fibroottiseen fenotyyppiin aineenvaihduntareittejä modifioimalla. Valitsemalla useita mitokondrioiden toimintaan liittyviä geenejä (CPT1A, TFAM, PGC1A) tunnistimme sekä miR-150 että miR-495 miRNA:iksi, jotka pystyvät vähentämään FAO:hon liittyvää hapenkulutusnopeutta (OCR) ja edistämään TGF{:ta. {21}}indusoitu fibrogeeninen transformaatio ihmisen munuaisten tubulusepiteelisolulinjassa HKC-8. Tuloksemme korostavat miRNA:iden merkitystä mitokondrioiden aineenvaihdunnan säätelijöinä, jotka osallistuvat munuaisten fibrogeneesiin.

2. Materiaali ja menetelmät

Solulinjat ja viljelyolosuhteet. Ihmisen munuaisten proksimaalisia tubulaarisia epiteelisoluja (HKC-8) viljeltiin DMEM/F12:ssa (Dulbeccon modifioitu Eaglen elatusaine 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY), jota oli täydennetty 15 mM HEPES:llä, 5 prosenttia (tilavuus/tilavuus) naudan sikiön seerumi (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1 x insuliini-transferriini-seleeni (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0,5 ug/ml hydrokortisonia (Sigma, St. Louis, MO), 50 yksikköä/ ml penisilliiniä ja 50 ug/ml streptomysiiniä (Gibco, Rockville, MD) 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Tämän solulinjan toimitti ystävällisesti tohtori Susztakin laboratorio (Philadelphia, Pennsylvania, USA). Hoidot ihmisen rekombinantilla 10 ng/ml TGF- 1:lla (R&D Systems, Minneapolis, MN) suoritettiin HKC-8-solujen seerumittoman nälkään 12 tunnin ajan.

Transfektiomenettely. Solut kylvettiin 60 mm:n viljelymaljoille 70 prosentin konfluenssin saavuttamiseksi. Ne transfektoitiin 40 nM:lla joko miR-150-, miR-495-, miR-495- tai mirVana™-miRNA-matkija (Ambion Company, USA) käyttämällä lipofectamine 2000:ta (Invitrogen, Carlsbad, CA). . Soluja inkuboitiin lipofektamiini-pre-miRNA:n kanssa 37 °C:ssa 6 tuntia. Sen jälkeen viljelymaljoille lisättiin 5 ml tuoretta väliainetta, joka sisälsi 10 prosenttia FBS:ää, ja soluja pidettiin viljelmässä 6 tuntia, kunnes niitä käytettiin seuraaviin kokeisiin. Yhdistettynä TGF- 1-käsittelyn kanssa sitä levitettiin soluihin miRNA:iden yli-ilmentymisen jälkeen edellisen osan mukaisesti.

Immunoblot. Solut pestiin PBS:ssä, homogenisoitiin ja hajotettiin 100 μl:ssa RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi 150 mM NaCl:a, 0,1 % SDS:ää, 1 % natriumdeoksikolaattia, 1 % NP-40:a ja 25 mM Tris- HCl pH 7,6 proteaasin (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) ja fosfataasin estäjien (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) läsnä ollessa ja kerätty kaapimalla. Neljännesosa kustakin munuaisnäytteestä (saatu puoliksi leikkaamisen jälkeen sekä pituussuunnassa että poikittain) homogenisoitiin 300 ul:ssa RIPA-puskuria 5 mm:n ruostumattomasta teräksestä valmistettujen helmien kanssa (Qiagen, Valencia, CA) käyttäen TissueLyser LT:tä (Qiagen, Valencia, CA) värähtelemällä 50 Hz 15 minuutin ajan 4 ◦ C:ssa. Näytteet kirkastettiin sentrifugoimalla 10, 000 g 15 minuuttia 4 ◦ C:ssa. Sitten pelletti heitettiin pois ja supernatantti pidettiin proteiinilysaattina. Proteiinipitoisuudet määritettiin BCA Protein Assay Kitillä (Thermo Scientific, Rockford, IL) ja mitattiin Glomax®-Multi Detection System -järjestelmässä (Promega, Madison, WI). Yhtä suuret määrät proteiinia (10–50 ug) kokonaisuutteesta erotettiin 8–10-prosenttisilla SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin nitroselluloosablottauskalvoille (GE Healthcare, Chicago, IL) 12 V jännitteellä 20 minuutin ajan puolikuivassa. Trans-Blot Turbo -järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, Kalifornia).

Kalvot estettiin inkuboimalla 1 tunti 5 % rasvattoman maidon kanssa PBS:ssä, joka sisälsi 0,5 % Tween-20, ja blotattiin yön yli spesifillä vasta-aineilla: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C yön yli), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C yön yli), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15 000; 1 h, huoneenlämpötila ). IRDye 800 goat anti-babit ja IRDye 600 goat anti-hiiri (1:15 000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) sekundaaristen vasta-aineiden kanssa inkuboinnin jälkeen kalvot kuvattiin kolmena kappaleena Odyssey Infrared Imaging System -järjestelmällä (LI-COR Biosciences) Lincoln, NE). Bandensitometria suoritettiin käyttämällä ImageJ 1.48 -ohjelmistoa (http://rsb.info.nih.gov/ij) ja suhteellinen proteiiniekspressio määritettiin normalisoimalla GAPDH:ksi. Taittomuutokset normalisoitiin kontrollitilan arvoihin.

RNA:n uuttaminen. Kokonais-RNA uutettiin HKC{0}}-soluista tai hiiren munuaisista käyttämällä miRNeasy Mini Kit -sarjaa (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA:n määrä ja laatu määritettiin 260 nm:ssä Nanodrop-1000-spektrofotometrillä (Thermo Scientific, Rockford, IL).

mRNA:n ilmentymisen analyysi. Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin 500 ng:lla kokonais-RNA:ta käyttämällä iScript™ cDNA Synthesis -kittiä (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT-PCR suoritettiin iQ™SYBR Green Supermixillä (Bio-Rad, Hercules, CA) käyttämällä 96-kuoppa Bio-Rad CFX96 RT-PCR -järjestelmää C1000 Thermal Cyclerin kanssa (Bio-Rad, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ct-arvo saatiin kustakin vahvistuskäyrästä käyttämällä valmistajan toimittamaa CFX96-analyysiohjelmistoa. Suhteellinen mRNA:n ilmentyminen määritettiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää [17]. 18S-geeniä käytettiin normalisointitarkoituksiin. mRNA:n kvantifiointiin käytetyt alukesekvenssit olivat: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), CGTGGGTCC1, CGTGGGTCC1, CGTGATTGTTTTGTTGTTGTTGTT GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGCCATGW), RV: CCACTGTCATCTCATCATCATCATCC, RV: CCACTCCTAGGATTGTTGACATGA. Taittomuutokset normalisoitiin kontrollitilan arvoihin.

MiRNA:n ilmentymisen kvantifiointi. MiRNA:iden ilmentymisen kvantifiointi suoritettiin käyttämällä miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT -kittiä (Exiqon, Feedback, Tanska). RT:n jälkeen cDNA-templaatti monistettiin käyttämällä mikroRNA-spesifisiä LNA-alukkeita kypsälle miR150-5p:lle tai miR-495-3p:lle (Exiqon, Feedback, Tanska). qRT-PCR suoritettiin 96-kuoppaisessa Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR-järjestelmässä C1000 Thermal Cyclerin kanssa käyttäen iQ™ SYBR Green Supermixiä (Bio-Rad, Hercules, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. . Ct-arvo kolmen rinnakkaisen kuopan osalta saatiin kustakin monistuskäyrästä käyttämällä CFX Manager Bio-Rad -ohjelmistoa (Bio-Rad, Hercules, CA). Ct-arvot normalisoitiin endogeeniseen kontrolliin 5S rRNA:han. Plasman miRNA-tasot normalisoitiin arvoon miR-103a-5p. Suhteellinen miRNA:n ilmentyminen määritettiin käyttämällä 2 − ΔΔCt menetelmää [17]. Taittomuutokset normalisoitiin kontrollitilan arvoihin.

