Kasvutekijän muuntamisen (TGF-) keskeinen rooli munuaisfibroosin kehityksessä
Mar 26, 2022
Yhteystiedot: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 Sähköposti:audrey.hu@wecistanche.com
OSA Ⅰ: Ihmisen primaaristen munuaisfibroblastien rooli TGF{0}}välitteisissä fibroosia jäljittävissä laitteissa
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee & ym.
1. Esittely
Munuaisten fibroosi, joka on lukemattomien progressiivisten munuaissairauksien lopullinen yhteinen reitti, on ominaista solunulkoisen matriisin (ECM) proteiinituotannon lisääntyminen, matriisin hajoamisen väheneminen, solu-matriisivuorovaikutuksen toimintahäiriö, asuvien solujen transformaatio ja tulehdussolujen infiltraatio.Muuttava kasvutekijä-(TGF-) on monitoiminen dimeerinen peptidi, joka säätelee biologisia prosesseja, kuten solujen lisääntymistä, erilaistumista ja immunologisia vasteita [1]. Lukuisten fibrogeenisten tekijöiden joukossa TGF- (Muuttava kasvutekijä-) on keskeinen rooli ja sillä on tulehdusta ehkäisevä vaikutus. TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)-puutoshiiret kuolevat massiiviseen tulehdukseen. Transgeeniset hiiret, jotka yli-ilmentävät TGF:ää- 1(Muuttava kasvutekijä-)ovat käytännössä suojassa munuaisten fibroottisen patologian kehittymiseltä, pääasiassa sen anti-inflammatorisen vaikutuksen ansiosta [2]. TGF:n profibroottiset ja anti-inflammatoriset ominaisuudet(Muuttava kasvutekijä-)ovat kaksiteräisiä miekkoja koskien TGF-(Muuttava kasvutekijä-)esto. TGF:n estämiseksi on tehty merkittäviä yrityksiä.(Muuttava kasvutekijä-)etenemistä estävät toimetmunuaistenfibroosi[3]. Vaikka taistelussa on käytetty monia lähestymistapojamunuaistenfibroosi, kokeellinen malli tällä hetkellä saatavilla olevien lääkkeiden arvioimiseksi ei ole ihanteellinen.
cistanche yrtti estäämunuaisten sairaudet
Yleisesti ottaen eläinkokeilla on keskeinen rooli prekliinisissä testeissä farmakokinetiikan ja lääkkeiden tehon ennustamisessa. Eläinten ja ihmisten välillä on kuitenkin erilaisia eroja, mikä saa meidät kyseenalaistamaan eläinperäisten lääkkeiden teho- ja turvallisuustestien tarkkuuden 4. Aiemmat raportit ovat riippuneet prekliinisistä eläintutkimuksista lääkekehityksen aikana lääkkeiden munuaistoksisuuden ja turvallisuuden arvioimiseksi. Eläinten munuaisten toiminta on yli kaksi kertaa ihmisen munuaisiin verrattuna. Siksi lääkkeet metaboloituvat nopeammin eläimissä kuin ihmisissä, mikä vaikeuttaa lääkkeiden toksisuustestien tulosten selvittämistä eläinkokeiden avulla. Lisäksi eläinkokeiden tuloksia ei voida käyttää ihmisten lääkevasteiden ennustamiseen, koska eläimillä on erilaisia fysiologisia toimintoja. Eläinperäinenmunuaisten fibroosimalleilla on vaikeuksia toistaa ihmistämunuaisten fibroosi; Tästä syystä tutkimustyötä tehdään parhaillaan nykyisten esteiden voittamiseksi ja huumeiden löytöalustojen optimoimiseksi [5].
Organ-on-a-Cip (OoC) -tekniikka on noussut uudeksi konseptiksi näiden ongelmien ratkaisemiseksi. Tämä alusta on suunniteltu ottaen huomioon nykyiset puutteet, ja se on osoittanut suurta lupausta nefrologian alalla [6]. Lisäksi OoC-malleilla on suuri potentiaali korvata kokeellisia eläinmalleja, ne tarjoavat ratkaisun lajien välisiin eroihin ja voivat auttaa lopettamaan eläinten julmuuden ja eettiset keskustelut [7]. On olemassa muutamia in vitro -malleja, joissa käytetään samanaikaisesti primaarisia munuaisten fibroblasteja endoteelisolujen ja epiteelisolujen kanssa, jotka ovat tärkeitä solujamunuainenfibroosi. Jokaisen solun roolifibroositutkitaan erikseen; solujen vuorovaikutuksesta on kuitenkin vain vähän tietoa.
