PEDV-rekombinantti Lactobacillus Casei -rokotteen rakentaminen ja sen immuunivasteet hiirissä

Abstrakti

Tausta: Porcine epidemic diarrhea (PED) on tarttuva suolistosairaus, jonka aiheuttaa sian epidemia ripulivirus (PEDV), jolle on ominaista oksentelu, ripuli, ruokahaluttomuus ja nestehukka, jotka ovat aiheuttaneet valtavia taloudellisia tappioita ympäri maailmaa. Tällä hetkellä rokoteimmuniteetti on edelleen tehokkain tapa hillitä PED:n leviämistä. Tässä tutkimuksessa olemme rakentaneet uuden rekombinantin L. casei-OMP16-PEDVS-kannan, joka ilmentää PEDV:n PEDVS-proteiinia ja Brucella abortus -kannan OMP16-proteiinia. Yhdistelmä-L. casei-OMP16-PEDVS-ehdokasrokotteen immunogeenisyyden selvittämiseksi sitä verrattiin rokotteisiin BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS ja BL21-PEDVS-yhdistelmäproteiini.

Tulokset: Tulokset osoittivat, että pystyimme havaitsemaan korkeammat IgG-tasot, neutraloivan vasta-aineen, IL-4, IL-10 ja INF- seerumissa ja IgA L. casei-OMP16- ulosteissa. PEDVS-immunisoidut hiiret, jotka osoittivat, että L. casei-OMP16-PEDVS-ehdokasrokote voisi indusoida korkeampia humoraalisen immuniteetin, soluimmuniteetin ja limakalvon immuniteetin tasoja.

Johtopäätös: Siksi L. casei-OMP16-PEDVS on lupaava ehdokasrokote PEDV-infektion ennaltaehkäisyyn.

Avainsanat: PEDV, Lactobacillus casei -rokote, PEDV S -proteiini, OMP16, immuunivasteet

cistanche-edut miehille - vahvistavat immuunijärjestelmää

Johdanto

Sikojen epidemian ripulin (PED) aiheuttaa sian epidemia ripulivirus (PEDV), jonka oireita ovat ripuli, oksentelu, ruokahaluttomuus, nestehukka ja porsaiden painonpudotus [1, 2]. Kaiken ikäiset siat voivat saada tartunnan erilaisilla oireilla ja porsaiden kuolleisuus on jopa 100 % [3], mikä on johtanut valtaviin taloudellisiin menetyksiin kaikkialla maailmassa. PEDV:n leviämisen hillitsemiseksi rakennetaan useimpia rokotteita, kuten alumiinihydroksidiadjuvanttia sisältävä inaktivoitu rokote, bivalenttinen inaktiivinen transmissible gastroenteritis virus (TGEV) ja PEDV-rokote sekä heikennetty PEDV-rokote [4]. Vaikka näillä rokotteilla on tärkeä rooli PED:n hallinnassa, niillä kaikilla on omat puutteensa. Inaktivoidut rokotteet eivät voi aktivoida solujen immuunivasteita, heikennetty rokote ei ole kovin turvallinen, eivätkä ne voi indusoida riittävästi limakalvojen immuunivasteiden virusspesifisten IgA-vasta-aineiden tuotantoa. Siksi on välttämätöntä ja kiireellistä kehittää uusi rokote PED:n torjuntaan.

Lactobacillus casei -bakteeria pidetään usein eräänlaisena turvallisena vektorijärjestelmänä antigeenien kohdennetulle kuljetukselle oraalisessa immunisaatiossa, millä on myönteisiä vaikutuksia ihmisten ja eläinten terveyteen [5]. Samaan aikaan sitä voidaan käyttää kuljetusjärjestelmänä säätelemään T-auttajasoluvastetta ja stimuloimaan spesifisten IgA:iden eritystä limakalvon immuniteetille [6]. Toisaalta Lactobacillus casei -yhdistelmärokote on helpompi antaa, yliherkkyysreaktion mahdollisuus on pienempi ja se on kustannustehokkaampaa verrattuna perinteisiin rokotteisiin. Raporttien perusteella Lactobacillus casei -yhdistelmärokotteita on käytetty menestyksekkäästi ihmisen papilloomaviruksen, Streptococcus-keuhkokuumeen ja Escherichia colin ehkäisyssä ja hallinnassa [7–9]. On myös joitain samanlaisia ​​​​yrityksiä suunnitella PED-rokotteita. Tutkijat havaitsivat, että rekombinantti Lactococcus lactis -kanta, joka ilmentää sian epidemian ripuliviruksen S1-geenin varianttia, voi indusoida korkeita IL-4- ja IFN-tasoja immunisoiduissa hiirissä [10]. Lactobacillus casei -pohjainen anti-PEDV-rokote, joka ekspressoi mikrokertaiseksi soluun kohdistuvaa peptidiä Co1 fuusioituna PEDV:n COE-antigeenin kanssa, voisi myös indusoida tehokkaan immuunivasteen [11]. PEDV-rokotteen tehokkuuden parantamiseksi. Tässä tutkimuksessa rakennamme uuden Lactobacillus casei -yhdistelmärokotteen PED:lle, joka voi stimuloida voimakkaampia limakalvo-, huumori- ja soluimmuunivasteita PEDV-infektiota vastaan ​​suun kautta annettaessa. PEDV, joka kuuluu coronaviridae-perheeseen, koostuu neljästä rakenneproteiinista, jotka sisältävät 150–220 kDa:n glykosyloituneen piikkiproteiinin (S), 20–30 kDa:n kalvoproteiinin (M) ja 7 kDa:n vaippaproteiinin (E), 58 kDa. nukleokapsidi (N) -proteiini [12]. Siellä S-proteiini voidaan jakaa S1- (1–735 aminohappoa) ja S2-domeeneihin (736-viimeinen aminohappo) [13], ja S1-proteiini sisältää reseptoria sitovan alueen ja tärkeimmät neutraloivat epitoopit [13]. 14]. Rokotteen adjuvantti toimii immunomodulaattorina ja voi indusoida ja tehostaa immuunivasteita samanaikaisesti toimitettuja antigeenejä vastaan. Brucella abortus -kannan OMP16-proteiinin todettiin aktivoivan dendriittisoluja in vivo, indusoivan th1-immuunivasteen, ja se oli lupaava itseadjuvanttirokote [15–17]. Siksi OMP16-proteiini lisättiin tutkimuksessamme Lacto bacillus case -yhdistelmärokotteeseen. Toistaiseksi on raportoitu vain vähän tutkimuksia PEDV:n Lactobacillus casei -rekombinanttirokotteesta. Siksi tämän tutkimuksen tavoitteena on rakentaa uusi Lactobacillus casei -ehdokas oraalinen rokote, joka voi tarjota paremman humoraalisen immuniteetin, soluimmuniteetin ja limakalvon immuniteetin PED:n leviämisen estämiseksi.