Munuaisfibroosin hiirimallit. Hiiret pidettiin CBMSO:n erityispatogeenittomassa (SPF) eläintilassa EU:n määräysten mukaisesti kaikkien toimenpiteiden osalta. Eläimiä käsiteltiin Euroopan parlamentin direktiiviin 2010/63/EU sisältyvän koe-eläinten hoito- ja käyttöoppaan mukaisesti. Hyväksynnän myönsivät Madridin Centro de Biología Molecular "Severo Ochoan" paikallinen eettinen arviointilautakunta, CSIC:n eettinen komitea ja Comunidad de Madridin eläinkoemenettelyjä sääntelevä yksikkö.

Yksipuolinen virtsanjohtimen tukos (UOO): UUO-leikkaustoimenpiteet suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla [18]. Lyhyesti sanottuna hiiret nukutettiin isofluraanilla (3–5 prosenttia induktioon ja 1–3 prosenttia ylläpitoon) ja jaettiin kahteen koeryhmään: UUO-ryhmään ja valeleikkausryhmään. UUO-ryhmässä hiiret ajeltiin vatsan vasemmalle puolelle, ihon läpi tehtiin pystysuora viilto skalpellilla ja iho vedettiin sisään. Toinen viilto tehtiin vatsakalvon läpi munuaisen paljastamiseksi. Vasen virtsanjohdin sidottiin kahdesti 15 mm munuaislantion alapuolelle kirurgisella silkillä ja virtsanjohdin erotettiin sitten kahden ligatuurin välistä. Sitten ligatoitu munuainen asetettiin varovasti takaisin oikeaan anatomiseen asentoonsa ja lisättiin steriiliä suolaliuosta nestehukan täydentämiseksi. Viillot ommeltiin ja hiiret laitettiin yksittäin häkkiin. Valeleikkaus suoritettiin samalla tavalla, mutta ilman virtsanjohtimen ligaatiota. Buprenorfiinia käytettiin kipulääkkeenä. Ensimmäinen annos annettiin 3 0 min ennen leikkausta ja sitten 12 tunnin välein 72 tunnin ajan annoksella 0,05 mg/kg ihonalaisesti. Tässä mallissa munuaisten verenvirtaus ja munuaiskerästen suodatusnopeus vähenevät merkittävästi 24 tunnin kuluessa ja interstitiaalinen tulehdus (huippu 2–3 päivässä), tubulusten laajentuminen, tubulusatrofia ja fibroosi ovat ilmeisiä 7 päivän kuluttua. Tukeutunut munuainen saavuttaa maksimaalisen toimintahäiriön noin 2 viikon kuluttua toimenpiteestä. Hiiret tapettiin CO2-yliannostuksella ja kontrolli- ja tukkeutuneita munuais- ja verinäytteitä kerättiin PBS:llä suoritetun perfuusion jälkeen 3, 5, 7, 10 ja 15 päivää UUO:n jälkeen.

Foolihapon aiheuttama nefropatia (FAN): Tässä mallissa munuaisfibroosi indusoitiin intraperitoneaalisella (ip) injektiolla 250 mg foolihappoa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) painokiloa kohti liuotettuna 0.3 M natriumbikarbonaatti (vehikkeli), kuten aiemmin on kuvattu [19]. Kontrollieläimet saivat 0,3 ml vehikkeliä (ip). Hiiret tapettiin CO2-yliannostuksesta ja munuaiset ja verinäytteet kerättiin PBS-perfuusion jälkeen 15 päivän FA:n antamisen jälkeen.

mikroRNA-profilointi. Spesifisten fibroottista lopputulosta säätelevien miRNA-molekyylien tunnistamiseksi mikroRNA-profiloinnin alustaksi valittiin Custom miRCURY LNA -mikroRNA-ryhmä (Exiqon, Feedback, Tanska). Tämä alusta koostui yhteensä 175 ainutlaatuisesta määrityksestä, jotka olivat spesifisiä Sanger miRBase v22.1:ssä (http://microrn a.sanger.ac. UK) oleville hiiren miRNA:ille. Jokaiselle mikroRNA:lle valittiin vallitseva juoste analyysiä varten. MiR-valinta perustui ennustettuihin kohdegeeneihin, jotka liittyvät munuaisfibroosiin, mitokondrioiden aineenvaihduntaan, redox-prosesseihin ja vuorokausirytmiin. Tämä analyysi tehtiin bioinformatiikan työkaluilla sekvenssipohjaiseen miRNA-kohteen ennustamiseen, mikrokosmos [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) ja miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). RNA:n uuttamisen jälkeen 7 vuorokauden UOO-munuaisnäytteistä 20 ng:ssa kokonais-RNA:ta läsnä olevalle miRNA-fraktiolle suoritettiin käänteistranskriptio käyttämällä miRCURY LNA RT -kittiä (Exiqon, Feedback, Tanska) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tuloksena saadut cDNA:t analysoitiin miRCURY miRNA PCR -paneeleilla Roche LightCycler 480 Real-Time PCR -järjestelmässä käyttämällä miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mixiä (Exiqon, Feedback, Tanska). Jokainen näyte analysoitiin kahtena kappaleena. Tämä toimenpide suoritettiin Fundacion Parque Científico de Madridin genomiikkalaitoksessa (Madrid, Espanja). LC480-ohjelmistoa käytettiin Cq-arvojen (Cq) saamiseksi kullekin miRNA:lle. Delta Ct (ΔCt) -arvo laskettiin normalisoimalla Ct-arvot endogeeniseen taloudenhoitoon snRNAU6. Lämpökartta luotiin reaaliaikaisilla PCR-tiedoilla, jotka esitettiin muodossa ΔCt. Hierarkkinen klusterointi rakennettiin ΔCt-arvojen mukaan. Delta Ct (ΔΔCt) -arvo laskettiin vähentämällä vertailunäyteryhmän (kontrollimunuainen) ΔCt kunkin tukkeutuneen munuaisnäytteen ΔCt:stä. Kunkin miRNA:n suhteellinen kvantifiointi (RQ) tai kertamuutos luotiin käyttämällä 2-ΔΔCt-menetelmää [17]. Erilaisesti ekspressoituneet miRNA:t tunnistettiin parametrisella Limma-testillä. Useiden hypoteesien testauksen huomioon ottamiseksi P-arvoja säädettiin (adj.) käyttämällä Benjamini–Hochbergin väärän havaitsemisnopeuden (FDR) korjausta [25]. Tulokset piirrettiin tulivuoren kuvaajalla.

