Terahertzin korkearesoluutioinen spektroskopia diabeetikkojen ja ei-diabeettisten veriplasman ja munuaiskudosten pellettien lämpöhajoamiskaasutuotteista
Mar 28, 2022
Ottaa yhteyttä:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Abstrakti
Merkitys:Yksi lääketieteellisen diagnostiikan moderneista suuntauksista perustuu metabolomiikkaan, joka mahdollistaa aineenvaihduntatuotteiden määrittämisen, jotka voivat olla sairauden erityispiirteitä. Korkearesoluutioinen kaasuspektroskopia mahdollistaa biologista alkuperää olevien näytteiden kaasumetaboliittipitoisuuden tutkimisen. Esittelemme terahertsin (THz) korkearesoluutiospektroskopian menetelmän kehittämisen diabeettisten ja ei-diabeettisten biologisten näytteiden, jotka on valmistettu pelleteiksi, tutkimiseksi.
Tavoite:Työn pääideana on tutkia diabeettisten ja ei-diabeettisten kuivattujen lämpöhajoamiskaasutuotteiden pitoisuutta.veriplasmaajamunuaiskudoksetTHz:n korkearesoluutiospektroskopiamenetelmällä diabeteksen luonnehtivien kaasumarkkerien paljastamiseksi.
Lähestyä:Esittelemme lähestymistavan diabeetikkojen ja ei-diabeettisten tutkimiseenveriplasmaa(ihminen ja rotta) jamunuaiskudokset(rotat), käyttämällä korkean resoluution spektroskopiaa, joka perustuu THz-taajuusalueen ei-stationaariseen vaikutukseen. Kehitettiin menetelmiä veri- ja munuaiskudosnäytteiden valmistamiseksi pelleteiksi ja näytteiden höyrystämiseksi.
Tulokset:Höyryjen rotaatioabsorptiospektrien mittaukset kuumennettaessa verestä valmistettuja pellettejä jamunuaiskudostasuoritettiin 118-178 GHz:n taajuusalueella. Näytteen höyryjen spektrissä esiintyvät absorptioviivat havaittiin ja tunnistettiin. Lämpöhajoamistuotteiden molekyylipitoisuudet vaihtelivat ei-diabeettisten ja diabeettisten näytteiden osalta; esim. päämarkkeri on asetoni, jota esiintyy diabeettisen veressä (ihmisen ja rotan) ja diabeetikon veressä.munuaiskudosta.
Johtopäätökset: Paperimme havainnollistaa potentiaalista kykyä määrittää biologisten näytteiden metaboliittipitoisuus diagnostiikkaa varten ja sairauksien ennuste kliinisen lääketieteen kannalta. © Tekijät. Julkaisija SPIE Creative Commons Attribution 4:llä.0 Unported License. Tämän teoksen levittäminen tai jäljentäminen kokonaan tai osittain edellyttää alkuperäisen julkaisun täydellistä nimeämistä, mukaan lukien sen DOI. [DOI: 10.1117/1.JBO.26.4.043008] Avainsanat: korkearesoluutioinen terahertsispektroskopia; lämpöhajoamisen; kudos;veriplasmaa; diabetes; lyofilisointi.
Avainsanat:korkean resoluution terahertsispektroskopia; lämpöhajoamisen; veriplasmaa; diabetes; lyofilisointi, munuaiskudos.
1. Esittely
Nykyään yhteiskunnallisesti tärkeiden sairauksien (diabetes, syöpätaudit jne.), myös varhaisvaiheen, diagnostiikkaongelma herättää suurta huomiota maailman tiederyhmissä.Yksi uusista lähestymistavoista, joka avaa uusia mahdollisuuksia eri sairauksien diagnostiikassa ja hoidossa, on metabolomiikka. Metabolomiikka on tieteenala, joka tutkii biologisen järjestelmän (solun, elinten tai koko organismin) loppu- ja väliaineenvaihduntatuotteita. Metabolomiikka voi paljastaa aineenvaihduntatuotteet, jotka voivat olla taudin erityispiirteitä ja joilla voi olla suuri rooli taudin diagnoosissa ja ennusteessa. Välineet, jotka sisältävät ihmisen elimistön loppu- ja väliaineenvaihduntatuotteita ja ovat hyödyllisiä sairauksiin ja patologioihin liittyvien aineenvaihduntatuotteiden paljastamisessa, ovat uloshengitys, veri, virtsa, sylki jne.