Kiinan yrtti cistanche kasvi-Antitumor

Materiaalit ja menetelmät

Bakteerikannat, virukset, viljelyolosuhteet, plasmidit ja alukkeet

Cistanche jauhe

Tässä tutkimuksessa käytetyt bakteerikannat, plasmidit ja alukkeet on lueteltu taulukossa 1. Lactobacillus casei ATCC 393:n standardivertailukantaa viljeltiin de Man Rogosa and Sharpe (MRS) -liemessä 37 asteessa [18]. BL21 (DE3) ja DH5 viljeltiin Luria-Bertani (LB) -elatusaineessa 37 asteessa [19]. Rekombinantteja Lactobacil lus casei-, BL21- (DE3) ja DH5-kantoja viljeltiin vastaavassa alustassa oikeilla antibiooteilla, vastaavasti. Brucella abortus kasvatettiin Tryptic Soy Broth (TSB)- tai Tryptic Soy Agar (TSA) -elatusaineessa (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 37 asteessa. PEDV-kannoilla infektoituja Vero-soluja viljeltiin DMEM:ssä (Gibco, Langley, VA, USA), jota oli täydennetty 10 ug/ml trypsiinillä (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. Plasmidit pVE5523 ja pET28a (+) olivat Lactobacillus casein ja Escherichia colin ekspressiovektoreita, vastaavasti.

Taulukko 1 Tässä tutkimuksessa käytettyjen bakteerikantojen, plasmidien ja alukkeiden ominaisuudet

Rekombinanttien Lactobacillus casei- ja BL21-kantojen rakentaminen

Rekombinanttiekspressioplasmidit rakennettiin taulukon 1 plasmidien ja alukkeiden perusteella. Aluksi PEDV S-geenin (493-708 aminohappoa), PEDV S'-geenin (493-708 aminohappoa) osittainen sekvenssi, ja Brucella abortus OMP16 -geenin osittainen sekvenssi (26–168 aminohappoa) monistettiin käyttämällä alukepareja PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 ja OMP16-F/R, vastaavasti. Myöhemmin OMP16- ja PEDVS-fragmenteissa käytettiin limityksen laajennusmenetelmää uuden OMP16-PEDVS-fragmentin rakentamiseen, jonka keskelle oli juuttunut linkkeripolypeptidi (GGGGSGGGGGGGGGS). Sitten PEDVS-fragmentit insertoitiin pET28a-plasmidiin EcoRI/Xbal-restriktioentsyymeillä rekombinanttiplasmidin pET28a-PEDVS muodostamiseksi, ja uudet fragmentit OMP{20}}PEDVS insertoitiin pET28a- ja pVE5523-plasmideihin EcoRI/Xbal- ja SalI/EVCORV-entsyymeillä. restriktioentsyymejä rekombinanttiplasmidin pET28a-OMP16-PEDVS ja pVE5523-OMP16-PEDVS tuottamiseksi, vastaavasti. Rekombinanttiplasmidit (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ja pVE5523-OMP16-PEDVS) transformoitiin BL21:ksi (DE3) tai Lactobacillus casei ATCC393:ksi transformoimalla tai elektroporaatiolla perustuen raportoitu paperi [21].