Tässä tutkimuksessa kehitimmefibroosi- jäljittelevät laitteet, joissa käytetään ihmisen primaarisia fibroblasteja. Vahvistimme, että TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoidolla on erilaisia vaikutuksiamunuaisten fibroosimalli. Erityisesti fibroblasteilla on keskeinen rooli efektorisoluina, ne edistävät profibroottisen mikroympäristön muodostumista ja erittävät kasvutekijöitä ja sytokiinejä. Siksi tämän uuden menetelmän perusteella fibroblastit voivat tarjota ihanteellisen solumallijärjestelmän munuaissairauden tutkimiseen. Arvioimme, vaikuttavatko fibroottisesta munuaissairaudesta peräisin olevat fibroblastit kolmessa ulottuvuudessa (3D) viljeltyjen solujen eheyteen. Lopuksi esittelemme periaatteellisen tutkimuksen, joka osoittaa ihmisen potentiaalinmunuaisten fibroosi- jäljittelevät laitteet mallina ihmisen vasteen ennustamiseenmunuaisten fibroosi.
cistanchen vaikutukset: hoitaa munuaisinfektiota
2. Tulokset
2.1. Alfa sileän lihaksen aktiinin (a-SMA) ja keratiinin-8(KRT-8) tunnistus TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)HK-2-soluissa
Varhaisessa vaiheessa tutkimme tunnettuja merkkiaineitafibroosija sytoskeleton kaksiulotteisissa (2D) kulttuureissa. Immunofluoresenssivärjäysmääritykset suoritettiin fibroosin ja tubulaarisen epiteelin ja mesenkymaalisen siirtymän (EMT) markkerin -SMA-ekspression ja KRT8-tasojen arvioimiseksi sytoskeleton markkerina. Immunofluoresenssivärjäys osoitti, että -SMA:n ilmentyminen oli alun perin heikkoa ja KRT8-tasot olivat korkeat yksikerroksisissa HK-2-epiteelisoluissa. TGF- 1 ei muuttanut merkittävästi fluoresenssin intensiteettiä(Muuttava kasvutekijä-)(5 ng/ml) tai HK-2-epiteelisolujen spesifinen inhibiittorikäsittely 24 tunnin ajan (kuva 1).
Kuva 1. Immunofluoresenssi osoittaa, että alfa-SMA:n ja keratiinin-8(KRT8) ilmentyminen säilyi TGF- 1-käsittelyllä(Muuttava kasvutekijä-)tai inhibiittori HK-2-soluissa.(A)Alfa-SMA:n ja (B)CCK-8:n ilmentymisellä ei ollut vaikutusta TGF- 1:n HK-2soluihin(Muuttava kasvutekijä-)(5 ng/ml) tai inhibiittori. Solut maljattiin alun perin tiheydellä 1 × 10 astetta per kuoppa (ac) käsittelemätön kontrolli ja (df) stimuloitiin 5 ng/ml TGF:llä{6}}(Muuttava kasvutekijä-) tai (gi) 10 μM inhibiittoria (SB431542) 24 tunnin ajan ja kiinnitetty 4-prosenttisella paraformaldehydillä. Sitten solut värjättiin anti- -SMA:lla ja anti-sytokeratiinilla-8 20 minuutin ajan. Suoritettiin yhteisvärjäys Hoechst-väriaineella H33342 soluytimien tunnistamiseksi. Mittakaavapalkit mikrokuvissa osoittavat 200 um.
cistanche-jauhe parantaa munuaisten toimintaa
2.2. KRT8-lauseketta vähentänyt TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)sirulla
Seuraavaksi arvioimme -SMA:n ja KRT8:n ilmentymistasot 3D-viljellyssä HK-2:ssa ja TGF- 1:lla käsiteltyjen GFP-ihmisen napalaskimon endoteelisolujen (HUVEC) kokonaispituuden.(Muuttava kasvutekijä-)ja spesifinen inhibiittori. Tämän saavuttamiseksi loimme ensin kudossirukuvion, joka käsitti kaksi solutyyppiä, HK-2 epiteelisolut ja GFP-HUVEC:t. Konstruktin vahvistamisen jälkeen paljastimme kudossirun TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)(5 ng/ml) tai spesifistä inhibiittoria (10 um SB431542) 24 tunnin ajan.