Yksi yhteiskunnallisesti merkittävistä ihmisten elämänlaatua uhkaavista sairauksista on diabetes. Tyypin 2 diabetes mellitus oli aiemmin keski-iän sairaus, mutta nyt sitä diagnosoidaan aikuisilla, nuorilla ja lapsilla. 18-vuotiaiden diabetespotilaiden sekä 1-13-vuotiaiden lasten veri- ja virtsanäytteiden metabolomien tutkimusten tulokset on esitetty Human Metabolome Database (HMDB) -tietokannassa.1 Pääasiassa veri (21 kemiallista ainetta mukaan lukien isomeerit), virtsa ( Tutkittiin 30 kemiallista ainetta, mukaan lukien isomeerit, ja aivo-selkäydinnestettä (1 kemiallinen aine). Esimerkiksi (R)-3-hydroksivoihappoa havaittiin kaikista kolmesta nestetyypistä. Joitakin aineita (asetoetikkahappoa, D-fruktoosia ja D-glukoosia) havaittiin molemmista nesteistä (verestä ja virtsasta). Diabeteksen tyypillisempi piirre (asetoni, CH3COCH3) esiintyi vain virtsassa. Nestenäytteet, HMDB:ssä esitettyjen tutkimusten tulokset, on tutkittu eri menetelmillä - kaasukromatografia; 2 kaasukromatografia massaspektrometrialla; 3,4 kaasu-nestekromatografia massaspektrometrialla; 5 korkearesoluutioinen ydinspektroskopia protonimagneettinen resonanssi;6 ja menetelmät, joissa käytetään erityisiä laitteita diabetespotilaan tilan seurantaan, jatkuvaa glukoosin seurantajärjestelmää.7
Kroonisen munuaissairauden kehittyminen on diabeteksen merkittävä komplikaatio. Vaikka glykoituneen albumiinin määritys on yleinen lähestymistapa seulonnassa, munuaisvauriot voivat alkaa kauan ennen kuin kliinisesti merkittäviä muutoksia virtsan albumiinissa ilmenee. Kun otetaan huomioon kroonisen munuaissairauden monitekijäinen patogeneesi, sen seulonnassa on otettu huomioon erilaisia markkereita.8,9 Niiden diagnostinen arvo ilman munuaisbiopsiaa näytti kuitenkin kyseenalaiselta.
Spekroskooppinen lähestymistapa voi antaa tietoa biologisten näytteiden sisällöstä, jota voidaan käyttää lääketieteellisessä diagnostiikassa. Terahertsin (THz) taajuusalue on erittäin tärkeä elävien organismien kaasujen, nesteiden ja kudosten tutkimisessa. On olemassa joitain katsauksia, jotka on omistettu THz-taajuusalueen menetelmien sovelluksille, mukaan lukien THz-aika-aluespektroskopia, THz-reflektorimetria ja THz-kuvantaminen biologiassa ja lääketieteessä.10
THz aika-aluespektroskopia mahdollistaa spektrien havaitsemisen, jossa absorptiokertoimella tai taitekertoimella on joitain spektriominaisuuksia, jotka vastaavat joidenkin biomolekyylien (proteiinit, sokerit jne.) esiintymistä näytteissä tai niiden eri pitoisuuksia.11
Molekyyliabsorptiospektroskopia ja erityisesti THz-kaasuspektroskopia on erittäin lupaava lähestymistapa eri alkuperää olevien monikomponenttisten kaasuseosten tutkimuksiin.12 Nestemäisessä ja kiinteässä olomuodossa olevia näytteitä voidaan tutkia höyrystämällä tai lämpöhajoamalla. Yhteiskunnallisesti tärkeiden sairauksien (diabetes, syöpä jne.) metaboliitit-markkerit voidaan paljastaa sen spektrilinjoilla absorptiospektreissä, jotka suoritetaan säteilyn siirtyessä kaasunäytteiden läpi.
Diabetespotilailta (12 henkilöä) otetuissa uloshengityshengitys- ja virtsanäytteissä asetonin taso mitattiin terahertsialuespektrometrillä, jossa oli vaikuttavan säteilyn vaihesiirtoavainnointi. Kokeet tehtiin yhteistyössä Almazovin kansallisen lääketieteellisen tutkimuskeskuksen kanssa. Mittaukset suoritettiin asetonin absorptiolinjoilla keskustaajuuksilla 150,537 ja 151,647 GHz. Mittaukset tehtiin ilman lämmitystä. Diabetespotilaiden uloshengitys- ja virtsanäytteiden samanaikainen analyysi paljasti, että virtsan asetonitaso oli paljon korkeampi kuin uloshengitetyssä, joissain tapauksissa jopa suuruusluokkaa korkeampi.13,14
THz:n korkearesoluutioisten kaasuspektroskopiatutkimusten tuloksetveriplasmaapotilaiden ja rottien (ehdollisen terveet ja diabetesta sairastavat) sekä rotanmunuaiskudosta(terveet ja diabetesta sairastavat) kuivatut ja pelleteiksi puristetut esitellään. Kudokset taiveriplasmaaelävistä organismeista ilman valmistelua, on tutkittava välittömästi näytteenoton jälkeen. Valmistus pelleteiksi mahdollistaa tutkimuksen riittävän pitkän ajan kuluttua verinäytteen tai munuaisbiopsian jälkeen.