Proteiinin ilmentymisen analyysi Western blot -menetelmällä

BL21-pET28a-PEDVS-, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS- ja L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS-kantojen proteiiniekspressio oli havaittiin raportoidun menetelmän perusteella, jossain muutettuna [21–23]. Yhdistelmäkantoja BL21-pET28a-PEDVS ja BL21-pET28a OMP16-PEDVS viljeltiin LB-liemessä ja IPTG:tä käytettiin pET28a-PEDVS:n ja pET28a-OMP:n{22} keräämiseen. } PEDVS-proteiinit. Nollavektoria käytettiin negatiivisena kontrollina. Solujen hajoamisen ja sentrifugoinnin jälkeen supernatantti ja sedimentti kerättiin. Sitten kohdeproteiinit puhdistettiin käyttämällä nikkeliaffiniteettikromatografiakolonnia edellisen tutkimuksen perusteella [24]. Samaan aikaan rekombinantin L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-kannan viljelysupernatantti kerättiin myös sentrifugoimalla 9 000 × g 10 minuutin ajan 4 asteessa. Sen jälkeen näytteitä natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -latauspuskurilla keitettiin 10 minuuttia. Proteiinit erotettiin 12-prosenttisella natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) ja siirrettiin sitten PVDF-kalvoille (Millipore, Mississauga, ON, Kanada). Membraaneja estettiin 5 % rasvattomalla maidolla 2 tunnin ajan 37 asteessa ja inkuboitiin sitten hiiren monoklonaalisen S-proteiinin vasta-aineen kanssa yön yli 4 asteessa ja HRP-konjugoidun vuohen anti-hiiri-IgG:n kanssa (ABclonal, Wuhan, Kiina) 2 tuntia klo. 37 astetta. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä Clarity™ Western ECL Blotting Substratea (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Rokotus ja näytteenotto

Rekombinantin Lactobacillus casei -rokotteen immunogeenisyys arvioitiin käyttämällä kuuden viikon ikäisiä naaraspuolisia spesifisiä patogeenivapaita (SPF) BALB/c-hiiriä [10, 18], jotka ostettiin Shandongin maatalousyliopiston eläinkeskuksesta. Yhteensä 50 hiirtä jaettiin satunnaisesti viiteen ryhmään, joissa kussakin ryhmässä oli 10 hiirtä. Hiiret immunisoitiin rekombinantilla Lactobacillus casei -rokotteella ja puhdistetulla proteiinilla (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS + Freundin täydellinen adjuvantti). Immunisointiprotokolla suoritettiin taulukon 2 perusteella ja tehosteimmunisaatio annettiin 13 päivän kuluttua. Serologista tutkimusta varten seerumi kerättiin 0, 14 ja 28 päivää immunisoinnin jälkeen (dpi) häntälaskimolla ja säilytettiin -20 asteessa käyttöön asti. Ulosteet kerättiin 1 päivä ennen rokotusta ja jokaisella tehostekerralla. IgA-detektiota varten ulosteet laimennettiin (w/v) 0,05 M natrium-EDTA:lla suhteessa 1:4 juuri keräämisen jälkeen ja inkuboitiin 14 tuntia 4 asteessa asianmukaisen sekoittamisen jälkeen. Supernatantti kerättiin sentrifugoimalla 12,000×g ja säilytettiin -20 asteessa käyttöön asti. 28. dpi:ssä; kolme hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin ja suolisto prosessoitiin IgA:n havaitsemiseksi aiemmin kuvatun kirjoittajan mukaan [10, 18, 23].

Vasta-ainetasojen määritysanalyysi

IgG-tasot seerumeissa ja IgA-tasot ulosteissa mitattiin ELISA-menetelmillä tietyin muutoksin [18, 23]. Menetelmät olivat seuraavat: Polystyreenimikrotiitterilevyt päällystettiin yön yli 4 asteessa 100 µl:lla 10 ug/ml PEDVS-proteiinia, OMP16-PEDVS-proteiinia tai 100 µl:lla rekombinanttia L. casei-OMP16-PEDVS-kantaa. . 5-prosenttisella rasvattomalla maidolla eston jälkeen kerätyt näytteet laimennettiin sarjassa PBS:ään, lisättiin kolmena kappaleena ja inkuboitiin 37 asteessa 1 tunti. Sitten kuhunkin kuoppaan lisättiin HRP-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG- tai IgA-vasta-ainetta (Invi trogen, USA) (1:5000) ja inkuboitiin 1 tunti 37 °C:ssa. Polystyreenimikrotiitterilevyt pestiin 5 kertaa kunkin vaiheen aikana. Lopuksi jokaiseen kuoppaan lisättiin 100 µl TMB-substraattia (tetrametyylibentsidiini ja H2O2) ja 50 µl pysäytysliuosta 10 minuutin kuluttua. OD-arvot aallonpituudella 630 nm mitattiin käyttämällä multimode-levylukijaa (EnVision).

Viruksen neutralointikokeet

PEDV:n neutraloivia vasta-ainetiittereitä seerumeissa tutkittiin menetelmien mukaisesti tietyin muokkauksin [25, 26]. Lyhyesti sanottuna hiiren seerumi lämpöinaktivoitiin (56 astetta 30 minuutin ajan) ja sitten sarjalaimennettiin kaksinkertaisesti 96-kuoppaisille levyille (Corning, USA) kolmen näytteen kanssa. Sitten sama tilavuus 200 TCID50 / 50 µl PEDV-kantoja lisättiin 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 1 tunti 37 asteessa. Seos lisättiin uusille 96-kuoppaisille levyille, jotka oli päällystetty Vero-solujen yksikerroksisilla kerroksilla, ja inkuboitiin 1 tunti 37 asteessa. Sitten solut pestiin ja inkuboitiin ylläpitoalustassa 37 asteessa 5 % C02:ssa. Kahden päivän kuluttua sytopaattinen vaikutus (CPE) havaittiin käänteisellä mikroskoopilla, ja neutraali mitoituskonsentraatio määriteltiin seerumin pienimmäksi vasta-ainepitoisuudeksi.

