Katepsiini B:n kohdistaminen sykloastragenolilla parantaa CD8 T-solujen kasvainten vastaista immuniteettia MHC-I:n hajoamisen estämisen kautta, osa 1

ABSTRAKTI

TaustaPD-1/PD-L1-reitin aiheuttama kasvainantigeenien häviäminen ja CD8 T-solujen väheneminen ovat tärkeitä tekijöitä kasvaimen immuunivasteen pakoon. Viime vuosina perinteisen kiinalaisen lääketieteen tutkimus kasvainten hoidossa on lisääntynyt. Sykloastragenolilla (CAG), tehokkaalla aktiivisella molekyylillä Astragalus membranaceusissa, on havaittu olevan viruksia estäviä, ikääntymistä estäviä, tulehdusta ehkäiseviä ja muita toimintoja. Sen kasvainten vastainen vaikutus ja mekanismi eivät kuitenkaan ole selvät.

Cistanchen glykosidi voi myös lisätä SOD:n aktiivisuutta sydämen ja maksan kudoksissa ja vähentää merkittävästi lipofussiinin ja MDA:n pitoisuutta kussakin kudoksessa, poistaen tehokkaasti erilaisia ​​reaktiivisia happiradikaaleja (OH-, H2O₂ jne.) ja suojaamalla DNA-vaurioilta. OH-radikaalien toimesta. Cistanche-fenyylietanoidiglykosideilla on vahva vapaita radikaaleja poistava kyky, suurempi pelkistyskyky kuin C-vitamiini, ne parantavat SOD:n aktiivisuutta siittiösuspensiossa, vähentävät MDA-pitoisuutta ja niillä on tietty suojaava vaikutus siittiöiden kalvon toimintaan. Cistanche-polysakkaridit voivat lisätä SOD:n ja GSH-Px:n aktiivisuutta D-galaktoosin aiheuttamien kokeellisesti vanhentuvien hiirten punasoluissa ja keuhkokudoksissa sekä vähentää MDA- ja kollageenipitoisuutta keuhkoissa ja plasmassa sekä lisätä elastiinipitoisuutta. hyvä huuhteluvaikutus DPPH:lle, pidentää hypoksian aikaa vanhenevilla hiirillä, parantaa SOD:n aktiivisuutta seerumissa ja viivyttää keuhkojen fysiologista rappeutumista kokeellisesti vanhenevilla hiirillä Solumorfologisen rappeutumisen yhteydessä kokeet ovat osoittaneet, että Cistanchella on hyvä antioksidanttikyky ja sillä on potentiaalia olla lääke ihon ikääntymisen sairauksien ehkäisyyn ja hoitoon. Samaan aikaan Cistanchen ekinakosidilla on merkittävä kyky poistaa DPPH-vapaita radikaaleja ja sillä on kyky poistaa reaktiivisia happilajeja ja estää vapaiden radikaalien aiheuttamaa kollageenin hajoamista, ja sillä on myös hyvä korjaava vaikutus tymiinin vapaiden radikaalien anionien vaurioihin.

Klikkaa cistanchen plussat ja miinukset

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

menetelmätCAG:n kasvainten vastaista vaikutusta tutkittiin MC38- ja CT26-hiirillä siirretyissä kasvainmalleissa. CAG:n kasvaimia estävää vaikutusta analysoitiin edelleen yksisoluisen multi-omics-sekvensoinnin avulla. CAG:n kohdeproteiinin löytämiseen käytettiin kohderesponsiivista saavutettavuuden profilointitekniikkaa. Myöhemmin CAG:n kasvainten vastaista mekanismia tutkittiin käyttämällä konfokaalimikroskopiaa, immunosaostusta ja mutanttiplasmidien transfektiota. Lopuksi tutkittiin CAG- ja PD-1-vasta-aineiden yhdistettyä kasvaimia estävää vaikutusta hiirissä tai organoideissa.

TuloksetHavaitsimme, että CAG esti tehokkaasti kasvaimen kasvua in vivo. Yksisoluinen multi-omiikka-atlastamme osoitti, että CAG edisti kasvainsolujen pinta-antigeenien esiintymistä ja sille oli tunnusomaista CD8- ja T-solujen lisääntynyt tappamistoiminto. Mekaanisesti CAG sitoutui kohdeproteiiniinsa katepsiini B:hen, joka sitten esti suuren histokompatibiliteettikompleksin I:n (MHC-I) lysosomaalista hajoamista ja edisti MHC-I:n aggregaattia n solukalvoon tehostaen kasvainantigeenin esiasemaa. . Samaan aikaan CAG:n yhdistelmä PD-1-vasta-aineen kanssa tehosti tehokkaasti kasvainta tappavia kasvaimia tappavia CD8- ja T-soluja ksenograftihiirissä ja kolorektaalisyövän organoideissa. Johtopäätös Tietomme raportoivat ensimmäistä kertaa, että katepsiini B:n alasäätely antaa tuumorinvastaisen immuniteetin ja vanhenee luonnollisen CAG-tuotteen kasvainten vastaisen mekanismin.