2 Kokeet ja menetelmät
2.1 Menetelmä veriplasmapellettien ja munuaispellettien valmistamiseksi
Laskimoverta tyypin 2 diabetes mellitusta sairastavilta potilailta ja ehdollisesti terveiltä osallistujilta kerättiin Almazovin kansallisen lääketieteellisen tutkimuskeskuksen endokrinologian osastolla; keskus tarjoaa sairaanhoitoa diabeetikoille. Kolme potilasta ja kaksi osallistujaa olivat miehiä, samanikäisiä (39-43-vuotiaita). Potilaat ja osallistujat sekä lääketieteellisen keskuksen käyttökomissio tarkastelivat ja hyväksyivät kaikki tässä tutkimuksessa käytetyt kokeelliset protokollat. Laskimoveri kerättiin aamulla 8-12 tunnin paaston jälkeen putkeen, jossa oli antikoagulanttia K3EDTA (Vacutest Kima, Italia). Plasma saatiin biokemiallisten parametrien analysointia varten sentrifugoimalla kokoverta nopeudella 3000 rpm 15 minuutin ajan laboratoriosentrifugissa (Eppendorf 5702R, Saksa) þ4 asteen lämpötilassa. Biokemiallisten parametrien arvotveriplasmaanäytteet ja vertailuvälit on esitetty taulukossa 1 (glykoituneen hemoglobiinin taso saatiin kokoverestä). Taulukko 1 osoittaa, että glukoosin, triglyseridien ja glykoituneen hemoglobiinin pitoisuus diabetespotilaan näytteissä kasvaa 1,5-, 2- ja 2,3-kertaisesti.
Tutkimus suoritettiin myös 8 viikon ikäisillä ja 180-200 g painoisilla Wistar-urosrotilla kokeellisen lääketieteen instituutin Almazovin kansallisen lääketieteellisen tutkimuskeskuksen hyväksymän kokeellisen tutkimusohjelman mukaisesti. Koeryhmän eläinten glukoositaso oli 21 mmol∕l 120 minuutin kuluttua glukoosilatauksesta. Kontrolliryhmänä käytettiin ehjiä rottia. Laskimoveri kerättiin alemmasta onttolaskimosta ennen eläinten lopettamista. Myös munuaiset kerättiin. Verinäytteet kerättiin putkiin, jotka sisälsivät antikoagulanttia.
Testinäytteet pakastettiin -80 asteen lämpötilaan (matalien lämpötilojen jääkaappi DW-86L388A, Haier, Kiina). Sitten se lyofilisoitiin pakastekuivauksella Vaco 2:lla (ZirBus, Saksa) -50 asteen lämpötilassa ja 3 Pa:n paineessa. Pakastus suoritetaan ennen kylmäkuivausta, koska kylmäkuivauksen aikana korkean sisäisen paineen vaikutuksesta biologiset komponentit voivat tuhota. Kuivatut näytteet olivat biologisista kiteistä koostuvaa sientä. Sieni tuhoutui metallilastalla ja murskattiin useiden kymmenien mikrometrien kokoisiksi kiteiksi. Huhmarin ja survin käyttö oli mahdotonta, koska näytteiden koostumuksessa olevien proteiinien jauhaminen johtaisi niiden ei-toivottuun tarttumiseen ja pyöreiden rakeiden muodostumiseen.
Lyofilisoitu näytejauhe punnittiin (analyyttinen vaaka OHAUS Discovery, Sveitsi) ja asetettiin sitten teräspuristusmuottiin. Käyttämällä laboratoriopuristimia (Angkor, Venäjä ja Specac, Iso-Britannia) tietyllä muovauspaineellaveriplasmaasaatiin pellettejä ja munuaispellettejä. Jokainen pellettien kide sisältää tietyn prosenttiosuuden rasvoja (triglyseridejä), proteiineja (albumiinia) ja fibrinogeenia - ne kaikki normaaleja tai glykoituneita (diabeteksen tapauksessa). Kontrolliryhmän näytteiden pellettejä kutsutaan jäljempänä "ei-diabeettiseksi pelletiksi" ja näytteiden pellettejäDiabeettiseen ryhmään viitataan tämän jälkeen "diabeettisena pelletinä".