Taulukko 2 BALB/c-hiirten immuuniprotokolla

Sytokiinien havaitseminen

Sytokiinien erittymisen havaitsemiseksi supernatantit otettiin laboratoriohiiristä (0, 14 ja 28 päivää). Erittyneiden IL-4-, IL-10- ja IFN-tasot määritettiin käyttämällä kaupallisia ELISA-pakkauksia (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) valmistajan suositusten mukaisesti. Sytokiini kvantifioitiin erilaisista standardikäyristä, jotka oli valmistettu sarjojen toimittamista standardireagensseista, ja optisen tiheyden (OD) arvo havaittiin 450 nm:ssä jokaiselta levyltä käyttämällä monimuotolevynlukijaa (EnVision) [23, 27].

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot saatiin vähintään kolmesta riippumattomasta kokeesta, ja tulokset esitettiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä kaksisuuntaisia ​​t-testejä ja yksisuuntaista analyysiä Graph Pad Prism 7:ssä.0 (GraphPad Software Inc., USA). Merkittävä ero määriteltiin ∗ p < 0.05, ja merkitsevän eron eri asteet nimettiin ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ ja p < 0,001 vastaavasti.

Tulokset

Rekombinanttien Lactobacillus casei- ja BL21-kantojen todentaminen

Konstruoitujen rekombinanttiplasmidien todentamiseksi yhdistelmäekspressioplasmidit pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS ja pVE5523-OMP16-PEDVS digestoitiin käyttämällä NcoI/XhoI-restriktioentsyymejä ja entsyymidigestiotulokset esitettiin kuviossa 1. Kohdejuovien koot elektroforetogrammeissa olivat samat kuin odotetut tulokset, ja sekvensointitulokset osoittivat, että rekombinanteissa ilmentämisplasmideissa ei ollut mutaatiota. Nämä tulokset osoittivat pET28a-PEDVS-, pET28a OMP16-PEDVS- ja pVE5523-OMP16-PEDVS-yhdistelmäplasmidien onnistuneen rakentamisen. Western blot -tulokset osoittivat, että rekombinanttiproteiinit pET28a-OMP16-PEDVS ja pET28a-PEDVS ilmentyivät BL21-pET28a OMP16-PEDVS:n ja BL21-:n supernatantissa. pET28a-PEDVS-kannat, vastaavasti. pVE5523-OMP16-PEDVS-proteiini varmistettiin myös L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS-kannan viljelysupernatantista. Kuvan 2 spesifiset juovat osoittivat, että rekombinanttiproteiinit pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS ja pET28a-PEDVS kerättiin onnistuneesti (kuvio 2).

Kuvio 1 Rekombinanttiplasmidien entsyymidigestiotulokset. V: pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmidin entsyymihajotustulokset. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: pVE5523-OMP16-PEDVS-plasmidi. B: Pet28a-OMP16-PEDVS- ja pET28a-PEDVS-plasmidin entsyymidigestiotulokset. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: pet28a-OMP16-PEDVS-plasmidi; 2: pET28a-PEDVS-plasmidi

Ehdokasrokotteilla immunisoitujen hiirten seerumin IgG-vasta-ainetasot

Luotujen rokoteehdokkaiden spesifisen immunogeenisyyden arvioimiseksi BALB/c-hiiret valittiin ja jaettiin 5 ryhmään. Sitten IgG-tasot seerumissa ja IgA-tasot ulosteissa mitattiin kaupallisilla ELISA-pakkauksilla. Tulokset paljastivat, että IgG-tasoissa ei ollut olennaisia ​​eroja rokotettujen ryhmien välillä ja lähes yhtään IgG-vasta-ainetta ei löydetty kaikista hiiristä ennen immunisointia. Kuitenkin huomattavia eroja havaittiin myöhemmin ensimmäisen rokotuksen jälkeen, ja seerumin IgG-vasta-ainetasot 28. päivänä olivat korkeammat kuin 14 päivän kohdalla. Viiden ryhmän hiiren joukossa L. casei-OMP16- PEDVS:llä ja BL21-OMP16-PEDVS-F:llä immunisoidut hiiret osoittivat samanlaista ja korkeinta immunogeenisyyttä. Siksi L. casei-OMP16- PEDVS ja BL21-OMP16-PEDVS-F voisivat tuottaa korkeimman immunogeenisyyden, ja sen jälkeen BL21-OMP16- PEDVS ja BL21-PEDVS (kuva 3).