Kuten kuvasta 2A-C näkyy, TGF- 1 ei spesifisesti muuttanut -SMA:n ilmentymistä(Muuttava kasvutekijä-)tai spesifinen estäjähoito. Kuitenkin KRT8:n ilmentyminen väheni kaksisolutyyppisessä yhteisviljelmässä sirussa. Lisäksi TGF-ß1-estäjän lisääminen lisäsi KRT8:n ilmentymistä.
Tutkimme kolmiulotteisen putkimaisen kapillaarimaisen verkon muodostumista TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon HUVEC:issa, koska endoteelisolut voivat muodostaa spontaanisti 3D-putkimaisen kapillaariverkon. Kulttuuriolojemme mukaisesti paksujen viivojen muodostuminen väheni merkittävästi. Kuitenkin kapillaarimaiset ohuet viivat lisääntyivät TGF:ssä- 1(Muuttava kasvutekijä-)käsitellyt GFP-HUVEC:t. TGF:n tapauksessa- 1(Muuttava kasvutekijä-)inhibiittorikäsittely 3D-viljellyllä sirulla, paksujen ja paksujen viivojen kokonaispituus osoitti käänteistä taipumusta TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon. Paksun viivan pituuden lisääntyminen havaittiin verrattuna käsittelemättömään kontrolliryhmään. Samanlainen kuvio havaittiin paksun viivan halkaisijassa GFP-HUVEC:ssä TGF- 1 jälkeen(Muuttava kasvutekijä-)hoito ja estäjähoito. GFP-HUVEC:n halkaisija vaimensi TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon, mutta lisääntyi riippumatta viivan paksuudesta inhibiittorilla verrattuna sekä kontrolleihin että TGF:ään{0}}(Muuttava kasvutekijä-). Paksun viivan kokonaispituus ja halkaisija kasvoivat dramaattisesti TGF{0}}-estäjäkäsittelyllä verrattuna käsittelemättömään kontrolliin ja TGF{1}}-hoitoon. Erityisesti saadut tulokset osoittivat pienten verisuonten lisääntyneen tiheyden TGF-(Muuttava kasvutekijä-)-hoidettu ryhmä verrattuna hoitamattomiin kollegoihinsa. Sitä vastoin paksujen suonten tiheys TGF:ssä- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoitoryhmässä oli pienempi kuin käsittelemättömässä kontrolliryhmässä (kuvio 2D, E).
Kuva 2. KRT8:n ilmentyminen HK-2:ssa ja HUVEC:ien kokonaispituus ja halkaisija.(A) Immunofluoresenssi osoittaa, että -SMA:n ilmentyminen säilyi ja KRT8:n ilmentyminen väheni dramaattisesti TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)HK-2. Solut maljattiin ja niitä stimuloitiin 5 ng/ml TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)tai 10 μm:n inhibiittori (SB 431542) 24 tunnin ajan ja kiinnitetty 4-prosenttisella paraformaldehydillä. Solut värjättiin anti- -SMA:lla ja anti-sytokeratiinilla-8 20 minuutin ajan. Suoritettiin yhteisvärjäys Hoechst-väriaineella H33342 soluytimien tunnistamiseksi. -SMA(ac):n ilmentyminen ei muuttunut, mutta TGF- 1 muutti merkittävästi KRT8(df):n HK-2-soluissa ja GFP:n HUVEC(gi)-ilmentymisessä.(Muuttava kasvutekijä-)(5 ng/mL) ja inhibiittori (B, C). HUVEC:ien kokonaispituudessa ohut suonen kasvoi, mutta paksu suonen pienensi TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-). Halkaisijaa kasvatettiin sekä ohuissa että paksuissa suonissa. Nämä tulokset kumosi inhibiittori SB431542 (D, E). Mittakaavapalkit mikrokuvissa osoittavat 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
Mihin cistanchea käytetään: kroonisten munuaissairauksien hoitoon
2.3. TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)Vaikuttaa kolmeen solutyyppiin sirussa, jossa on moniosastoinen rakenne
TGF:n tutkiminen- 1(Muuttava kasvutekijä-)ehdotetun 3D-sirun vasteet, suoritimme immunovärjäyksen jokaiselle osastolle erikseen (kuva 3). Tässä analyysissä käytettiin primäärisiä ihmisen munuaisfibroblasteja. Näytteet analysoitiin käyttäen FACS:ää ja vahvistettiin positiivisiksi fibroblastimarkkerivasta-aineelle. Kolmen solutyypin inkuboinnin jälkeen TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)24 tunnin ajan suoritettiin immunovärjäys -SMA:n ja KRT8:n ilmentymisen arvioimiseksi. TGF-1-hoito tehosti a-SMA:n ilmentymistä, ja TGF- 1:lla havaittiin päinvastaisia tuloksia.(Muuttava kasvutekijä-)inhibiittorihoito. Sitä vastoin TGF- 1 vähensi KRT8:n ilmentymistä(Muuttava kasvutekijä-)ja osoitti päinvastaisen vasteen TGF-(Muuttava kasvutekijä-)inhibiittori (kuvio 4A-C).