JOHDANTO

Kolorektaalisyöpä on yksi yleisimmistä syövistä maailmanlaajuisesti. Sen ilmaantuvuus ja kuolleisuus ovat kolmen suurimman joukossa, mikä uhkaa vakavasti ihmisten elämää ja terveyttä.1 Yleisiä hoitomenetelmiä ovat kirurginen kemoterapia ja sädehoito, kohdennetut lääkkeet ja immunoterapia.2–4 Syöpäsoluissa kuitenkin yleensä katoavat pinta-antigeenit ja ne ilmentyvät. korkeita estomolekyylejä välttääkseen immuunisolujen valvonnan. Tämän vuoksi tutkijat ovat kehittäneet immuunivasteen estäjiä ja neoantigeenihoitoa syöpäsolujen peittäytymisen estämiseksi immuunivasteen estämisongelman ratkaisemiseksi. 5–8 Vaikka immuunivasteen estäjät voivat palauttaa köyhdytetyt immuunisolut, syövän pinta-antigeenin. soluja ei ole imved merkittävästi. Siksi on erityisen tärkeää löytää lääkkeitä, jotka voivat edistää kasvaimen pinta-antigeenien esiintymistä. Sytotoksisten CD8 plus T-solujen syöpäsolujen tunnistaminen riippuu TCR/CD3/major histocompatibility complex (MHC-I) -reitistä. TCR vastaanottaa dendriittisolun/syöpäsolukalvon proteiinin CI sisältämän antigeenin ja lähettää signaalin tiiviisti yhdistämään CD3:n, joka sitten ulottuu sytoplasmaan.9 10 Samaan aikaan CD28/B7-signaalin aktivoituessa CD8 plus T-solut voidaan aktivoida yhdessä syöpäsolujen tunnistamiseksi ja tappamiseksi.11 Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvaimen etenemisprosessissa lysosomit vähentävät MHC-I-aggregaatiota syöpäsolujen pinnalla, mikä ei vaikuta tehokkaasti. läsnä antigeenejä.{16}} Liu ym. raportoivat, että PCSK9:n esto voi estää MHC-I:n hajoamisen lysosomeissa ja mahdollistaa MHC-I:n palaamisen solukalvoon esittelemään antigeenejä.12 Siksi antigeenin esittelytoiminnon palauttaminen MHC-I on erityisen tärkeä tuumorin immuunipaon estämisessä.

Yhä useammat tutkimukset ovat osoittaneet, että perinteisen kiinalaisen lääketieteen aktiivisten molekyylien käytöllä kasvainten vastaisessa interventiossa on suuria mahdollisuuksia.{0}} Cycloastragenol (CAG) on tehokas aktiivinen molekyyli n Astragalus membranaceus, jolla on antiviraalinen, antibakteerinen ja anti- tulehduksellisia ja muita farmakologisia vaikutuksia, mutta sen kasvaimia estävä vaikutus on raportoitu harvoin.16–19 Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CAG esti paksusuolensyöpäkasvainten transtuneiden kasvainten kasvua. katepsiini B (CTSB), edistää syöpäsolujen antigeenin esittelyä ja sitten parantaa CD8- ja T-solujen tappamiskykyä.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

Vasta-aineet ja reagenssit

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 prosenttia). CTSB:n (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA:n (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426 ), aktiinin (Cat#{{) vasta-aineet 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), tubuliini (Cat#10094-1-AP, PRID: AB_2210695 ) ja Anti-hiiri/kani Immunohistochemistry Detection Kit (Cat#PK10006) ostettiin Proteintechiltä. H2-Kd:n (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1:n (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853) vasta-aineet, ja CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) ostettiin Santa Cruz Biotechnologylta. Vasta-aine of Ki-67 (Cat#12202, PRID: AB_2620142 ) ostettiin Cell Signaling Technologylta. Na/K ATPaasin vasta-aine (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) ostettiin Abcamilta. Virtaussytometrian vasta-aineet CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) ja CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) ostettiin BD Biosciencelta. Gzmb-FITC:n (Cat# 515403, RRID: AB_2114575) virtaussytometrinen vasta-aine ostettiin BioLegendiltä. NK1:n.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) ja IFN- -PE (Cat#12-7311-81, RRID) virtaussytometriset vasta-aineet :AB_466192) ostettiin Thermo Fisher Scientificilta. DMEM-elatusaine (Cat#01-052-1ACS), PenicilinStreptomycin (Cat#15140122) ja Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) ostettiin Biological Industriesilta. Vuohen seerumi (Cat#88RNG001) ja Pierce BCA -proteiinimäärityspakkaus (Cat#23225) ostettiin Thermo Fisher Scientificilta. Ihmisen PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) ja anti-hiiri-PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) vasta-aineet ostettiin Bio X cellilta. MACS Tumor Tissue Dissociation Kit (Cat#130-095-929) ostettiin Miltenyi Biotecilta.

Soluviljely

Hiiren paksusuolensyöpäsolulinjoja MC38 ja CT26 ylläpidettiin laboratoriossamme.20 Ihmisen paksusuolensyövän l-linjat HCT-116 saatiin Kiinan tiedeakatemian tyyppikulttuurikokoelmasta (Shanghai, Kiina). MC38-, CT26- ja HCT{6}}-soluja viljeltiin DMEM-elatusaineessa, joka sisälsi 10 prosenttia naudan sikiön seerumia ja 1 prosenttia penisilliiniä/streptomysiiniä 37 asteessa 5 prosentin CO2-inkubaattorissa.