miRNA-analyysi CKD-potilaiden veriplasmassa. Valittujen miRNA:iden tasot analysoitiin plasmanäytteistä 100 CKD-potilaan kohortista, joka on kuvattu yksityiskohtaisesti alla. Perifeerinen laskimoveri kerättiin EDTA-suihkupäällystettyihin tyhjiöastioihin (BD, Franklin Lakes, NJ). Plasman saamiseksi verta sentrifugoitiin 400 g 20 minuuttia, supernatantti siirrettiin uuteen putkeen ja sentrifugoitiin 800 g:llä 20 minuuttia. Plasma kerättiin ja säilytettiin jäädytettynä erissä -80 ◦ C:ssa. Plasman miRNA uutettiin verestä käyttämällä miRCURYTM RNA Isolation Kit -Biofluidsia ja UniSp2 Spike-in RNA:ta (Exiqon, Vedbaeck, Tanska). Näiden näytteiden miR-150-tasojen analyysit suoritettiin miRNA:n ilmentymisen kvantifiointi -osiossa kuvatulla tavalla. Hapenkulutusnopeuden mittaukset. Rasvahappojen hapettumiseen liittyvää hapenkulutusnopeutta (OCR) (ligatoitu oksidatiiviseen fosforylaatioon) ja solunulkoista happamoitumisnopeutta (ECAR) (liittyy laktaatin tuotantoon ja glykolyysiin) tutkittiin Seahorse Biosciencen aineenvaihdunta-analysaattorilla valmistajan ohjeiden mukaisesti [26]. HKC-8-solut kylvettiin p60-levylle ja mikroRNA-transfektio suoritettiin edellä kuvatulla tavalla, kun ne saavuttivat 70 prosentin konfluenssin 48 tuntia myöhemmin, HKC-8-soluja käsiteltiin 10 ng/ml TGF{{:lla. 18}} 48 tunnin ajan. Sitten solut kylvettiin 2 x 104 solua per kuoppa Seahorse Bioscience XFe24 -soluviljelymikrolevylle (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Solujen kiinnittymisen jälkeen kasvualusta korvattiin substraattirajoittetulla alustalla, Dulbecco's Modified Eagle Mediumilla (DMEM), jota oli täydennetty 0,5 mM glukoosilla ja 1 mM glutamaattilla. Tunti ennen määritysmittausta soluja inkuboitiin Krebs-Henseleit-puskurin (KHB) -määritysväliaineen kanssa, johon oli lisätty 0,2 prosenttia karnitiinia, 37 °C:ssa ilman CO2:ta. Viisitoista minuuttia ennen määritystä CPT1-inhibiittori Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 µM lisättiin vastaaviin kuoppiin ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa ilman CO2:ta. Lopuksi, välittömästi ennen määritystä, lisättiin BSA:ta tai 200 µM Palmitaatti-BSA FAO -substraattia (Agilent Technology, Santa Clara, CA, USA). Välittömästi XF Cell Mito -stressitesti suoritettiin Seahorse XFe24 -energia-analysaattorissa lisäämällä peräkkäin useita mitokondrioiden toiminnan modulaattoreita. Ensin käytettiin ATP-syntaasin estäjää oligomysiiniä (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 µM) perusmittauksen jälkeen. Tämä vähentää elektronien virtausta ETC:n läpi, mikä johtaa mitokondrioiden hengityksen vähenemiseen. Seuraavaksi lisättiin irrotusaine syanidi 4-(trifluorimetoksi)fenyylihydratsoni (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), joka romuttaa protonigradientin ja häiritsee mitokondrioiden kalvopotentiaalia. Tämän seurauksena elektronivirtaus ETC:n läpi on estynyt ja kompleksin IV hapenkulutus saavuttaa maksiminsa. Kolmas ja viimeinen injektio on kompleksi III- ja I-inhibiittorien antimysiini/rotenoni (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) seos (1 µM). Tämä yhdistelmä sulkee mitokondrioiden hengityksen ja mahdollistaa mitokondrioiden ulkopuolisten prosessien ohjaaman ei-mitokondriaalisen hengityksen laskemisen. Substraatit/inhibiittorit valmistettiin samassa väliaineessa, jossa koe suoritettiin, ja ne ruiskutettiin reagenssiporteista automaattisesti ilmoitettuina aikoina. Mittaukset rekisteröitiin 3-minuutin ajan (yhteensä 2 tunnin aikana) ja arvot normalisoitiin kokonaisproteiinipitoisuudelle. Proteiini uutettiin kuopista 0,1-prosenttisella NP-40-PBS-liuoksella ja kvantifioitiin BCA-proteiinimäärityksellä (Thermo Scientific, Rockford, IL). Jokaisessa koeryhmässä käytettiin neljää kuoppaa. Merihevosen XFp-solumito-stressitestiä käytettiin mitokondrioiden toiminnan tärkeimpien parametrien määrittämiseen: mitokondrion perushengitys, ATP-sidottu hengitys, protonivuoto (ei--- ATP-sidottu hapenkulutus), maksimaalinen hengitys, ei-mitokondriaalinen hengitys. , ja varahengityskapasiteetti, kuten aiemmin on kuvattu [27].

Lusiferaasimääritys. MiRNA-150- ja miRNA-495-ehdokkaiden sitoutumiskohtien karakterisoimiseksi ihmisen CPT1A 3'-UTR:ssa lusiferaasireportterimääritys, joka sisältää CPT1A 3'-UTR:n (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, tuote). ID S814347) käytettiin. Kohdennettuja mutaatioita ennustettujen miR-150- ja miR-495-kohtien siemenalueilla 3′ - UTR:issä luotiin käyttämällä Multisite-QuikChange-suunnattua mutageneesipakkausta (Stratagene, La Jolla, CA) mukaisesti. valmistajan protokollaan. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), Kaikki konstruktit sekvensoitiin ennen käyttöä niiden oikean rakenteen varmistamiseksi. HKC-8-solut kylvettiin ap24-kuoppalevylle ja transfektoitiin ohimenevästi 200 ng:lla pLightSwitch_CPT1A_3'-UTR:lla (ehjä tai mutatoitunut rakennelma) ja 4 ng pGL3-Promoter (tulikärpäsen lusiferaasi SV40-promoottorin ohjauksessa) (Promega Corporation, Madison, WI, USA) reportteriplasmideja ja 40 nM jompaakumpaa mirVana™ miRNA:ta miR-150, miR -495 tai mirVana™ miRNA jäljittelee negatiivista kontrollia (Ambion Company, USA) käyttämällä lipofectamine 2000:ta (Invitrogen, Carlsbad, CA), kun ne saavuttivat 70 prosentin konfluenssin, kuten edellä on kuvattu. Jokaisessa koeryhmässä käytettiin neljää kuoppaa. Lusiferaasimääritykset suoritettiin 24 tuntia myöhemmin käyttämällä Dual-Luciferase reportterijärjestelmää (Promega, Madison, WI). Vanilja- ja tulikärpäsen lusiferaasisignaalit havaittiin käyttämällä Glomax-monitoimitunnistusjärjestelmää (Promega Corporation, Madison, WI, USA). Renillalusiferaasin aktiivisuus normalisoitui tulikärpäsen lusiferaasiaktiivisuudella.