cistanche-lisäaine hyödyttää - lisää vastustuskykyä

Napsauta tästä nähdäksesi Cistanche Enhance Immunity -tuotteet

【Kysy lisää】 Sähköposti:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

IgA-vasta-ainetasot ehdokasrokotteilla immunisoitujen hiirten ulosteissa

Muodostettujen rokoteehdokkaiden spesifisen immunogeenisyyden arvioimiseksi arvioitiin myös IgA-vasta-aineiden tasot hiirten ulosteissa. Tulokset osoittivat, että ennen immunisaatiota ei ollut olemassa erityistä anti-PEDVS-IgA-vasta-ainetta. Kuitenkin suuria määriä IgA-vasta-ainetta L. casei-OMP16-PEDVS-immunisoitujen hiirten BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} ulosteessa }PEDVS ja BL21-PEDVS ryhmiteltiin hiiret 14 päivää immunisoinnin jälkeen. 28 päivää immunisoinnin jälkeen L. casei-OMP16-PEDVS-immunisoitujen hiirten IgA-vasta-ainetasot saavuttivat korkeimman maksiminsa. Samaan aikaan IgA-vasta-ainetasot kolmessa muussa ryhmässä eivät osoittaneet selvää nousua. Siksi ehdokasrokote L. casei OMP16-PEDVS voisi stimuloida korkeampia vasta-ainetasoja immunisoiduissa hiirissä verrattuna BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ {18}}PEDVS- ja BL21- PEDVS-immunisoidut hiiret (kuva 4).

Kuvio 2 Rekombinanttiekspressioproteiinien varmistus. M: proteiinimarkkeri; 1: eritysproteiini muodostaa rekombinantin L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS-kannan; 2: puhdistettu proteiini BL21- pET28a-OMP16-PEDVS-kannasta; 3: puhdistettu proteiini BL21-pET28a-PEDVS-kannasta

Seerumin neutraloivat vasta-ainetasot immunisoiduissa hiirissä

L. casei-OMP16-PEDVS-, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS-rokotteiden suojaavan vaikutuksen arvioiminen ja BL21-PEDVS hiirillä, neutraloivien vasta-aineiden tasot mitattiin. Tulokset osoittivat, että neutraloivaa vasta-ainetta ei havaittu ennen immunisointia. Neutralisoiva vasta-aine havaittiin 14 päivänä immunisoinnin jälkeen ja se lisääntyi 14 päivänä tehosteimmunisaation jälkeen. L. casei-OMP16-PEDVS:ää saaneiden hiirten vasta-ainevaste oli voimakkaampi PEDV:tä vastaan ​​neutraloiva vaikutus kuin hiirillä, joille annettiin suun kautta BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS ja BL21-PEDVS. Siksi ehdokasrokote L. casei OMP16-PEDVS voisi stimuloida korkeimman neutraloivan vasta-ainetason, jota seuraa BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS ja BL21-PEDVS (kuva 5).

Sytokiinitasot

L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, ja BL21-PEDVS-immunisoidut hiiret, IL- 4, IL-10 ja IFN- määritettiin vastaavasti. Tulokset osoittivat, että sytokiinien IL-4, IL-10 ja IFN- tasot hiirten seerumeissa olivat kaikki hyvin alhaisia ​​eikä niillä ollut merkittävää eroa ennen immunisaatiota. Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin IL-4, IL-10 ja IFN- tuloksissa. 14 päivää immunisoinnin jälkeen IL-4-, IL-10- ja IFN-tasot L. casei-OMP16-PEDVS-immunisoiduissa hiirissä olivat korkeammat kuin BL21- OMP16-PEDVS F-, BL21-OMP16-PEDVS- ja BL21-PEDVS-immunisoidut hiiret. 14 päivää tehosteimmunisaation jälkeen L. casei-OMP16- PEDVS-immunisoiduissa hiirissä havaittiin korkeampi IL-4, IL-10 ja IFN-taso verrattuna muihin hiiriin verrattuna. kolme ryhmää. Siksi ehdokasrokote L. casei-OMP16-PEDVS voisi stimuloida korkeimmat IL-4-, IL-10- ja IFN-tasot, minkä jälkeen BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ja BL21-PEDVS (kuva 6).

Kuvio 3 Ehdokasrokotteiden IgG-vasta-ainetasot immunisoitujen hiirten seerumissa. Seerumi kerättiin päivinä 0, 14 ja 28 päivää ennen immunisaatiota tai sen jälkeen, tutkittiin kaupallisilla ELISA-pakkauksilla ja mitattiin absorbanssilla 450 nm. Pylväät edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± standardipoikkeama. * p < 0.05, ** p < 0,01 ja **** p < 0,0001 edustavat vastaavasti kasvavia merkitsevien erojen asteita, ja ns tarkoittaa, ettei eroa ole merkittävää.