Transplantaatiokasvainkoe

Kuuden kahdeksan viikon ikäiset naaraspuoliset C57BL/6JGpt-hiiret, BALB/c-hiiret ja BALB/,c-nude-hiiret ostettiin GemPharmatechilta (Nanjing, Kiina). MC38- tai CT26-syöpäsoluja (1 x 106) siirrostettiin ihonalaisesti jokaiseen hiireen. Kun kasvain kasvoi 100 mm3:ksi, mikrofoni jaettiin satunnaisesti fosfaattipuskuroituun suolaliuosryhmään (PBS) (esim. kerran päivässä) ja CAG-ryhmään (esim. 50 mg/kg kerran päivässä). Kasvaintilavuudet määritettiin paksuusmittauksella käyttämällä kaavaa V=pituus × leveys2 /2. Kun PBS-ryhmän hiirten kasvaintilavuus saavutti 1 000 mm3, hiirten kasvain otettiin pois, valokuvattiin ja punnittiin.

Yksisoluinen dissosiaatio hiirestä yksisoluiselle RNA:lle/ATACseq

Hiirten kiinteät kasvaimet pilkottiin käyttämällä Tumor Dissociation Kit -pakkausta yksisoluisten yksittäissolujen saamiseksi. Single celSingle-cell s, joiden pitoisuus on 1000 solua/1000 solua ladattu 10×genomics kromiohjaimeen yksisoluinen yksisoluinen 10×genomics-valmistajan protokollan mukaisesti. Käänteistranskriptioreagenssit, viivakoodatut geelihelmet ja partitioöljy sekoitettiin solujen kanssa geeniä varten geelihelmien muodostamiseksi emulsioissa (GEM) käänteistranskriptiota varten. scRNA-seq tietojen esikäsittely ja qua y valvonta.

Perustuu hiiren referenssigenomiin GRCm38 (mm10), CellRanger V.4.0.0 liukuhihna (10×Genomics) käsittelemään yksisoluisen RNA:n sekvenssitiedot jokaiselle kokeelle (GSE197229). Digitaaliset geeniekspressiomatriisit zedattiin R:ssä (V.4.0.4) käyttämällä Seurat (V.4.0.0) -pakettia.21 Ennen dBeforem-analyysiä solut suodatettiin UMI-numerolla (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq tietojen esikäsittely ja laadunvalvonta

Yksisoluiset ATAC-seq-tiedot (GSE197229) esikäsitteli solu ranger-at (V.2.0.0) count-komentorivillä. Käytimme myöhempään scATAC-seq-tietojen käsittelyyn ja analysointiin ArchR (V.1.0.1)-pakettia.24 Sitten käytimme addArchRGethe nome ('mm10') -funktiota genomin annotaatioon ja loimme arrow-tiedosto cre ArrowFiles-funktiolla oletusparametreilla. Seuraavaksi käytimme filterDoublets-toimintoa mahdollisten doublettien poistamiseen ja loimme ArchR-projektin käyttämällä ArchRProject-funktiota oletusparametreilla. Sitten käytimme Harmony-pakettia erävaikutuksen poistamiseen addHarmony-funktiolla.25 Mittasuhteiden vähentämiseksi käytämme ArchR:n addIterativeLSI-funktiota suorittamaan def t -parametreja. Yksisoluista upotusta varten valitsimmeredDims-objektin harmonisesti ja käytimme visualisointiin addTSNE-funktiota parametrin 'perplexity=30' kanssa.

Integroitu siRNA-seq- ja scATAC-seq-tietojen analyysi

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Ennusteiden tarkkuuden parantamiseksi kahden tietojoukon integroimiseksi paremmin integroimme scATAC-seq- ja scRNA-seq-tiedot käyttämällä "rajoitettu integrointi" -tilaa. Lyhyesti, merkitsimme scATAC-seq-dataa solutyypeillä scATAC-seq:n geenipisteiden perusteella. Sitten loimme rajoitetun luettelon siten, että geeniekspression samankaltaisuus laskettiin vain samassa solutyypissä sekä scATAC-seq:lle että scRNA-sekvenssille. Valvomaton klusterointi t-SNE:n kanssa paljasti 13 alasoluklusteria, jotka merkittiin tunnetuilla tai oletetuilla markkereilla online-lisätaulukossa 1.

Pseudoajan linjan liikerata

Syöpäsolujen solulinjan liikerata pääteltiin käyttämällä Monocle2 (V.2.18.0) R-pakettia.26 Monosyytit oppivat eksplisiittisen pääkaavion yksisoluisten genomiikkatiedoista Reversed Graph Embedding -menetelmällä solujen lajittelemiseksi, mikä ratkaisee monimutkaisen biologisia prosesseja vankasti ja tarkasti.27 Käytimme ''differentialGeneTest''-funktiota DEG:n johtamiseen kustakin klusterista, ja soluradan rakentamisen jälkeen havaitsimme differentiaalisesti ilmentyneet geenit pseudoajassa. Kaikki pseudoajasta riippuvat geenit visualisoitiin plot_pseudotime_heatmap-funktiolla, joka otti CellDataSet-objektin. CellDataSetiin perustuvat linjan liikeratakuvaajat ja sileät ilmentymiskäyrät luotiin plot_cell_trajectory ja plot{13}}geeneillä_pseudo-ajassa, vastaavasti.28

Yksisoluinen kopionumeron vaihtelusoitto

Tunnistaaksemme pahanlaatuisia soluja, joilla on klonaalisia laajamittaisia ​​kromosomaalisten kopiolukujen variaatioita (CNV), käytimme inferCNV R -pakettia päättelemään kunkin solun geneettiset profiilit suurten geenijoukkojen keskimääräisen ilmentymisen perusteella kasvaingenomin kullakin kromosomaalisella alueella verrattuna normaalit solut.29 Näytekohtaisesti immuunisoluja käytettiin viitteenä arvioitaessa CNV:itä syöpään liittyvissä soluissa.