Mitokondriaalinen kalvopotentiaali (MMP). Muutokset MMP:ssä määritettiin eroina tetrametyylirodamiinimetyyliesterin (TMRM) fluoresenssissa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Se kerääntyy negatiivisesti varautuneisiin polarisoituneisiin mitokondrioihin ja fluoresoi oranssina. Kun mitokondrioiden kalvopotentiaali romahtaa apoptoottisissa tai metabolisesti stressaantuneissa soluissa, TMRM-reagenssi hajoaa koko solun sytosoliin ja fluoresenssitasot laskevat dramaattisesti. HKC-8-soluja viljeltiin ja transfektoitiin soluviljelyä ja transfektiomenettelyä koskevissa osissa kuvatulla tavalla. Seuraavaksi kasvualusta korvattiin fenolipunavapaalla Hank's Balanced Salt Solutionilla (HBSS), jossa oli 10 mM Hepes. Positiivisina ja negatiivisina kontrolliolosuhteina käytettiin käsittelyä oligomysiinillä (5 µM) ja FCCP:llä (4 µM) 5 minuutin ajan. Seuraavaksi solut värjättiin 250 nM TMRM:llä 30 minuuttia 37 ◦ C:ssa. Solut kerättiin trypsiinillä, sentrifugoitiin (3000 rpm, 5 min) ja pelletti suspendoitiin uudelleen 200 µl:aan HBSS:ää, jossa oli 1 %. Naudan seerumialbumiini (BSA) ja 5 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappo (EDTA). Fluoresenssin intensiteetti mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä TMRM:n (FL2) emissioaallonpituutta 570 nm [28] BD FacsCantoTM II -järjestelmässä (BD Bioscience, San Jos, CA) ja analysoitiin FlowJo 10.2 -ohjelmistolla (FlowJo, LLC, Ashland). , TAI). Jokaisessa koetilanteessa vähintään 20 000 singlettiä analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Mitokondrioiden superoksidiradikaalianionien tuotanto. Superoksidiradikaalianionituotannon arviointi suoritettiin käyttämällä Mito-SOX™ Red mitokondrioiden superoksidiradikaalianionin indikaattoria (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), erittäin selektiivistä fluorogeenistä väriainetta mitokondrioiden superoksidiradikaalianionille elävissä soluissa valmistajan ohjeiden mukaan. ohjeet. HKC-8-soluja viljeltiin ja transfektoitiin soluviljely- ja transfektiomenettely-osissa kuvatulla tavalla. Seuraavaksi kasvualusta korvattiin fenolipunavapaalla Hank's Balanced Salt Solutionilla (HBSS), jossa oli 10 mM Hepes. Positiivisina ja negatiivisina kontrolliolosuhteina käytettiin käsittelyä antimysiini A:lla (150 µM) ja karbonyylisyanidi-m-kloorifenyylihydratsonilla (CCCP) (50 µM) 5 minuutin ajan. Seuraavaksi solut värjättiin 5 µM MitoSOX™ Redillä 30 minuutin ajan 37 ◦ C:ssa. Solut kerättiin mitokondrioiden kalvopotentiaali-osiossa kuvatulla tavalla. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä MitoSOX™ Redin (FL2) emissioaallonpituutta 580 nm BD FacsCantoTM II -järjestelmässä (BD Bioscience, San Jos, CA) ja analysoitiin FlowJo 10.2 -ohjelmistolla (FlowJo, LLC, Ashland). TAI). Jokaisessa koetilanteessa vähintään 20,{18}} singlettiä analysoitiin kolmena rinnakkaisena.

Mitokondrioiden leimaus. Mitokondriopitoisuuden arviointi suoritettiin MitoTracker™ green FM:llä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), joka diffundoituu passiivisesti plasmakalvon läpi ja kerääntyy aktiivisiin mitokondrioihin mitokondriokalvopotentiaalista riippumatta valmistajan ohjeiden mukaisesti. HKC-8-soluja viljeltiin ja transfektoitiin soluviljely- ja transfektiomenettely-osissa kuvatulla tavalla. Seuraavaksi kasvualusta korvattiin fenolipunavapaalla Hank's Balanced Salt Solutionilla (HBSS), jossa oli 10 mM Hepes. Solut värjättiin 150 nM:lla MitoTracker™ green FM:llä 30 minuuttia 37 °C:ssa. Virtaussytometria-analyysiä varten solut kerättiin mitokondrioiden membraanipotentiaaliosassa kuvatulla tavalla. Fluoresenssin intensiteetti mitattiin käyttämällä emissioaallonpituutta 516 nm MitoTracker™ vihreällä FM:llä (FL1) BD FacsCantoTM II -järjestelmässä (BD Bioscience, San Jos, CA) ja analysoitiin FlowJo 10.2 -ohjelmistolla (FlowJo, LLC). , Ashland, OR). Jokaisessa koetilanteessa vähintään 20,{14}} singlettiä analysoitiin kolmena rinnakkaisena. Fluoresenssikuvausta varten ytimet värjättiin myös DAPI:lla (Sigma, St. Louis, MO) 5 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Elävät solut visualisoitiin käänteisellä Zeiss LSM 710 konfokaalimikroskoopilla, jossa havaittiin Cell, 63X/1.2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 objektiivi ja analysoitiin Zeiss Zen2010B sp1 -ohjelmistolla (Zeiss, Oberkochen, Saksa). .

Mitokondrioiden kopioluvun määritys. Genominen DNA uutettiin HKC-8-soluista käyttämällä DNeasy Blood & Tissue Kit -sarjaa (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mitokondrioiden runsaus määritettiin Human Mitochondrial DNA Copy Number Assay Kitillä (Detroit R&D, Detroit, MI). Suhteellinen mtDNA-kopioluku esitettiin mtDNA:n ja nukleaarisen DNA:n välisenä suhteena.

Ihmisen CKD-potilasnäytteet. 100 CKD-potilaan kohortti (vaiheet 3–4) Hospital Principe de Asturiasista valittiin miRNA-plasmatasojen analysointiin. Se sisälsi kaksi eri alaryhmää, jotka luokiteltiin niiden munuaistoiminnan kehityksen mukaan GFR MDRD-indikaattorin [29] perusteella 24 kuukauden aikana: 50 potilaalla oli alle 10 prosenttiamunuainentoiminnan heikkeneminen, kun taas muiden heistä munuaisten toiminta oli heikentynyt vähintään 40 prosenttia tai he olivat aloittaneetmunuaistenkorvaushoito (dialyysi). Määritimme myös fibroosin asteenmunuainenbiopsiat eri kohortista, jossa oli 26 potilasta, joilla oli siirteen toimintahäiriömunuainenelinsiirto Ramn y Cajalin sairaalasta. Kaikki biopsiat arvioitiin Banff 2007 -kriteerien mukaisesti [30].

Tilastollinen analyysi. Tiedot analysoitiin käyttämällä ei-parametrisia testejä, paitsi milloin mainittu. Kahden itsenäisen ryhmän välistä eroa tutkittiin Mann-Whitney-testillä, kun taas enemmän kuin kahta ryhmää verrattiin Kruskall-Wallis-testillä. P-arvoa 0.05 tai vähemmän pidettiin tilastollisesti merkitsevänä (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" tiedot="" analysoitiin="" käyttämällä="" graphpad="" prism="" 6.0:aa="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" tiedot="" ilmoitetaan="" keskiarvona="" ±="" keskiarvon="" standardivirhe="">