Keskustelu

PEDV-muunnelmien aiheuttama laajamittainen PED-epidemia tapahtui lokakuussa 2010, mikä on johtanut valtaviin taloudellisiin tappioihin Kiinassa ja kaikkialla maailmassa [1]. Perinteiset rokotteet on kuitenkin suunniteltu perustuen klassiseen CV777-kantaan, joka ei pysty antamaan riittävää suojaa PEDV-variantille [4]. PEDV-viruksen leviämisen hillitsemiseksi ja taloudellisten menetysten vähentämiseksi suunnitellaan myös uusia rokotteita PEDV-muunnoskannoista. Tällä hetkellä Kiinan hallitus on hyväksynyt kaikki PEDV-inaktivoidut rokotteet ja PEDV-muunnoskantojen heikennetyt rokotteet, ja kaikilla on lupaavia näkymiä PED:n hallinnassa. Mutta puutteita on myös kahden tyyppisissä uusissa rokotteissa. PEDV tartuttaa sikoja ruoansulatuskanavan kautta ja sillä on suolistokudoksen tropismi. Siksi limakalvon immuniteetti on tehokkaampi kuin systeeminen immuniteetti estämään PEDV:n pääsy suoliston epiteelisoluihin, ja rokotteiden on tarjottava tehokas limakalvosuojaus suolikanavassa. Joten tässä tutkimuksessa rakennamme uudenlaisen rokotteen, joka voi stimuloida vahvempia anti-PEDV-spesifisiä IgG- ja IgA-vasta-aineita. Lactobacillus caseilla on potentiaalisia immuunivastetta moduloivia ominaisuuksia rokotteen kuljetusvälineenä, ja bioaktiivisten yhdisteiden ilmentyminen tämän bakteerin soluseinässä voi stimuloida asianmukaisia ​​immuunivasteita [28, 29]. Sitä käytetään laajalti useiden ihmisen papilloomaviruksen, Streptococcus pneumonian ja Escherichia colin heterologisten antigeenien ilmentämiseen rokotteina eläinmalleissa, jotka kaikki osoittivat erinomaista immunogeenisyyttä [7–9]. Inaktivoituun rokotteeseen ja heikennettyyn rokotteeseen verrattuna Lactobacillus casei -vektorirokote voi myös stimuloida korkeampia IgA-tasoja ja solujen immuunivastetta. Tutkimukset ovat osoittaneet, että IgA:n ensimmäinen puolustuslinja suolistossa olisi parempi kuin IgG porsaiden suojaamisessa PEDV-infektiolta [10, 30]. Siksi on lupaavaa kehittää eräänlainen Lactobacillus casei -vektorirokote PED:tä vastaan. Raporttien perusteella PEDV:n S-proteiini voidaan jakaa S1- (1–735 aminohappoa) ja S2-domeeneihin (736-viimeinen aminohappo) [13], ja S1-proteiini sisältää reseptoria sitovan alueen ja tärkeimmät neutraloivat epitoopit [14]. Ydinneutraloiva epitooppi (COE) voi indusoida vahvoja neutraloivia vasta-aineita PEDV:tä vastaan ​​[31, 32]. Yhdistettynä antigeenisyysanalyysiin S1-geenin osittainen sekvenssi (1477–2124 bp) valittiin yhdistelmäplasmidin rakentamiseksi. Valitulla pienellä fragmentilla osoitettiin olevan hyvän immuunigeenisyyden lisäksi myös Lactobacillus casein eritettyä ilmentymistä. Toisaalta Pasquevich havaitsi, että Brucella abortuksen ulkokalvoproteiini 16 pystyi aktivoimaan dendriittisoluja in vivo, indusoi th1-immuunivasteen ja oli lupaava itseadjuvantoitu rokote systeemistä ja suun kautta hankittua luomistaudista [15]. Samanlainen tutkimus, että lipidoimaton ulkokalvoproteiini omp16 Brucella spp. Lisäksi osoitettiin, että nenän adjuvantti voi aiheuttaa th1-immuunivasteen ja moduloida th2-allergista vastetta lehmänmaidon proteiineille [16]. Siksi omp16-geenin osittainen sekvenssi valittiin rakentamaan rekombinanttiplasmidi immuunitoiminnan tehostamiseksi tutkimuksessamme. Sen selvittämiseksi, voisiko uusi Lactobacillus casein suosittelema rokote aiheuttaa humoraalisia immuunivasteita, mitattiin IgG-, IgA- ja neutraloivien vasta-aineiden tasot. L. casei-OMP16- PEDVS-yhdistelmärokotteella immunisoitujen hiirten IgG-vasta-ainetasolla ei ollut merkittävää eroa BL21-OMP16-PEDVS-F rekombinanttirokotteella immunisoituihin hiiriin. IgA- ja neutraloivien vasta-aineiden tasot olivat kuitenkin korkeammat kuin BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S ja BL{{47 }}PEDVS-rekombinanttirokotteella tehdyt hiiret. Tulokset osoittivat, että L. casei-OMP16-PEDVS saattoi indusoida vahvempia humoraalisia immuunivasteita, erityisesti IgA-vasta-ainetasoja. Tutkimukset ovat osoittaneet, että IgA on ensimmäinen puolustuslinja suolessa ja se olisi parempi kuin IgG porsaiden suojaamisessa PEDV-infektiolta [30]. Tutkimus vahvisti myös tuloksen, jonka mukaan L. casei-OMP16-PEDVS-yhdistelmärokote voisi tarjota paremman immunologisen suojan PEDV:lle. Rekombinantin L. casei-OMP16-PEDVS:n aiheuttaman immuunivasteen tyypin tutkimiseksi havaittiin IL-4-, IL-10- ja IFN-tasot T:n aktiivisuuden arvioimiseksi. lymfosyytit. Raportin mukaan IFN- on tärkeä rooli solujen immuunivasteessa, joka syntyy, kun patogeenit tunkeutuvat elimistöön, IL-4 on tärkeä rooli humoraalisessa immuunivasteessa ja edistää immuunitoleranssia ja limakalvojen immuniteettia [33], IL -10 on tärkeä rooli limakalvon mikrobiinfektioiden torjunnassa ja suoliston limakalvoesteen eheyden ylläpitämisessä [34]. Sillä välin sytokiinien havaitsemistulokset osoittivat, että L. casei-OMP16-PEDVS-yhdistelmärokotteella immunisoidut hiiret voivat indusoida voimakkaamman IL-4-, IL-10- ja IFN-:n ilmentymisen, mikä tuki tuloksia, joiden mukaan L. casei-OMP16-PEDVS-yhdistelmärokote saattoi indusoida vahvemman humoraalisen immuunivasteen, IgA-vasta-ainetason ja vastaavasti sellulaarisen immuunivasteen.