Rikastusanalyysi

KEGG-polun ja GO-merkintöjen analyysit suoritettiin käyttämällä R-pakettia clusterProfiler (V.3.11.1) parametreilla PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 ja MaxGSSize=500.20Gene set richment analysis (GSEA) käytettiin käyttämällä 50 tunnusmerkkigeenisarjaa (h.all.V.7.4.symbols. gmt) merkittävästi rikastuneiden tunnistamiseksi. toiminnalliset reitit GSEA-ohjelmiston (V.4.1.0) kautta, ja seulontakriteerit nimellis P-arvo<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi

MC38- ja HCT-116-soluja ympättiin kuusikuoppaisille levyille 6 tunnin ajan ja sitten niitä käsiteltiin CAG:lla vielä 24 tuntia. Solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS:llä ja sentrifugoitiin 180g 5 minuuttia 4 asteessa. Samaan aikaan kasvainkudoksen hiomisen jälkeen. Kokonais-RNA uutettiin MC38-, HCT-116-soluista ja kasvainkudoksesta käyttämällä TRIzol-reagenssia valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktiotilavuus oli 20 µl, joka sisälsi: 1 µg RNA:ta, 5 µl 5×Hiscript III qRT SuperMixiä ja RNaasivapaata dH20:ta. cDNA:lle tehtiin kvantitatiivinen PCR, reaktiotilavuus 10 µl 1 µl:lla cDNA:ta, 5 µl qPCR 5 µl qP7 s-seosta. (Forward and Reverse) ja 3,25 ui RNaasi-vapaata dH20:ta. GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Kiina) syntetisoi alukkeet seuraavien sekvenssien mukaisesti (online-lisätaulukko 2).

Kohteen löytäminen kohderesponsiivisen esteettömyysprofiloinnin avulla

CAG:tä sitovien proteiinien seulonta suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla.{1}} Lyhyesti sanottuna kohde-responsive Accessibility Profiling (TRAP) -lähestymistapaa käytettiin CAG:tä sitovien proteiinien löytämiseksi solumiljööstä seuraamalla ligandin sitoutumisen aiheuttamaa lysiiniä. saavutettavuus muuttuu proteomitasolla. Lyhyesti sanottuna kahta solumaljaa käsiteltiin vastaavasti 10µM CAG:lla ja dimetyylisulfoksidilla (DMSO). 1-tunnin inkubaation jälkeen solut läpäistiin M-PER-puskurilla (Thermo Scientific) ja saadut lysaatit leimattiin kovalenttisesti lisäämällä formaldehydi- ja boraanipyridiinikompleksia, jotka yhdessä leimaavat spesifisesti proteiinipitoisia lysiinijäännöksiä huoneenlämpötilassa saavutettavuuden profilointia varten. . Sitten lysaatit saostettiin orgaanisella liuottimella ja kerätyt pelletit liuotettiin uudelleen 8 mol/l ureaan, pelkistettiin ditiotreitolilla (DTT) 56 asteessa 30 minuutin ajan, mitä seurasi alkylointi käyttämällä jodiasetamidia (IAA) pimeässä 30 minuutin ajan. Sopiva määrä DTT-liuosta lisättiin jälleen reagoimaan IAA-ylimäärän kanssa. Sen jälkeen proteomi laimennettiin ammoniumbikarbonaattiliuoksella, kunnes urean lopullinen konsentraatio saavutti 1 mol/l. Kerätyistä proteiinihapoista poistettiin suola C18 HLB -pylväissä (Waters, Milford, Massachusetts, USA), ja rikastetut peptidit kuivattiin ja rekonstituoitiin 0,1-prosenttiseen muurahaishapon (FA) vesiliuokseen. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF -järjestelmää (Waters) käytettiin näytteiden analysointiin lysiinin saavutettavuuden muutosten kvantitatiivista profilointia varten vasteena CAG-sitoutumiseen kohteen löytämiseksi. Tiedonkeruussa käytettiin datariippuvuuden hankintaa positiivisessa tilassa. Data-analyysi suoritettiin käyttäen PEAKS Studio V.8.5:tä (BSI Solutions, Waterloo, Kanada). Tarkemmin sanottuna cys-alkylointi valittiin kiinteäksi modifikaatioksi ja metioniinin hapetus ja lysiinin dimetylaatio, jotka saavutettiin TRAP-leimauksella, asetettiin muuttuviksi modifikaatioiksi. Lyhyesti sanottuna peptidit, jotka sisältävät TRAP-indusoitua dimetylaatiota ja osoittivat merkittäviä runsausmuutoksia CAG-inkuboinnin kanssa ja ilman sitä, määritettiin kohderesponsiivisiksi peptideiksi. Kunkin TRAP-leimatun peptidin runsauden suhde osoittaa saavutettavuuden muutoksen laajuuden ja liittyy läheisesti ligandia sitovaan affiniteettiin. Studentin t-testillä arvioitiin, ovatko havaitut leimattujen peptidien saavutettavuuden muutokset tilastollisesti merkittäviä. Ryhmien välinen p-arvo (s<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoidiviljely

Ihmisen paksusuolensyövän organoidit rakensi ja viljeli Chongqing Kingbiotech.33 Leikkauksella saadut potilaan kudosnäytteet jauhettiin mahdollisimman pieniksi paloiksi steriileillä saksilla. Kudospalat sekoitettiin perusteellisesti Matrigelin kanssa (Corning, luettelonro 356231) likimääräisessä suhteessa 1:4 jäillä. Myöhempi käsittely viittasi julkaistuihin protokolliin. Lyhyesti sanottuna palaset-Matrigel-suspensiot kylvettiin nopeasti monikuoppalevyyn puolipallon muotoisten pisaroiden muodostamiseksi ja siirrettiin 37 asteeseen 15–20 minuutiksi, jolloin pisarat jähmettyivät. Lisättiin sopiva määrä viljelyalustaa (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​kuhunkin kuoppaan ja vaihdettiin alusta 2–4 ​​päivän välein.

Ihmisen CD8 T-solujen eristäminen ja viljely

Lisää sama määrä normaalia suolaliuosta terveiden ihmisten perifeeriseen vereen, joka sisältää antikoagulantteja kokoveren laimentamiseksi. Lisää tietty tilavuus erotusliuosta 15 ml:n sentrifugiputkeen, lisää hitaasti laimennettu kokoveri putken seinämää pitkin erotusliuoksen yläosaan ja sentrifugoi 750 g:llä 20 minuuttia. Ime sentrifugoinnin jälkeen pipetillä varovasti keskivalkoisen kerroksen monosyytit 15 ml:n sentrifugiputkeen, lisää tietty tilavuus PBS:ää uudelleensuspendoimiseksi, sentrifugoi 250 g 5 minuuttia ja hävitä supernatantti. Sen jälkeen kun solusaostumiin oli lisätty ihmisen CD8-magneettihelmiä, CD8-T-solut lajiteltiin LS-lajittelukolonnissa. CD8 T-soluja lisättiin rei'itetylle levylle, joka oli esipäällystetty 5 µg/ml CD3-vasta-aineella (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) ja sitten 10 ng/ml IL{15} } (Peprotech Cat# 212-12) ja 5 µg/ml CD28:a (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) toiminnallisia vasta-aineita lisättiin viljeltynä 24 tuntia.

Kokulttuuri

Kun organoideja oli inkuboitu CAG:n kanssa 24 tuntia, tuore viljelyalusta korvattiin ja sitten organoidit ja aktivoidut CD8 T-solut suspendoitiin matriisigeeliin, sitten suspensio lisättiin kuusikuoppaiselle levylle ja asetettiin 37 asteen inkubaattorissa 15 minuuttia, ja sitten lisättiin 2 ml seerumivapaata täydellistä elatusainetta 24 tunnin ajaksi.

Western blot

MC38- ja HCT-116-soluja ympättiin kuusikuoppaisille levyille 6 tunnin ajan ja sitten niitä käsiteltiin CAG:lla vielä 24 tuntia. Solut pestiin kolme kertaa kylmällä PBS:llä ja sentrifugoitiin 180 g:ssä 5 minuuttia 4 asteessa. Kokonaisproteiini hajotettiin WB-IP-lyysillä, joka sisälsi 1 % proteaasi-inhibiittoria 30 minuutin ajan jäillä. Kokonaisproteiini arvioitiin käyttämällä BCA-proteiinin kvantitointipakkausta. Proteiininäytteet erotettiin 10-12-prosenttisella SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (polyvinylideenifluoridi) 350 mA:lla 90 minuutiksi. PVDF-kalvot estettiin 5-prosenttisella BSA:lla 1 tunnin ajan, liuskoja osoitetulla primaarisella vasta-aineella yön yli ja sekundaarista vasta-ainetta inkuboitiin 90 minuuttia huoneenlämpötilassa. Lopuksi nauhat havaittiin käyttämällä LumiGLO-kemiluminoivaa substraattijärjestelmää (KPL, Gaithersburg, Maryland, USA).

Virtaussytometria

Kasvainkudoksen pilkkomisen jälkeen valmistettiin yksisoluinen suspensio. Pintavärjäys suoritettiin pinta-antigeenivasta-aineilla FCM (Flow Cytometry) -puskurissa (PBS, joka sisälsi 1 % FBS:ää) ja värjättiin jäillä sopivilla vasta-aineilla 30 minuutin ajan. Reaktiivisia väriaineita (eBioscience) käytettiin kuolleiden solujen poistamiseen. Solunsisäinen sytokiinivärjäys suoritettiin BD-solukiinnitysliuoksella/sellulaarisen kalvon liuoksella, ja solut kiinnitettiin ja läpäistiin, ja sitten värjättiin vasta-aineilla sytokiineja vastaan ​​Perm/Wash-puskurissa (BD Biosciences).

CTSB-mutanttiplasmidit transfektoituja

HCT-116-soluja kylvettiin 6-kuoppalevyille 12 tunnin ajan ja sitten transfektoitiin CTSB-WT-EGFP- tai CTSB-mutanttiplasmideilla (Y75A, A77V ja G198A) 36 tunnin ajan.