2,2 THz:n korkean resoluution spektroskopian kokeellinen asennus
Ei-stationaarisiin vaikutuksiin perustuva korkearesoluutioinen THz-spektroskopia mahdollistaa kaasun ja höyryn monikomponenttisten kaasuseosten komponenttikoostumuksen analysoinnin. Spektrometrit tarjoavat herkkyyden lähellä teoreettista rajaa vain Doppler-ilmiön rajoittamalla resoluutiolla ja voivat tallentaa nopeita prosesseja. Herkkyys säilyy, vaikka kaasunpaine laskee huomattavasti, ja se on noin 0,2 ppb skannaustilassa joidenkin kaasujen osalta (esim. ammoniakki absorptioviivan mittauksissa lähellä taajuutta 572 GHz). Lisäksi se mahdollistaa kaasuseoksen komponenttikoostumuksen määrittämisen erittäin luotettavasti.12 Pellettien lämpöhajoamistuotteiden tutkimus tehtiin THz:n ei-stationaarisen kaasuspektroskopian menetelmällä 118-178 GHz alueella. Spektrometri käyttää vaihelukittua silmukkaa taaksepäin suunnatun aallon lampun taajuuden ja vaihesiirron automaattiseen ohjaukseen, rekisteröintiin aika-alueelle, keskiarvon laskemiseen ja spektroskooppisen siirtymäsignaalin käsittelyyn. Laite rekisteröi signaalin aikatasoon. Näytteiden höyryt analysoitiin käyttämällä seuraavaa menettelyä. Pelletit laitettiin koeputkeen tyhjiöpumpulla, asteittain kuumennetulla koeputkella (240 asteeseen asti) ja saatu näytteen lämpöhajoamistuotteiden seos päästettiin mittakennoon. Tiedosto sisältää yleensä tallenteita spektrometrin valitusta tai koko toiminta-alueesta. Siksi aineet voidaan tunnistaa näytteen kokonaisspektrissä esiintyvien absorptioviivojen perusteella ja seoksen pitoisuuksien dynamiikkaa voidaan jäljittää vertaamalla useita tietotiedostoja. Aineet tunnistettiin etsimällä niitä avoimen lähdekoodin MW-, mmw- ja THz-tietokannoista.15,16
3 Veriplasmahöyryjen ja munuaishöyryjen analyysi korkearesoluutioisella terahertsispektrometrillä
THz-TDS-järjestelmillämme mittasimme pellettien läpäisyä spektrialueella 0,2 - 1,4 THz,17, mutta tiedämme, että biomolekyyleillä ja erityisesti sen kaasutilassa olevilla hajoamistuotteilla on informatiivinen vaste (kiertoabsorptio). spektrit) näillä taajuuksilla ja myös alemmilla taajuuksilla, joten teimme lisätutkimuksen THz:n korkearesoluutiolla kaasuspektrometrillä. Diabeettisella ihmisellä havaitut aineiden absorptiolinjatveriplasmaasamat kuin diabeettisten ihmisten aineiden kanssaveriplasmaa, paitsi asetonia. Spektrometrin työtaajuusalueella (118-178 GHz) on monia asetonin absorptioviivoja. Yleensä yhden aineen jonkin absorptiolinjan havaitseminen on enemmän kuin tarpeeksi, jotta aineen läsnäolo monikomponenttisessa kaasuseoksessa voidaan yksiselitteisesti määrittää. Esimerkki absorptiospektrien osien tallentamisesta asetonin absorptioviivalla on esitetty kuvassa 1. Asetoni voi ilmaantua vereen hiilihydraattiaineenvaihdunnan häiriön yhteydessä. Kuten kirjallisuudessa on todettu, diabeetikkojen veri sisälsi -OH-butyraattia ja asetoasetaattia, mutta myöhemmin nämä aineet hajosivat asetoniksi ja hiilidioksidiksi.18 Hiilidioksidilla ei ole dipolimomenttia; siksi siinä ei ole kiertosiirtymiä. Sen lisääntynyt pitoisuus voidaan havaita vain tutkimalla näytteen värähtelyspektriä IR-alueella.