Kuva 3. Näytekuva, jossa on laitteen kaavamainen esittely valmistuksesta ja koeaikataulusta.(A)Kaksi ylintä kuvaa näyttävät asettelun. Vasemmassa kuvassa on yleiskuva laitteesta ylhäältä alaspäin. Alemmissa kuvissa näkyy poikkileikkaus. Kaavionäkymä, jossa on yksityiskohtaiset tiedot nesteohjaimien mitat. (B)Tämä kuva kuvaa koeaikataulutfibroosi- matkivat laitteet. Jokaisen kuopan nelivaiheinen latausprosessi. Jokaisen hydrogeelikuviointialueen sijainti sekä väliaineen sijoitus ylhäältä alaspäin ja isometrinen poikkileikkaus. (1) Yhteensä 1,5 ul hydrogeeliä 1 ohjataan spontaanisti keskuskanavaan. (2) Keskikanava on täytetty 5 ul:lla hydrogeeliä. (3) Säiliön pohjalle on kuvioitu yhteensä 10 uL hydrogeeliä 3. (4) Yhteensä 200 μl väliainetta annostellaan. Punainen asteikkopalkki=9 mm.
Kuten kuvassa 4D-G on esitetty, TGF- 1 lisäsi merkittävästi kapillaarimaisen ohuen viivan pituutta(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon GFP-HUVEC:issa. Paksun viivan paksuus kuitenkin pieneni TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-)hoidetut HUVEC:t. HUVEC:iden ohuiden ja paksujen suonten halkaisija pieneni keskimäärin. TGF:n tapauksessa- 1(Muuttava kasvutekijä-)inhibiittorikäsittely 3D-viljellyllä sirulla, paksujen ja paksujen viivojen kokonaispituus osoitti päinvastaista suuntausta kuin TGF- 1-käsittely. Lisäksi paksun viivan pituus kasvoi verrattuna käsittelemättömään kontrolliryhmään.
Kuva 4. 3D-viljeltyjen HK-2- ja HUVEC-solujen muutos primaarisilla munuaisfibroblasteilla.Solujen kokonaismäärä maljattiin tiheydellä 5 × 10 astetta 3D-sirua kohti ja niitä stimuloitiin 5 ng/ml TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)tai 10 μm:n inhibiittori (SB 431542) 24 tunnin ajan ja kiinnitetty 4-prosenttisella paraformaldehydillä. (A) 3D-sirun solut värjättiin anti-o-SMA:lla ja anti-sytokeratiinilla-8. TGF- 1(5 ng/ml) nosti -SMA:n (ac) ilmentymistä ja vähensi KRT8(df):n ilmentymistä merkittävästi. HUVEC:ien kokonaispituus; ohuet verisuonet lisääntyivät dramaattisesti ja paksut suonet vähenivät TGF-ß1:n vaikutuksesta(Muuttava kasvutekijä-)(D, E). Ohuiden ja paksujen suonien halkaisijaa pienennettiin (F, G). Inhibiittori SB431542 kumosi nämä tulokset. Mittakaavapalkit mikrokuvissa osoittavat 100 μm.*p<><0.01,and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Moduloi tulehduksen välittäjää ja kasvutekijöitä
Seuraavaksi tutkimme tulehduksellisia sytokiineja ja kasvutekijöitä supernatantissa; IL-1, FGF-2, TGF- 2(Muuttava kasvutekijä-)ja TGF- 3(Muuttava kasvutekijä-)proteiinin eritys oli dramaattisesti korkeampi 3D-viljellyissä siruissa kuin 2D-fibroblastien viljellyissä hyvin, vaikka niillä oli sama kokonaissolumäärä. Kuitenkin TGF- 1(Muuttava kasvutekijä-) tasot olivat samankaltaisia, koska 2D- tai 3D-viljeltyjä malleja käsiteltiin samanlaisilla TGF-pitoisuuksilla- 1(Muuttava kasvutekijä-)(Kuvio 5A-E). Erityisesti FGF-2:n vapautuminen ihmisen primaarisista munuaisten fibroblasteista oli 20,9 ± 0,4 pg/päivä/5 × 10 asteen soluja 2D yksikerroksisesta viljelmästä ja 3094,8±0,2 pg/päivä/5 × 10 asteen soluja, mukaan lukien HUVEC:t ja HK-2 3D-viljellystä sirusta käsittelemättömässä kontrollissa. TGF- 1:n FGF-2 eritys(Muuttava kasvutekijä-)stimulaatio oli 31.0±0.2pg/day/5×10 astetta solua 2D-viljelmässä ja 3683,9±0,8 pg/day/5×10 astetta 3D-viljelmässä -viljelty siru. Tämä FGF-2-proteiinituotannon lisääntyminen 2D-yksikerrosviljelmässä oli rinnakkain TGF- 1:n 3D-viljellyn sirumallin lisääntymisen kanssa.(Muuttava kasvutekijä-)käsittely (kuvio 5B).