CTSB:n transfektiohäiriö tai yli-ilmentymisplasmidi MC38-soluihin tai HCT-116-soluihin

MC38-soluja (1 × 106/kuoppa) siirrostettiin 6-kuoppalevyille 6 tunnin ajan, sitten transfektoitiin CTSB:tä häiritsevällä RNA:lla (sekvenssi: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT ja Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) 48 tunnin ajan ja mRNA- tai proteiinitasot. Ctsb ja H2-k1 havaittiin. HCT-116-soluja (1 × 106 /kuoppa) siirrostettiin 6-kuoppalevyille 6 tunnin ajan, sitten transfektoitiin CTSB-interferenssillä (sekvenssi: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) tai yli-ilmentymisplasmidilla 48 tunnin ajan ja mRNA:lla. tai CTSB:n ja HLA-A:n proteiinin ilmentymistasot havaittiin.

Telakointitekniikka

CTSB:n 3D-rakenne ladattiin Protein Database -tietokannasta (PDB ID: 2iPP) ja CAG:n rakenteet PubChemistä. Telakointiprosessi suoritettiin Autodock 2:ssa karkealla telakalla käyttämällä simuloitua hehkutusalgoritmia ja myöhempää tarkennusta käyttämällä geneettistä algoritmia.

Solujen lämpösiirtymämääritys

MC38-solut kylvettiin 10 cm:n levyille yön yli ja käsiteltiin sitten CAG:lla tai 0,1 prosentilla DMSO:lla vielä 2 tuntia. Solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS:llä ja sentrifugoitiin 180 g:ssä 5 minuuttia. Sitten solut jaettiin tasaisesti sentrifugointiputkiin (70 µl kukin putki) ja kuumennettiin 3 minuuttia seuraavassa lämpötilassa: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 ja 67 astetta, näytteitä jäähdytettiin 3 minuuttia lämpötiloissa ja sitten pidettiin jäillä. Sitten näytteet laitettiin jääkaappiin -80 asteeseen yön yli. Näytteitä sulatettiin huoneenlämmössä 30 minuuttia ja sitten jäähdytettiin -80 asteessa 4 tuntia. Lopuksi näytteet sentrifugoitiin 12, 000g 25 minuuttia, supernatantti lisättiin latauspuskuriin ja analysoitiin Western blot -menetelmällä.

Immunohistokemiallinen värjäys

Kasvainkudoksen parafiinileikkeet upotettiin ksyleeniin 20 minuutiksi vahan poistamiseksi ja sitten 100-prosenttiseen, 75-prosenttiseen ja 50-prosenttiseen etanoliin 10 minuutiksi. Sen jälkeen kun viipaleille tehtiin antigeenikorjaus natriumsitraattiantigeenin korjausliuoksella, endogeeninen vetyperoksidi inaktivoitiin 3-prosenttisella vetyperoksidilla. Kun oli blokattu 5 % vuohen seerumilla 1 tunnin ajan, anti-Ki67-vasta-aine (1:200) lisättiin ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa. Lisättiin anti-hiiri/kani HRP-leimattua polymeeriä (100 ui) ja näytteitä inkuboitiin 37 asteessa 30 minuuttia, mitä seurasi 100 ui DAB-työliuosta ja inkubointi huoneenlämpötilassa 5 minuuttia. 1 minuutin hematoksyliinivärjäyksen jälkeen näytteet pestiin 50-, 75- ja 100-prosenttisessa etanolissa ja ksyleenissä 5 minuutin ajan, ja kalvon sulkemiseen käytettiin neutraalia kumia. Filmiä tarkkailtiin ja kuvattiin mikroskoopilla.

Tilastollinenanalyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin GraphPad Prism -ohjelmistolla (V.8.0). Kaikki tulokset ilmaistaan ​​kolmen riippumattoman kokeen keskiarvona ± SEM. Erojen arvioimiseen käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Dunnettin post hoc -testi, kun ryhmiä oli enemmän kuin kaksi. Kahden ryhmän välisen merkitsevän eron arvioimiseen käytettiin Studentin t-testiä. Tilastollinen merkitsevyys asetettiin p<0.05.

TULOKSET

CAG:n yksisoluinen multiomiikka-analyysi, joka estää siirretyn paksusuolensyövän kasvua hiirillä

Tutkiaksemme, onko CAG:lla kasvainten vastaista vaikutusta, siirsimme ensin MC38-syöpäsoluja C57BL/6-hiiriin. Huomasimme, että CAG esti merkittävästi kasvainten kasvua (online-lisäkuva S1A, B). Myöhemmin siirsimme CT26-soluja BALB/c-hiiriin ja havaitsimme, että CAG esti myös kasvainten kasvua (online-lisäkuva S1C, D).