3. Tulokset

miRNA-ekspressiotiedot UUO-indusoidussa fibroottissamunuaiset. Selvittää miRNA:iden osuus aineenvaihdunnan säätelyssämunuaistenfibrogeneesissä, 7 päivän UUO-malli suoritettiin WT-hiirillä. RNA eristettiin kontrollista ja fibroottisestamunuainennäytteet ja miRNA-ekspressioprofiili analysoitiin mukautetussa mikroRNA-järjestelmässä. MiRNA:iden valinta perustui niiden mahdolliseen kohdistukseen mitokondrioiden aineenvaihduntaan, redox-prosesseihin ja vuorokausirytmiin osallistuviin avainentsyymeihin "in silico" -analyysin jälkeen (lisätietoja osiossa Menetelmät). Lämpökartta paljasti selvästi erottuvat ilmentymismallit joissakin miRNA:issa verrattaessa fibroottista ja kontrolliamunuainennäytteitä (kuvio 1A). Tulivuoren tonttianalyysi osoitti, että 73 175 miRNA:sta ilmeni eri tavalla, 17 ylös- ja 56 alaspäin säädeltyä fibroottisissa munuaisnäytteissä verrattuna kontrollinäytteisiin (kuva 1 B, täydentävä taulukko 1). Niistä valittiin spesifisiä miRNA:ita, jotka voisivat säädellä fibroottista lopputulosta munuaisissa metabolisten reittien kautta. Tätä tarkoitusta varten aineenvaihdunta- ja mitokondriotoimintoihin osallistuvien spesifisten geenien, CPT1A, TFAM, PGC1A, 3'UTR:n (kääntämätön alue) in silico -analyysi suoritettiin kolmella riippumattomalla ennustetyökalulla (Targetscan, miRWalk ja miRanda). Valintakriteereinä olivat myös munuaisekspression taso, kohteiden uutuus, aineenvaihduntareitin tuntemus ja biologinen merkitys. Yhteys ihmisen patologiaan, munuaiskudoksen ilmentymistasoon, niiden rooliin mitokondrioiden aineenvaihdunnassa ja niiden mahdollinen kohdistus rasvahappoja kuljettavaan entsyymiin CPT1A kannusti meitä keskittymään kolmeen miRNA:han, miR-150-5p, miR-495-3p ja miR-33-5p ehdokkaina, jotka pystyvät säätelemään munuaisten fibrogeneesiin liittyviä metabolisia muutoksia (kuva 1C). Huomaa, että CPT1A 3′-UTR sisältää yhden siemenpaikan miR-150:lle ja kaksi siemenpaikkaa miR-495:lle. Havaitsimme, että miR-150 ja miR-495 vähensivät CPT1A 3'-UTR:n sisältävän lusifase-reportterimäärityksen aktiivisuutta noin 15 prosentilla ja 25 prosentilla vastaavasti. Tämä alasäätely kumottiin kokonaan CPT1A:n 3'-UTR:n pistemutaatioiden (PM) tapauksessa miR-150-sitoutumiskohdan (PM2) osalta ja puuttui osittain molemmista miR-495-sitoutumiskohdista (PM1). ja PM3) (lisäkuvat 1A ja B). Nämä tiedot osoittavat CPT1A:n suoran vuorovaikutuksen miR-150:n ja miR-495:n kanssa. MiR-33-5p on ollut erillisen tutkimuksen kohteena [15]. MiR-150-5p- ja miR-495-3p-arvot lisääntyivät fibroottisissa munuaisnäytteissä verrokkinäytteisiin verrattuna 3,69-kertaisella muutoksella (P-arvo: 0.012 ) ja 1,95 (P-arvo: 0,012).

MiR-150 ja miR-495 tehostavat TGF-profibroottista vastetta ihmisellämunuaistentubulaariset epiteelisolut. Kvantitatiivinen käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) suoritettiin miR-150-5p- ja miR-495-3p-ekspression muutoksen vahvistamiseksi, joka oli tunnistettu miRNA-ekspressioprofiloinnilla UUO:ssa.munuainennäytteet (kuvat 2A ja B). Lisäksi miR-150-5p:n ja miR- 495-3p:n ilmentymisen kinetiikka munuaisissa 3, 5, 7, 10 ja 15 päivää UUO-toimenpiteen jälkeen analysoitiin qRT-PCR:llä. Näiden miRNA:iden ilmentyminen parani merkittävästi 2--kertaiseksi 5 päivää UUO:n jälkeen ja pysyi kohonneena 15 päivää UUO:n jälkeen (kuvat 2C ja D). Näiden miRNA:iden ilmentymistaso arvioitiin myös foolihapponefropatian (FAN) mallissa. Löysimme miR-495-3p:n 4- ja 2-kertaisen nousun miR-495-3p:ssä fibroottisessa sairaudessa.munuainennäytteitä FAN-mallista (kuva 2E). TGF- 1, yksi fibrogeneesin pääsäätelijöistä, indusoi myös miR-150- ja miR-495-ilmentymistä HKC-8-soluissa yli 2--kertaisesti ja {{ 6}}-kertainen, vastaavasti, 48 tunnin jälkeen, mikä tukee näiden miRNA:iden mahdollista roolia TGF-signalointiin liittyvissä tapahtumissa (kuvio 3A ja B). Sen arvioimiseksi, osallistuivatko miR-150 ja miR-495 putkimaisten epiteelisolujen profibroottiseen transformaatioon TGF- 1:n vaikutuksesta, ihmisen solulinja HKC-8 transfektoitiin miR:llä. -150-5p tai miR-495-3p ja hoidettu TGF- 1:lla eri aikoina. Nousevat miR-150-5p- ja miR-495-3p-tasot paransivat merkittävästi fibroosiin liittyvien markkerien Acta2, Col1 1 ja Fn1 TGF- 1--indusoitua mRNA-tasoa ( Kuvat 3C ja D). Samoin miR-150-5p:n tai miR-495-3p:n yli-ilmentyminen vähensi voimakkaasti CPT1A:ta ja lisäsi -SMA-proteiinin runsautta (kuvat 3E ja F). Nämä tiedot viittaavat siihen, että nämä miRNA:t voivat osallistua patogeneesiinmunuaistenfibroosia edistämällä TGF{0}}-riippuvaista tubulussolujen epiteelin erilaistumista sekä vaarantamalla FAO:hon osallistuvan kriittisen entsyymin ilmentymisen.

MiR-150 ja miR-495 indusoivat mitokondrioiden bioenergeettisiä muutoksia ja vähentävät mitokondrioiden ratkaisevaan toimintaan osallistuvien geenien ilmentymistä. Saadaksemme käsityksen miR-150-5p:n tai miR-495-3p:n antamisen aiheuttamista metabolisista seurauksista tutkimme ihmisen bioenergeettistä profiilia.munuaistentubulaariset epiteelisolut.

Kuva 1. miRNA-ilmentymistiedot UUO-indusoidussa fibroosissa. (A) Lämpökartta, joka osoittaa kontralateraalisen ja tukkeutuneen suhteellisen miRNA-ilmentymisenmunuaisetC57/BL6-J-hiiristä, joille tehtiin UUO-menettely 7 päivän ajan (n=6). Asteikkopalkki vaihtelee vihreästä punaiseen (korkeasta matalaan ilmaisuun) ja numerot edustavat ΔCt-arvoja. Vasemmalla puolella on merkitty tutkimukseen valitut miRNA:t. (B) UUO-moduloitujen miRNA:iden tulivuorikaavioanalyysi. Log10 suhteellinen kvantifiointi (RQ) ja negatiivinen ( − ) log10 korjattu (adj.) P-arvot piirretään x- ja y-akselille, vastaavasti. Jokaista miRNA:ta edustaa piste. 73 175 miRNA:sta osoitti muuttuneen ilmentymisen fibroottisissa näytteissä (adj. P-arvo suurempi tai yhtä suuri kuin 0,05). Valitut miRNA:t lisäanalyysiä varten on korostettu. (C) miR-150-5p ja miR-495-3p valittiin niiden tehon perusteella geenien CPT1A, TFAM ja PGC1A in silico -kohdistukseen. Kullekin valitulle mikroRNA:lle on osoitettu konservoituneet siemenkohdekohdat näiden geenien 3'UTR:ssä, niiden laskosmuutos ja merkitys (adj. P-arvo).