Kuva 5. 2D- ja 3D-viljeltyjen mallien vertailu munuaisfibroosia jäljittelevinä alustoina.Solut maljattiin tiheydellä 5 × 10 astetta 2D-kuoppaa tai 3D-sirua kohti ja niitä stimuloitiin 5 ng/ml TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)tai 10 um inhibiittoria (SB 431542) 24 tunnin ajan. Primäärisiä ihmisen munuaisfibroblasteja käytettiin 2D-viljelmässä ja 3D-viljelmässä mallissa. Fibroblasteja käytettiin tiheydellä 8 × 10* viljeltynä HUVEC:ien ja HK-2 kanssa. Ihmisen primaarinen munuaisfibroblasti-HUVEC-suhde eli F:H-suhde oli 1:5 arvioinnissa.fibroosi.HK-2 soluja käytettiin tiheydellä 2 × 104. (A)IL-1,(B)emäksisen fibroblastikasvutekijän (FGF-2) ja (CE)TGF-beeta 1, 2 ja 3 havaitseminen supernatantista suoritettiin multipleksianalyysillä sytokiinit ja multipleksihelmi-immunomääritys. Jokainen pylväs edustaa keskiarvoa ± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Muuttava kasvutekijä-).
cistanche tubolosa edut: munuaissairauksien hoito
Lisäksi arvioimme proinflammatoristen sytokiinien, kuten IL-1, IL-6, IL-8 ja TNF-, mRNA:n ilmentymisen. Rekombinantti ihmisen TGF- 1 alensi tuloksia merkittävästi(Muuttava kasvutekijä-)hoito 3D-viljellyssä sirussa TGF:n anti-inflammatorisena ominaisuutena(Muuttava kasvutekijä-). Huomasimme, että mRNA:n ilmentymistä sääteli TGF{0}}(Muuttava kasvutekijä-)estäjä (SB431542). Lisäksi inhibiittorivälitteinen IL-6-, IL-8- ja TNF-ilmentyminen oli spesifisesti alentunutta verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (kuvio 6A-D). TGF- 1 nosti merkittävästi fibroottisen tekijän, VEGF:n mRNA-tasoa(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon. TGF- 1-inhibiittori alensi VEGF:n mRNA-tasoa (kuva 6E), kun taas antifibroottisen vaikutuksen omaavan IL-10:n mRNA-ilmentyminen väheni TGF- 1:n indusoimissa fibroottisissa olosuhteissa. . Sitä vastoin I-10mRNA:n ilmentyminen lisääntyi TGF- 1-inhibiittorikäsittelyllä (kuvio 6F).
Kuva 6. Reaaliaikainen PCR näyttää 3D-sirun mRNA:n kokonaisekspression.Solut maljattiin tiheydellä 5 × 10 astetta 3D-sirua kohti ja niitä stimuloitiin 5 ng/ml TGF:llä- 1(Muuttava kasvutekijä-)tai 10 um inhibiittoria (SB431542) 24 tunnin ajan. 3D-viljellystä sirusta uutettu kokonais-RNA. (A)IL-1, (B)TNF-, (C)IL-6 ja (D)IL-8 mRNA:n ilmentyminen edustaa TGF{:n anti-inflammatorista vaikutusta. {10}}(Muuttava kasvutekijä-)hoitoon. (E)VEGF:n ilmentyminen angiogeenisenä tekijänä lisääntyi. TGF- 1 vähensi merkittävästi (F)IL-10-ilmentymistä antifibroottisena tekijänä.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Muuttava kasvutekijä-).