Jotta voitaisiin edelleen paljastaa spesifinen mekanismi, jolla CAG estää kasvaimen kasvua, analysoimme sen käyttämällä scRNA-seq- ja scATAC-seq-tekniikoita (kuva 1A). Jaoimme solupopulaation neljään ryhmään: syöpäsolut, fibroblastit, myeloidisolut ja lymfosyytit (kuva 1B, online-lisäkuva S2A, B). Havaitsimme, että syöpäsolut (52 prosenttia) ja fibroblastit (41 prosenttia) infiltroituivat pääasiassa kasvainkudoksiin, kun taas immuunisolujen osuus oli vain 7 prosenttia. Sitten jaoimme syöpäsolut kahdeksaan alaryhmään ja fibroblastit kolmeen alaryhmään (kuva 1C – E). Myöhemmin kunkin solupopulaation voimakkaasti ilmentyneiden geenien rikastusanalyysi osoitti, että MHC-I-molekyylireitit syöpäsoluissa rikastuivat, samoin kuin T-solujen ja NK-solujen antituumorisignaalit (online-lisäkuva S2C). Sitten löydettiin myös neljä soluryhmää käyttämällä scATAC-seq- ja scRNA-seq-integraatioanalyysiä (kuva 2D-G). Vertailun jälkeen havaitsimme, että syöpäsolut (C01, C03-solut), CD8 plus T-solut, Spp1 plus TAM-solut ja fibroblastit (F01- ja F02-solut) esiintyivät ATAC-sekvensoinnissa (kuva 1F, G) ja lisäksi erittäin ekspressoituneita. transkriptiotekijät rikastuivat näissä soluissa (kuvio 1H). Näiden analyysien avulla spekuloimme, että CAG:n aiheuttama kasvaimen kasvun esto liittyy läheisesti muutoksiin näissä soluissa.

Cag edistää kasvainsoluantigeenin esittelyä

CAG:n kasvainten vastaisen mekanismin analysoimiseksi analysoimme ensin kasvainsolupopulaation ja jakoimme syöpäsolut kahdeksaan alaryhmään (kuva 2A, B, online-lisäkuva S3A). Tulokset osoittivat, että verrattuna PBS-ryhmään C05-ryhmän solut vähenivät merkittävästi, kun taas C07-ryhmän solut lisääntyivät (kuvio 2C). Sillä välin vahvistaaksemme kasvainsoluklusteroituksemme tarkkuutta, vertasimme lymfosyyttien ja myeloidisolujen CNV:tä ​​vertailusoluina. Tulokset osoittivat, että syöpäsolujen CNV oli merkittävästi korkeampi kuin immuunisolujen (online-lisäkuva S3B). Analysoidessamme syöpäsolujen alaryhmiä havaitsimme, että interferonivastegeenit Isg15, Irf7, Ifit3 ja Ifi47 ilmentyivät voimakkaasti CAG-ryhmän C07- ja C08-solupopulaatioissa verrattuna PBS-ryhmään (online-lisäkuva S3C). Kasvainsolupopulaation analyysi havaitsi, että antigeenin esittelyyn liittyvät reitit rikastuivat merkittävästi useissa solupopulaatioissa. Siksi spekuloimme, että CAG voi edistää syöpäsolujen antigeenin esittelyä toimimaan kasvainten vastaisessa roolissa (kuva 2D). Sitten valitsimme antigeenin esittelyyn liittyvät geenit ja havaitsimme, että ekspressiotaso CAG-ryhmässä oli merkittävästi korkeampi kuin PBS-ryhmässä (kuva 2E, online-lisäkuva S3D). Havaitsimme myös, että CAG edisti antigeenin esittelyä kasvainkudoksissa (kuvio 2F, G).

Seuraavaksi käytimme scATAC-seq:iä analysoimaan erityisiä syitä CAG:ta edistävän kasvainsoluantigeenin esittelyyn. Havaitsimme, että kasvainsolupopulaatio ilmensi voimakkaasti transkriptiotekijöitä Fos, Junb, Jund, Fosb ja Fosl1 (kuvio 2H, I). Myöhemmin rakensimme kartan transkriptiotekijöiden ja vastaavien geenien välisestä vuorovaikutuksesta selittääksemme, että CAG edisti kasvainsolujen antigeenia esittelevien geenien ilmentymistä (kuvio 2J). Kasvainkudoksissa havaitsimme myös, että transkriptiotekijät Junb, Fos, Jund ja Fosb olivat merkittävästi yli-ilmentyneitä PBS-ryhmässä CAG-hoidon aikana (kuva 2K–N, online-lisäkuva S3E-I). Toistaiseksi olemme havainneet, että CAG voi edistää antigeenia esittelevien geenien transkriptiotekijöiden ilmentymistä, mikä tehostaa syöpäsolujen antigeenia esittelevää toimintaa. Kuitenkin, kuinka nämä syöpäsolut reagoivat immuunisoluvasteisiin, on edelleen epäselvää.

Selvittääksemme ilmiön, jolla CAG edistää syöpäsolujen antigeenin esiintymistä, suoritimme liikerata-analyysin tutkiaksemme, kuinka syöpäsolut muuttavat toisiaan vasteena immuunisoluvasteisiin. Havaitsimme, että ajan myötä C07-syöpäsolut transformoituivat C05-, C06- ja C08-soluiksi, ja geenirikastus osoitti myös, että syöpäsolut muuttuvat antigeenin esittelyyn (kuva 3A–E).