Kuva 2. MiR-150-5p:n ja miR-495-5p:n ilmaisutasotmunuaisetUUO- ja FAN-malleista. (A, B) qRT-PCR-analyysi miR-150-5p(A)- ja miR-495- 3p(B)-ekspressiostamunuaisethiiristä 7 päivää UUO:n jälkeen näytteissä, jotka on analysoitu aiemmin mikroRNA-sarjalla. (C–E) qRT-PCR-analyysi miR-150-5p- ja miR-495-3p-ekspressiosta FAN-mallin jälkeen (C) ja 3, 5, 7, 10 ja 15 päivää sen jälkeen UUO: miR-150-5p (D) ja miR{{10}}p (E). Pylväsdiagrammit edustavat kerta-muutoksen ilmentymistasojen keskiarvoa ± sem 6 (A, B, E) ja 3 (C ja D) hiirestä ryhmää kohti. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" verrattuna="" vastaaviin="" kontrolli-olosuhteisiin;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" verrattuna="">munuaisethiiristä, joilla on sama kokeellinen käsittely.

TGF- 1 käytettiin mallisytokiinina, joka osallistui profibroottisiin liittyviin muutoksiin. Näiden solujen bioenergeettisen tilan määrittämiseksi mitattiin FAO:hon liittyvä hapenkulutusnopeus (OCR) ja HKC-8-solujen solunulkoinen happamoitumisnopeus (ECAR) peräkkäisen käsittelyn aikana yhdisteillä, jotka moduloivat mitokondrioiden toimintaa palmitaatin läsnä ollessa. , käyttämällä Seahorse XF24 Extracellular Flux Analyzer -laitetta (lisätietoja Menetelmät-osiossa). 48 tunnin kuluttua TGF- 1:n kanssa HKC-8-solut miR-150-5p:n läsnä ollessa osoittivat johdonmukaista laskua perus-, OCR-arvossa, joka oli yhdistetty ATP:n muodostukseen, ATP-sidoksessa hengitykseen ja maksimaaliseen hengitykseen. liittyy FCCP-herkkään OCR:ään (kuva 4A). OXPHOS:n heikkeneminen heijastui ATP-sisällön vähenemisenä miR-150-5p:tä yli-ilmentävissä HKC-8-soluissa (kuva 4C). Emme havainneet, että nämä miRNA:t aiheuttivat vaihteluita ECAR:ssa (tietoja ei näytetä). Tämän mukaisesti heidän mitokondrioidensa mRNA-ekspressiotasot.

sukua olevat kohdegeenit CPT1A, PGC1 ja mitokondriaalinen transkriptiotekijä A (TFAM) vähenivät puoleen miR-150-mimimeillä käsitellyissä soluissa verrattuna miRNA-matkija NC-käsiteltyihin soluihin (kuvio 4E). Tutkimukset, joissa käytettiin samaa kokeellista lähestymistapaa miR-495-3p:n kanssa, tuottivat samanlaisia ​​tuloksia (kuvat 4B, D, F). Kuitenkaan miRNA-150 ja miRNA- 495 eivät merkittävästi moduloineet mitokondrioiden massaa, joka määritettiin mtDNA-kopiomäärällä ja mitokondrioiden värjäyksellä MitoTrackerTM green FM:llä, sekä perusolosuhteissa että TGF-käsittelyssä. Tämän parametrin laskeva suuntaus havaittiin pohjimmiltaan (lisäkuvat 2A, B, C). Kaiken kaikkiaan nämä tiedot tukevat sitä, että miR{11}} ja miR-495 edistävät a

Profibroottinen vaikutus putkimaisissa epiteelisoluissa mitokondrioiden toiminnan heikkenemisen kautta.

MiR-150 ja miR-495 eivät muuta mitokondrioiden transmembraanipotentiaalia (ΔѰm) ja mitokondrioiden superoksidiradikaalia

Kuva 3. MiR-150 ja miR-495 tehostavat TGF- 1--riippuvaista pro-fibroottista vastetta ihmisellämunuaistentubulaariset epiteelisolut. (A, B) RT-PCR-analyysi miR{{0}}p(A)- ja miR-495-3p(B)-ekspressiosta HKC-8-soluissa, jotka on käsitelty 1{{24:lla }} ng/ml TGF- 1 ilmoitettuina aikoina. (C, D) alfa-sileän lihasaktiinin (-SMA), alfa 1 -tyypin-1 kollageenin (Col1 1), fibronektiinin (FN) mRNA-tasot miR-NC:llä transfektoiduista soluista ja jäljittelevät miR:ää -150-5p (C) tai miR-495-3p (D) määritettiin qRT-PCR:llä käyttämällä Sybr greeniä. Soluja käsiteltiin TGF- 1:lla (10 ng/ml) miRNA:n yli-ilmentymisen jälkeen, kun se on osoitettu (katso myös menetelmäosa). (E, F) Immunoblottit, jotka kuvaavat CPT1A- ja -SMA-tason proteiinitasoja miR-NC:llä transfektoiduissa soluissa ja jäljittelevät miR-150-5p (E) tai miR{{20}}p (F) ilmoitetut aikapisteet. GAPDH:ta käytettiin normalisointitarkoituksiin. Pylväsdiagrammit (oikeat paneelit) edustavat kertamuutoksen ilmaisun keskiarvoa ± sem 3 riippumattomasta kokeesta. *P < {{30}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" verrattuna="" vastaaviin="" kontrolliolosuhteisiin;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" verrattuna="" soluihin,="" jotka="" on="" käsitelty="" mir-nc:llä="" samoilla="">

Kuva 4. MiR-150 ja miR-495 tehostavat TGF-1-indusoitua FAO-repressiota HKC-8-soluissa. (A, B) HKC-8-solujen hapenkulutusnopeus (OCR), jotka on transfektoitu

40 nM miR-NC ja mimic miR-150-5p (A) tai miR-495-3p (B) ja altistettiin 10 ng/ml TGF{{5} } miRNA:n yli-ilmentymisen jälkeen (katso myös menetelmäosa). Pylväsdiagrammit (oikeanpuoleiset paneelit) osoittavat perus-, protonivuoto-, ATP-sidottu-, maksimi- ja varakapasiteetin sekä ei-mitokondrioiden hengitystiloihin liittyvät OCR-nopeudet. Tiedot esitetään normalisoinnin jälkeen proteiinimäärällä. (C, E) ATP-tasot HKC-8-soluissa, jotka on transfektoitu miR-NC:llä ja jäljittelevät miR-150-5p (C) tai miR-495-3p (E). (D, F) CPT1A:n, PGC1A:n ja TFAM:n mRNA-tasot miR-NC:llä transfektoiduissa HKC-8-soluissa ja mimikaalilla miR-150-5p (D) tai miR-495-3p (F) olivat määritetty qRT-PCR:llä käyttäen Sybr greeniä. Pylväsdiagrammit osoittavat 4 riippumattoman kokeen keskiarvon ± sem. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" verrattuna="" vastaaviin="" kontrolliolosuhteisiin;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" verrattuna="" soluihin,="" jotka="" on="" käsitelty="" mir-nc:llä="" samoilla="">