Plasmahöyryaineita, kuten karbonyylisulfidia (OCS), rikkidioksidia (SO2), muurahaishappoa (HCOOH), isosyaanihappoa (HNCO) ja ammoniakkia (NH3), havaittiin sekä diabeetikoista että ei-diabeettisista ihmisnäytteistä. Joissakin tapauksissa näytteen spektreissä havaitaan yksi koeviiva, joka vastaa useampaa viivaa kuin yksi yhdelle aineelle (esim. isosyaanihapolle) luettelotiedoissa (katso taulukko 2).15,16
Tämä selittyy sillä, että luettelot sisältävät tietoja aineiden hyperhienoista rakenteista, joita ei selvitetä tässä kokeessa, koska viivojen äärellinen leveys on useiden satojen kHz luokkaa. Tutkittujen aineiden saadut absorptioviivat ovat yhtäpitäviä kapillaariveren ja veren höyryjen absorptiospektrien kanssa.veriplasmaadiabetespotilaista ja ehdollisesti terveistä osallistujista, jotka on julkaistu aiemmassa työssämme.19 Havaitut kaasumaiset aineet ovat saattaneet muodostua näytteen valmistuksen aikana aminohappojen kemiallisen muuntumisen tuotteina. Kysymys siitä, ovatko nämä yhdisteet diagnostisia, vaatii tutkimusta. Diabeetologian kliinisessä käytännössä näiden aineiden pitoisuuksien analysointia ei vielä käytetä.
Höyrytveriplasmaaterveistä rotista sisälsi karbonyylisulfidia (OCS), metaanitiolia (CH3SH), butyronitriiliä (C3H7CN), asetaldehydiä (CH3CHO) ja muurahaishappoa (HCOOH). Näyteveriplasmaadiabeettisten rottien kohdalla erosi asetonin läsnäolosta. Propionitriilin (C2H5CN) absorptiolinjojen lisäksi havaittiin metyyliformiaattia (CH3OCHO).
Terveiden ja diabeettisten rottien kuivattujen pellettien höyrynäytteetmunuaiskudoksettutkittiin. HöyrytmunuaiskudostaTerveistä rotista sisältää karbonyylisulfidia (OCS), rikkidioksidia (SO2), muurahaishappoa (HCOOH), isosyaanihappoa (HNCO), etyyliformiaattia (C2H5OCHO) ja propyleeniglykolia (CH2ðOHÞCHðOHÞCH3). Diabeettisen rotan höyrypitoisuusmunuaiskudostaerosi terveestä rotasta karbonyylisulfidin (OCS) lisäksi myös sen isotopologin OCS-34 läsnäolon suhteen. Diabeettisen rotan pelletin höyryistä havaittiin myös asetaldehydiä (CH3CHO), metaanitiolia (CH3SH), etyleenisulfidia (C2H4S), metanolia (CH3OH) ja glykolialdehydiä (CH2ðOHÞCHO).munuaiskudosta(katso kuva 2 ja kuva 3).
Rikkiyhdisteiden, kuten metaanitiolin, läsnäolo voidaan määrittää veren proteiinikoostumuksessa olevien rikkiaminohappojen (metioniini, kysteiini ja kystiini) termisellä hajoamisella. Metioniini on välttämätön aminohappo, jota ei syntetisoidu ihmisorganismeissa. Sitä saadaan ruoasta ja se on rikin lähde kysteiinin biosynteesiä varten. Kun rikkiaminohappoja kuumennettiin noin 240 asteen lämpötiloihin, näiden aineiden massaspektrissä havaittiin metaanitiolia ja eteenisulfidia (metioniinin hajoaminen).
4. Yhteenveto
Ihmisen ja rotan molekyylipitoisuusveriplasmaaja rottamunuaiskudostanäytteiden lämpöhajoamisen aikana tutkittiin käyttämällä THz:n korkearesoluutiospektrometriä. Esitettiin menetelmä biologisten näytteiden valmistamiseksi pelleteiksi. Tämä menetelmä mahdollistaa näytteiden varastoinnin ja kuljetuksen. Korkearesoluutioinen kaasuspektroskopia mahdollistaa minkä tahansa alkuperän monikomponenttisten kaasuseosten sisällön määrittämisen, mukaan lukien biologiset kaasukomponenttien hivenpitoisuuksilla. Diabeetikolla havaittiin asetoniaveriplasmaanäytteet. Tietoa diabeettisen ja terveen sisällön eroistaveriplasmaamiehistä ja rotista ja diabeetikoista ja terveistä rotistamunuaiskudoksetsaatiin höyryjen absorptiokiertospektreistä. THz:n korkearesoluutiospektroskopian käyttö tarjoaa kvalitatiivisen analyysin veri- ja höyrynäytteiden komponenttipitoisuudesta.munuaiskudoksetpelletit. Mahdollisuus suorittaa tärkeiden diabeteksen kaasumerkkiaineiden pitoisuuksien kvantitatiivinen arviointi potilaiden tilasta riippuentulee tutkia lisätutkimuksissa.