CAG tehostaa immuunisolujen tappavaa toimintaa

Nämä tulokset osoittavat, että CAG voi esitellä kasvainsoluantigeenejä, joten johtaako kasvainsolujen antigeenin esittelyn tehostaminen immuunisolujen toiminnan paranemiseen? Tämän selvittämiseksi analysoimme lymfosyyttejä ja myeloidisoluja. Tulokset osoittivat, että CAG edisti CD8 plus T-solujen tunkeutumista kasvainkudoksiin, ja CD8 plus T-solujen ja NK-solujen infiltraatio myös lisääntyi, mikä havaittiin virtaussytometrialla (online-lisäkuva S4A-F). Havaitsimme myös, että CAG tehosti Ifitm2-, Cxcr6- ja S100a6-geenien ilmentymistä CD8 plus T-soluissa,

Fcer1g-, Gzmb-, AW112010- ja Zfp36i2-geenit NK-soluissa ja Nfkbia- ja Junb-geenit CD4- ja T-soluissa (online-lisäkuva S4G). Ifng:n ja Gzmb:n ilmentyminen CD8 plus T-soluissa parani myös merkittävästi, mikä havaittiin virtaussytometrialla (online-lisäkuva S4H, I). Lisäksi havaitsimme, että CAG-hoidon jälkeen inhiboivien reseptorien Lag3, Tigit ja Havcr2 ilmentyminen CD8 plus T-solujen pinnalla väheni ja Cd28-, Cd69-, Gzmk-, Ccl5- ja Pdcd1-geenien ilmentyminen, mikä luonnehtii CD8 plus T-solujen aktivaatio lisääntyi merkittävästi (online-lisäkuva S4J). Varmistaaksemme edelleen, että CAG tehosti CD8- ja T-solujen tappamistoimintoa edistämällä tehostunutta kasvainantigeenin esittelyä, siirsimme CT26-soluja siirrettyihin kasvaimiin karvattomissa hiirissä ja havaitsimme, että CAG ei pystynyt estämään tehokkaasti kasvainten kasvua (online-lisäkuva S4K-M ).

Tämän jälkeen analysoimme myeloidisoluja ja havaitsimme, että Spp1 plus TAM-solut lisääntyivät CAG-hoidon jälkeen, kun taas C1qc plus TAM -solujen määrä väheni ja Il1b plus monosyyttien määrä lisääntyi (online-lisäkuva S5A-D). CAG-hoidon jälkeen Spp1 plus TAM- ja C1qc plus TAM-solut olivat alttiimpia tulehdusta edistävälle TAM-transformaatiolle. Rikastusanalyysissä havaittiin, että se keskittyi pääasiassa Tnf-, Ifn-g:hen ja tulehdusvasteen signalointireittiin (online-lisäkuva S5E-H). Edellä mainittujen tulosten perusteella päättelemme, että CAG tehostaa immuunisolujen tunnistamista ja tappamista edistämällä antigeenin esittelyä syöpäsoluissa. Kuitenkin, kuinka CAG:tä säännellään, ei ole selvää.

CAG-kohdeproteiinin CTSB löytäminen ansalla

Seuraavaksi tutkimme spesifistä CAG-kohdeproteiinia, jolla on kasvainten vastainen rooli. Valitsimme tutkimuskohteeksi syöpäsolut, koska havaitsimme, että CAG voi tehostaa syöpäsolujen antigeenin esittelyä ja siten tehostaa immuunisolujen tappavaa toimintaa. Syntetisoimme ensin CAG:n biotiinijohdannaisen ja havaitsimme, että vain 3-OH pystyi reagoimaan (online-lisäkuva S6A). Sitten tutkimme, edistääkö CAG-biotiini myös antigeenin esittelyyn liittyvien geenien ilmentymistä hiiren MC38-kasvainsolulinjassa. Tulokset osoittavat, että CAG-biotiini ei vaikuttanut H2-K1-, Cd74- ja Anxa1-geenien ilmentymiseen (online-lisäkuva S6B-D).

Siksi käytimme laboratoriossa aikaisempaa TRAP-kohteenhakumenetelmää.32 CAG:ta ja DMSO:ta inkuboitiin molempia MC38-solulinjan kanssa (kuva 4A). Valitsimme CAG:n kohdeproteiiniehdokkaaksi proteiinin, jonka FC on suurempi tai yhtä suuri kuin 2 ja ap pienempi tai yhtä suuri kuin 0,05. Noudattaen periaatetta, jonka mukaan pienten molekyylien sitoutuminen proteiineihin johtaa lysiinin alhaiseen leimaustehokkuuteen, valitsimme tutkimukseen CTSB:n (kuva 4B). Seuraavaksi käytimme solun lämpösiirtymämääritystä (kuva 4C) ja mikromittakaavan termoforeesia (MST) (kuva 4D) varmistaaksemme CAG:n ja CTSB:n välisen sitoutumisen ja havaitsimme, että CAG:n ja CTSB:n välinen affiniteetti oli 26,6 nM (kuva 4D). Sen jälkeen ennustimme sitoutumiskohdat CAG:n ja CTSB:n välillä CTSB:n proteiinikiderakenteen mukaisesti PDB-kirjastossa. Havaitsimme, että CAG:n molemmissa päissä olevat hydroksyyliryhmät ja CTSB:n ALA77- ja GLY198-kohdat sidottiin vetysidoksella, kun taas CAG:n ja CTSB:n TYR75-, PRO76- ja ALA173-kohdat sidottiin van der Waalsin voimalla (kuva 4E) . CAG:n ja CTSB:n välisen sitoutumiskohdan tarkistamiseksi transfektoimme CTSB:n mutanttiplasmidin HCT-116-soluissa. Tulokset osoittavat, että A77V:n ja G198A:n ja CAG:n mutanttiplasmidin välinen affiniteetti oli satoja kertoja suurempi kuin WT-plasmidin (kuvio 4F, G). Seuraavassa osiossa tutkimme erityistä mekanismia, jolla CAG:lla on kasvainten vastainen rooli CTSB:n kautta.

【Lisätietoja:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】