anionien tuotanto. Protonipumppujen (kompleksit I, III ja IV) tuottama mitokondrioiden kalvopotentiaali (ΔΨm) on olennainen komponentti energian varastoinnissa oksidatiivisen fosforylaation aikana. Lisääntynyt ΔѰm voi johtaa mitokondrioiden redox-häiriöihin, kun taas sen väheneminen vähentää ATP:n tuotantoa, mikä vaarantaa solujen elinkelpoisuuden [254]. Superoksidiradikaalianioni (O2•− ) on vapaa radikaali, joka voi syntyä mitokondrioissa elektronivuodon seurauksena, joka voi tapahtua useiden ETC-vaiheiden sisällä. O2•−:n muodostuminen mitokondriomatriisissa riippuu myös kriittisesti NADH/NAD plus- ja CoQH2/CoQ-suhteista ja paikallisesta O2-pitoisuudesta [255]. Sen ylituotanto voi johtaa mitokondrioiden redox-homeostaasin menettämiseen eri mekanismien kautta, mikä on tila, joka on liittynyt moniin patologisiin tiloihin, mukaan lukien AKI ja CKD [201]. ΔѰm tutkittiin TMRM-väriaineella ja superoksidiradikaalianionin tuotanto MitoSOX-väriaineella. Ensin validoimme nämä määritykset käsittelemällä soluja FCCP:llä ja CCCP:llä negatiivisina kontrolleina TMRM:lle ja MitoSOX:lle sekä oligomysiini ja antimysiini A positiivisina kontrolleina TMRM:lle ja MitoSOX:lle, vastaavasti, ihmissolulinjassa HKC{{7} }. TMRM-määrityksen tapauksessa oligomysiinikäsittely aiheutti 3--kertaisen kasvun TMRM:n fluoresenssin keskiarvossa verrattuna kontrolliväriin, kun taas FCCP-käsittely johti 9--kertaiseen laskuun. Antimysiini A ja CCCP tuottivat 35-kertaisen kasvun ja vastaavasti 2--kertaisen laskun MitoSOX-määrityksessä (lisäkuvat 3A ja B). Sen määrittämiseksi, aiheuttivatko miR-150- ja miR-495-vaikutukset mitokondrioiden aineenvaihduntaan muutoksia näissä parametreissa, HKC-8-solut transfektoitiin miR-150-5p:llä tai miR{{17}:lla. }p mimic tai vastaava miR-NC. Mitään tilastollisesti merkitseviä eroja TMRM- tai MitoSOX-koettimien fluoresenssikvantifioinnissa ei löydetty valituilla miR:illä ja miR-NC:llä (lisäkuva 3C).

MiR-150- ja miR-495-tasot eivät vaikuta CKD-potilaiden plasma- ja munuaisnäytteissä. Arvioimme valittujen miRNA:iden ilmentymisen CKD-potilaiden plasma- ja munuaisbiopsioista. 26 potilaan munuaisbiopsioiden analyysi (sairaala Ramn y Cajal) ei osoittanut korrelaatiota fibroosin asteen ja vastaavasti miR-150-5p- ja miR-495-3p-tasojen välillä (lisäkuvat 4A ja B) . Verenkierrossa olevat miR-150-5p:n, miRNA:n, jolla on suurin munuaisekspressio näistä kahdesta, tasot määritettiin myös 100 CKD-potilaan kohortissa (Hospital Príncipe de Asturias). Näytteiden saatavuuden rajoitusten vuoksi emme pystyneet määrittämään miR- 495-3p:n seerumiarvoja tässä kohortissa. Nämä potilaat jaettiin aiemmin kahteen alaryhmään niiden munuaisten toiminnan kehityksen perusteella 24 kuukauden aikana siten, että 50 potilaalla munuaistoiminnan heikkeneminen oli alle 10 prosenttia, kun taas muilla heistä munuaisten toiminta oli heikentynyt vähintään 40 prosenttia. toiminto. Plasman miR-150-5p-tasojen qRT-PCR-kvantifiointi ei osoittanut selkeää suuntausta kohti erilaista ilmentymistä kahdessa potilasalaryhmässä (täydentävä kuva 4C).

4. Keskustelu

MiRNA:iden löytäminen patofysiologisten prosessien keskeisiksi säätelijöiksi on edistänyt niiden käyttöä terapeuttisina aineina lähes kaikissa kliinisissä olosuhteissa, mukaan lukien munuaissairaudet [31]. Munuaisfibroosi on kroonisen munuaissairauden (CKD) erittäin yleinen seuraus, jonka etiologia on riippumaton, ja sen esiintyminen on selvä evoluution ennustaja. Tästä syystä munuaisfibroosiin liittyvien miRNA:iden tunnistamiseen on omistettu merkittävää työtä [32,33]. Tässä tutkimuksessa keskityimme aineenvaihduntahäiriön yhä tärkeämpään rooliinmunuaistenvahingoittaaja tunnistimme kaksi miRNA:ta, miR-150 ja miR-495, jotka olivat aiemmin tuntemattomia näyttelijöitä kohtauksessa. Lisäksi havaitsimme, että niillä on syvällinen vaikutus solujen bioenergetiikkaan synergisoitumalla TGF:n kanssa ja muokkaamalla tärkeimpiä rasva-aineenvaihduntareittejä.happoa hapettumista.

Epiteelin vaurio esiintyy samanaikaisesti rasvavaurion kanssahappoahapettumista, putkimaisten epiteelisolujen tärkein energialähde [5]. Se johtaa niiden erilaistumiseen, mikä aiheuttaa tubulustoiminnan heikkenemistä, laukaisee solusyklin pysähtymisen ja edistää kriittisten pro-fibroottisten sytokiinien vapautumista, jotka voivat osaltaan aktivoida interstitiaalisia myofibroblasteja [5,34]. MiR-150- ja miR-495-ekspressio lisääntyi hiiressäfibroottinenmunuaisetja sisäänihmisen munuainenepiteelisoluja (HKC-8) TGF-hoidon jälkeen, mikä viittaa niiden osallisuuteen pro-fibroottisessa vasteessa. Mielenkiintoista on se, että miR-150:a ja miR-495:a koodaavien genomialueiden in silico -analyysi mahdollistaa sitoutumiskohtien tunnistamisen TGF-signalointiin liittyville transkriptiotekijöille ja muille UUO-vaurioihin liittyville reiteille (hakuja genecards.org for miR-150 ja miR-495). Sekä miR-150 että miR-495 vähensivät kohdegeeniensä CPT1A, PGC1 ja TFAM ilmentymistasoa, mikä heijastui vähentyneenä perus-, ATP-kytkeytyneenä ja maksimaalisena OCR- ja ATP-pitoisuutena hoidon jälkeen. miR-150 ja miR-495. Tähän vaikutukseen liittyi parantunut TGF-profibroottinen vaste HKC-8-soluissa. Huomasimme, että TGF-vähensi mitokondrioiden massaa ja mitokondrioiden DNA:ta. MiRNA-150- ja miRNA-495-käsittelyn jälkeen mitokondriopitoisuuden havaittiin laskevan perusolosuhteissa, vaikka se ei saavuttanutkaan merkitystä. Tämä viittaa mekanismiin, joka on riippumaton PGC1:n tai TFAM:n roolista ja liittyy mitä todennäköisimmin metaboliseen vaikutukseen, joka liittyy CPT1A:n alasäätelyyn pääasiallisena muuttujana, johon miRNA:iden läsnäolo vaikuttaa. Muutokset mitokondrioiden bioenergetiikassa ovat kriittisiä munuaissairaudessa [35]. Tästä huolimatta olemme äskettäin osoittaneet, että CPT1A on kriittinen entsyymi terveen tubulusosaston säilyttämiseksi, koska sen yli-ilmentyminen suojaa munuaisfibroosilta [6]. Kuitenkin PGC1

ja TFAM-geenit liittyvät myös läheisesti mitokondrioiden toimintaan ja biogeneesiin [36]. Näiden geenien heikentynyt ilmentyminen liittyy CKD:hen, kun taas sen säilyminen edistää munuaisten eheyttä, kuten useista vauriomalleista ilmenee. Siten Han et ai. havaitsi, että PGC1:n tubulaarinen toiminnan vahvistuminen suojasi hiiriä Notch-indusoidulta munuaisfibroosilta ja käänsi tähän malliin liittyvän mitokondrioiden toimintahäiriön [37]. Samoin Tfamin uudelleenilmentyminen tubulussoluissa esti Notch-indusoidun metabolisen ja profibroottisen uudelleenohjelmoinnin [38]. Siten on ajateltavissa, että näiden mitokondriogeenien vähentynyt mRNA-ilmentyminen, jonka miR-150 ja miR-495 indusoivat, vaikuttaa myös epiteelin fenotyypin vaurioitumiseen.