Kuvio 5 Ehdokasrokotteiden neutraloivien vasta-aineiden tasot immunisoitujen hiirten seerumissa. Seerumi kerättiin päivinä 0, 14 ja 28 päivää ennen immunisaatiota tai sen jälkeen ja tutkittiin neutralointitestillä. Pylväät edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± standardipoikkeama. * p < 0.05, ** p < 0,01 ja **** p < 0,0001 edustavat vastaavasti kasvavia merkitsevien erojen asteita, ja ns tarkoittaa, että ei merkitse merkitsevää. ero

Kuvio 6 Sytokiinitasojen havaitseminen immunisoitujen hiirten seerumista. Seerumi kerättiin päivinä 0, 14 ja 28 päivää ennen immunisaatiota tai sen jälkeen ja tutkittiin kaupallisilla ELISA-pakkauksilla. Absorbanssiarvo mitattiin absorbanssilla 450 nm IL-4 (a), IL-10 (b) ja IFN- (c), vastaavasti. Pylväät edustavat kolmen riippumattoman kokeen keskiarvoa ± standardipoikkeama. * p < {{10}},05, ** p < 0,01 ja **** p < 0,0001 edustavat vastaavasti kasvavia merkittäviä eroja

Johtopäätös

Yhteenvetona: L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS ja BL{{7 }}PEDVS-ehdokasrokotteet rakennettiin tässä tutkimuksessa. Samaan aikaan näiden ehdokasrokotteiden humoraalinen immuunivaste ja solujen immuunivasteen tasot arvioitiin hiirillä. Tulokset osoittivat, että L. casei-OMP16-PEDVS:llä immunisoidut hiiret pystyivät tuottamaan korkeampia tasoja IgG:tä, IgA:ta, neutraloivaa vasta-ainetta, IL-4, IL- 10 ja INF- hiiret, jotka on immunisoitu BL21-OMP16-PEDVS-F:llä, BL21-OMP16-PEDVS:llä ja BL21-PEDVS:llä. Siksi rekombinantti L. casei OMP16-PEDVS-ehdokasrokote voi luoda pohjan turvallisen, tehokkaan ja kätevän rekombinantti-limakalvorokotteen kehittämiselle PEDV-infektion ennaltaehkäisyyn.