Epiteelisoluvaurioon liittyvän OCR:n havaitsema väheneminen on aiempien raporttien mukainen, mukaan lukien tutkimuksemme miR-33 ja miR-9 [15,16]. Kun taas Kang et ai. raportoivat myös, että glukoosin hapettumisaste oli pienempi munuaisfibroosin ihmis- ja hiirimalleissa [5], tietomme osoittavat, että mikroRNA-välitteinen OCR:n lasku ei sinänsä aiheuta vaihteluita ECAR:ssa, mikä viittaa siihen, että glykolyyttinen sammutus fibroottisissa olosuhteissa todennäköisesti riippuu fibroottisiin ärsykkeisiin pikemminkin kuin heikentyneeseen oksidatiiviseen fosforylaatioon. Useita miRNA:ita on tunnistettu mitokondrioiden toiminnan tärkeimmiksi modifioijiksi, mukaan lukien arkkityyppinen profibroottinen miRNA, miR-21 [39]. PPAR-ekspression suppressio miR-21:lla on vedottu mekanismiksi, jolla tämä miRNA käyttää fibroottista toimintaansa. FAO:n estämisen lisäksi miR{12}}:n kohdegeenit osoittivat, että tämä miRNA vaimentaa monia mitokondrioprosesseja. Muita esimerkkejä ovat mir-9 [16], miR-33 [15] ja miR-30e [40,41]. Tietojemme mukaan on kuitenkin vain vähän raportteja, jotka käsittelevät CPT1A-, PGC1- ja TFAM-geenien mikroRNA-säätelyä munuaisfibroosin yhteydessä. Mielenkiintoista on, että mikroRNA-214, joka edistää epiteelistä mesenkymaaliseen siirtymistä (EMT) munuaisfibroosin aikana, kohdistuu suoraan TFAM:iin paksusuolen syöpäsoluissa [42]. Tämä tukahduttaminen raportoitiin myös miR-590-3p:lle [43]. MiR-29-perhe, yksi parhaiten luonnehdituista ECM-tuotannon säätelijöistä elinfibroosissa, kohdistuu suoraan PGC1:een ja säilyttää sydämen homeostaasin. Täten miR-29:n patologinen hiljentyminen johtaa PGC1:n lisääntymiseen, mikä synnyttää mitokondrioiden biogeneesiin perusteellisia muutoksia, jotka vaikuttavat sydänsairauksiin [44]. Vaikka tietomme tukevat selvästi miR-150:n ja miR-495:n roolia munuaisfibroosissa, lisäin vivo -tutkimuksia tarvitaan tämän väitteen vahvistamiseksi.

Mitokondrioiden elektronien kuljetusketjun (ETC) eheyden arvioimiseksi keskityimme kahteen ominaisuuteen: ΔѰm ja superoksidiradikaalianionien tuotanto. Havaitsimme, että miR-150 ja miR-495 eivät muuttaneet näitä parametreja. Stabiili ΔѰm on vaatinut solujen elinkelpoisuuden ja sen suuruus vaihtelee solutyypeittäin [45]. Sen ylläpito on tiukasti hienosäädetty, koska ΔѰm:n kasvu voi johtaa häiriöihin redox-tilassa, kun taas sen väheneminen aiheuttaa ATP-tuotannon vähenemisen ja voi laukaista apoptoosin. Tutkimuksessamme ΔѰm:n muutokset kvantifioitiin kationisella fluoresoivalla väriaineella TMRM, kun taas mitokondrioiden superoksidiradikaalianionin tuotanto mitattiin fluorogeenisellä väriaineella MitoSOX Red. Näiden työkalujen käyttö munuaisten toimintaan vaikuttavissa olosuhteissa ei ole kirjallisuudessa näkyvää. Siitä huolimatta, että tutkimuksessamme ei tapahtunut muutoksia, emme pyrkineet syvällisiin muihin strategioihin redoxhormeesin arvioimiseksi, ja näin ollen emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että nämä miRNA:t voivat muuttaa nukleofiilistä sävyä tai useiden komponenttien toimintaa. ETC.

Kliinisessä ympäristössä miR-150:n on ehdotettu pro-fibroottiseksi miRNA:ksi lupus nefriitissä moduloimalla TGF-signalointia [46,47], kun taas miR-495 yhdistettiin suojaavaan rooliin diabeettisessa sydämessä. fibroosi [48]. Selvittääksemme heidän mahdollisen osallistumisensa CKD:hen arvioimme heidän seerumi- ja parenkymaaliset tasot kahdessa eri potilasryhmässä. MiRNA:iden seerumitasoja on ehdotettu mahdollisiksi CKD:n etenemisen biomarkkereiksi [49,50]. Siten seerumin verenkierrossa olevat miR-21-tasot ja miR-29c:n runsaus virtsan eksosomeissa korreloivat munuaisfibroosin kanssa, mikä viittaa niiden mahdolliseen rooliin biomarkkereina [51, 52]. MiR-150- ja miR-495-tasot eivät kuitenkaan eronneet CKD-potilaiden plasma- tai munuaisnäytteistä. Lajien ja solutyyppien erilaiset mikroRNA-ilmentymismallit voivat selittää tämän eron puuttumisen fibroottisen kudoksen miR-150- ja miR-495-tasoissa [53]. Vaikka joissakin tapauksissa raportoidut plasman mikroRNA-tasot saattavat heijastaa munuaiskudoksessa olevia tasoja, tulee myös harkita muita mekanismeja, jotka liittyvät miRNA:iden erittymiseen verenkiertoelimistöön tai tämän erityksen vastapainoon muiden elinten toimesta [13,54].

Kaiken kaikkiaan tulokset tukevat sitä, että miR{0}} ja miR-495 edistävätmunuaistenepiteelisoluerilaistuminen todennäköisimmin energian puutteen kautta, jota välittää CPT1A-, PGC1- ja TFAM-mitokondrioiden toimintaan liittyvien geenien tukahduttaminen. Ne tarjoavat myös perustan jatkaa rooliaan in vivo sekä niiden mahdollista käyttökelpoisuutta diagnostisina tai prognostisina biomarkkereina.

Tekijän panokset

SL suunnitteli ja ohjasi tutkimusta. VM suunnitteli, suoritti ja analysoi suurimman osan kokeista. RR auttoi mikroRNA-järjestelmän analyysissä. DRP ja LGB suorittivat tutkimuksia kahdella eri CKD-potilaiden ryhmällä. Kaikki kirjoittajat auttoivat keskustelussa tuloksista ja SL ja VM kirjoittivat käsikirjoituksen.

Ilmoitus kilpailevasta intressistä

Tekijöillä ei ole eturistiriitoja.

Kiitokset

Tätä työtä tuki Espanjan tiedeministeriön SAF2015-66107-R ja PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/01513 (DRP) apurahoilla, joita Euroopan yhteisrahoitti. Aluekehitysrahasto, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 ja RD16/ 0009/0016 (SL ja DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751, (SL) Espanjan nefrologiayhdistyksen (Fundacin Senefro 2017) apuraha SL:lle ja FundacionilleMunuaiset"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) kaikki Espanjasta. CBMSO saa institutionaalista tukea Fundacion "Ramn Arecesista". VM:ää tuki Espanjan tiedeministeriön FPI-ohjelman (BES{0}}) esitohtorintutkinto.