cistanche tubulosa - parantaa immuunijärjestelmää

Viitteet

1. Wang D, Fang L, S X. Sikojen epidemia ripuli Kiinassa. Virus Res. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et ai. Sikojen epidemian ripulin immunohistokemiallinen tutkimus. J Comp Pathol. 1995; 113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Sikojen epidemian ripulin puhkeaminen imettävillä porsailla, Kiina. Emerg Infect Dis. 2012; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Bi-yhdistetyn heikennetyn rokotteen kehittäminen tarttuvaa gastroenteriittivirusta ja sian epidemiaa ripulivirusta vastaan. Chin J Ed. Vet. Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Lactobacilluksen potentiaali kantajana oraaliseen immunisaatioon: vektorijärjestelmien kehittäminen ja alustava karakterisointi antigeenien kohdennettua kuljettamista varten. J Biotechnol. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Biotekniikka: Maitohappobakteerien immunomoduloivat vaikutukset immuunijärjestelmän toiminnan ja hyödyn parantamiseksi. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et ai. Oraalinen immunisointi Lactobacillus casei -rokotteella, joka ilmentää ihmisen papilloomavirus (HPV) tyyppi 16 E7, on tehokas strategia limakalvon sytotoksisten lymfosyyttien indusoimiseksi HPV16 E7:tä vastaan. Rokote. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM, et ai. Hiirten nenäimmunisointi Lactobacillus caseilla, joka ekspressoi Pneumococcus Surface Protein A:ta: vasta-aineiden induktio, komplementin kerrostuminen ja osittainen suojaus Streptococcus pneumoniae -altistusta vastaan. Mikrobit tarttuvat. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK et ai. Immunisointi rekombinantilla Lactobacillus casei -kannoilla, jotka tuottavat K99- ja K88-fimbriaproteiinia, suojaa hiiriä enterotoksigeeniseltä Escherichia colilta. Rokote. 2012; 30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K, et ai. Rekombinantin lactococcus lactis -kannan rakentaminen, joka ekspressoi sian epidemian ripuliviruksen S1-geenin varianttia, ja sen immunogeenisuusanalyysi hiirillä. Viral Immunol. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Suun kautta tapahtuva immunisointi Lactobacillus casei -pohjaisella sian epidemia-ripuliviruksen (PEDV) -rokotteella, joka ekspressoi mikrokerrosta soluihin kohdistuvaa peptidiä Co1 fuusioituna PEDV:n COE-antigeenin kanssa. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Sian epidemian ripuliviruksen genomin sekvenssianalyysi nukleokapsidi- ja piikkiproteiinigeenien välillä paljastaa polymorfisen ORF:n. Virologia. 1994; 198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Koreassa eristettyjen sian epidemian ripulivirusten piikkiproteiinigeenien heterogeenisyys. Virus Res. 2010; 149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et ai. Sikaepidemian ripuliviruksen piikkiproteiinialue (aa 636789) on välttämätön neutraloivien vasta-aineiden induktiolle. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et ai. Brucella abortuksen ulkokalvoproteiinin 16 proteiiniosa on uusi bakteeripatogeeneihin liittyvä molekyylikuvio, joka aktivoi dendriittisoluja in vivo, indusoi Th1-immuunivasteen ja on lupaava itseadjuvantoiva rokote systeemistä ja suun kautta hankittua luomistaudista. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC, et ai. Likvidoimaton ulkokalvoproteiini Omp16 (U-Omp16) Brucella spp. nenän adjuvanttina indusoi Th1-immuunivasteen ja moduloi Th2-allergista vastetta lehmänmaidon proteiineille. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P, et ai. Immuniteetti: Immunisointi rekombinantti Brucella-lajin ulkokalvoproteiinilla Omp16 tai Omp19 adjuvantissa indusoi spesifisiä CD4+- ja CD8+ T-soluja sekä systeemisen ja suun kautta annettavan suojan Brucella abortus -infektiota vastaan. Infektoi immuuni. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W, et ai. Suun kautta otettava rekombinantti Lactobacillus-rokote, joka kohdistuu suoliston mikrolaskossoluihin ja dendriittisoluihin sian epidemian ripuliviruksen ytimen neutraloivan epitoopin kuljettamiseksi. Mikrobisolutehtaat. 2018; 17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Assimiloivan nitraatti- ja nitriittireduktaasin heterologinen ilmentyminen ja biokemiallinen karakterisointi paljastaa Bacillus megaterium NCT-2:n sopeutumisen ja potentiaalin toissijaisessa suolautumismaaperässä. Int J Biol Macromol. 2017; 101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z, et ai. Caerin1.1 estää sian epidemian ripuliviruksen kasvua in vitro sitoutumalla suoraan virukseen. Virukset. 2018; 10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Biotekniikka: pMC11:n karakterisointi, plasmidi, jolla on kaksi replikaation aloituskohtaa, joka on eristetty Lactobacillus casei MCJ:stä ja sukkulavektorien rakentaminen kunkin replikonin kanssa. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S, et ai. Dendriittisoluihin kohdistuvaa peptidiä ilmentävien probioottien suun kautta fuusioituna sian epidemian ripuliviruksen COE-antigeenin kanssa: Lupaava rokotestrategia PEDV:tä vastaan. Virukset. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et ai. BVDV E2 -proteiinia ilmentävän rekombinantin Lactobacillus casein rakentaminen ja sen immuunivaste hiirissä. J Biotechnol. 2018; 270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, Equipment B. Sikojen epidemian ripuliviruksen piikki (PEDV-S1) -proteiinin ilmentymisen optimointi ja puhdistaminen Escherichia colissa. Biotechnol Biotechnol Equip. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, et ai. Sikojen epidemian ripuliviruksen piikkiproteiinin solukiinnitysalueet ovat neutraloivien vasta-aineiden keskeisiä kohteita. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y, et ai. Pinnoitettujen PEDV-kuormattujen mikropallojen oraalinen antaminen sai aikaan PEDV-spesifisen immuniteetin vieroitetuissa porsaissa. Rokote. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Sian epidemian ripuliviruksen vaikutukset sian monosyyteistä peräisin oleviin dendriittisoluihin ja suoliston dendriittisoluihin. Eläinlääkäri Microbiol. 2016; 106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Lactobacillus casein probioottisen kannan oraalisen antamisen aiheuttama immunomodulatorinen ja anti-inflammatorinen aktiivisuus. Tulehdus. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Suojaus tetanustoksiinia vastaan ​​kahden rekombinantin maitohappobakteerin mahalaukunsisäisen annon jälkeen: kannan elinkelpoisuuden ja in vivo -pysyvyyden vaikutus. Rokote. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS jne. Vero-solujen heikennetyn sian epidemian ripuliviruksen DR13-kannan tehokkuus suun kautta. Res. Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V, et ai. Sikojen epidemian ripuliviruksen piikkiproteiinin S1-domeeni rokoteantigeeninä. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW, et ai. Solut: Sellaisen epitooppialueen tunnistaminen, joka pystyy indusoimaan neutraloivia vasta-aineita sian epidemiaa ripulivirusta vastaan. Mol Cell. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H, et ai. B7-1:n ja B7-2:n erilainen vaikutus hiiren kokeellisen allergisen sidekalvotulehduksen kehittymiseen. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y, et ai. IL-22 estää sian enteeristen koronavirus- ja rotavirustartunnan aktivoimalla STAT3-signaalireitin. Antivir Res. 2017; 142:68–75.