Abstrakti

Ihon hyperpigmentaatiohäiriöt, kuten melasma, pisamia ja tulehdusten jälkeinen hyperpigmentaatio (PIH), laukaisevat usein ultravioletti-B (UVB) -säteilyn, ihovaurion ja paikallisen ihotulehduksen. Melaniinin liiallinen kertymä heikentää ihon ulkonäköä ja vaikuttaa negatiivisesti potilaan psyykkiseen hyvinvointiin. Perinteiset pigmenttiä poistavat aineet, kuten hydrokinoni, kohdistuvat ensisijaisesti yksimuotoiseen tyrosinaasiin ja sisältävät hyvin dokumentoituja turvallisuusriskejä. Monikäyttöiset luonnolliset kasvitieteelliset sekoitukset ovat tulleet lupaaviksi vaihtoehdoiksi nykyaikaiselle toiminnalliselle kosmeettiselle formulaatiolle.

Fenyylietanoidiglykosidit (PhG) ovat tunnusomaisia ​​bioaktiivisia ainesosia, jotka on eristettyCistanche deserticola, tunnettu lääkeyrtti kuivilta aavikoilta. Glabridiini (Gla), prenyloitu isoflavaani, joka on uutettuGlycyrrhiza glabra, tunnetaan laajalti voimakkaana ihoa kirkastavana luonnollisena yhdisteenä. Tämä tutkimus tutki systemaattisesti glabridiiniin yhdistettyjen PhG:iden synergististä hyperpigmentaatiota estävää suorituskykyä. Alustavassa massasuhteen seulonnassa käytettiin in vitro biokemiallisia määrityksiä, mukaan lukien tyrosinaasin esto-, DPPH- ja ABTS⁺-vapaaradikaaleja poistavat testit. Kolme solumallia rakennettiin edelleen: UVB-säteilytetty B16F10 hiiren melanoomasolupigmentaatiomalli; lipopolysakkaridi (LPS) stimuloitu HaCaT-keratinosyyttitulehdusmalli; AAPH:n aiheuttama HaCaT oksidatiivisen stressin malli. Indikaattorit, jotka kattavat solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden, melaniinipitoisuuden, tulehdusta edistävän sytokiinin vapautumisen (IL-6, TNF-), superoksididismutaasin (SOD) ja katalaasi (CAT) -entsyymiaktiivisuuden, määritettiin. Yhdistelmäindeksin (CI) laskenta käytettiin kvantitatiivisesti tunnistamaan synergistinen vuorovaikutus kahden kasvitieteellisen uutteen välillä.

Testattujen suhteiden joukossa massasuhteet m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 ja 10:1 osoittivat huomattavaa tyrosinaasia suppressoivaa ja antioksidanttista synergiaa. Kokonaispitoisuudella 0,4 g/l pH-arvossa 6,8 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) tyrosinaasin estoasteet saavuttivat 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) ja 88,06 % (10:1). Vastaavat DPPH:n radikaalinpoistoprosentit olivat 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %; ABTS⁺-kationiradikaaleja poistavat kapasiteetit saavutettiin 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. Työskentelypitoisuudella 25 ug/ml kaikilla kolmella yhdisteformulaatiolla ei ollut merkittävää sytotoksisuutta B16F10- ja HaCaT-solulinjoja kohtaan. 1:1 sekoitettu ryhmä tuotti ylivertaisen kokonaisvaltaisen tehokkuuden: jäljellä oleva intrasellulaarinen tyrosinaasiaktiivisuus laski 23,80 %:iin, suhteellinen melaniinipitoisuus laski 30,90 %:iin. Lisäksi PhGs/Gla (1:1) esti voimakkaimmin IL-6:n ja TNF-erityksen ja palautti maksimaalisesti SOD- ja CAT-antioksidanttientsyymiaktiivisuuden. Kokeelliset tulokset vahvistivat, että glabridiinin kanssa yhdistetyt PhG:t saavuttavat synergistisiä antihyperpigmentaatiotuloksia kolmella tavalla: estävät melaniinin biosynteesiä, vähentävät ihotulehdusta ja estävät oksidatiivista stressiä. 1:1-massasuhde tarjoaa optimaalisen integroidun biologisen suorituskyvyn. Tämä tutkimus tarjoaa kokeellista näyttöä, joka tukee soveltamistaCistanchefenyylietanoidiglykosidit-glabridiinikomposiittimateriaalit puhtaan kauneuden, kasviperäisten valkaisevien ihonhoitoraaka-aineiden kehittämisessä.

Avainsanat: Cistanche deserticolafenyylietanoidiglykosidit; glabridiini; synergistinen vaikutus; anti-hyperpigmentaatio; antioksidantti; tulehdusta estävä; kosmeettiset kasvitieteelliset raaka-aineet

1. Johdanto

Melaniinin liiallinen kertyminen orvaskeden kerroksiin johtaa heterogeenisiin ihon pigmentaatiofenotyyppeihin, kuten melasmiin, ephelideihin ja tulehdusten jälkeiseen hyperpigmentaatioon (PIH) Google for.... Useat ulkoiset ja sisäiset tekijät edistävät patologista melaniinin ylituotantoa. UVB ultraviolettisäteily on ensisijainen ympäristön laukaisin; ihovauriot ja krooniset paikalliset tulehdusvasteet vahvistavat edelleen pigmenttihäiriöitä. On vakiintunutta, että epidermaalisten keratinosyyttien ja melanosyyttien välinen ristipuhelu hallitsee pigmentin etenemistä. Ulkoisen stimulaation seurauksena aktivoidut keratinosyytit vapauttavat reaktiivisia happilajeja (ROS) ja tulehdusta edistäviä välittäjäaineita. Nämä signaalimolekyylit leviävät ja vaikuttavat vierekkäisiin melanosyytteihin, sääteleen tyrosinaasin katalyyttistä aktiivisuutta, kiihdyttäen melaniinin synteesiä ja edistäen melanosomin kuljetusta kohti keratinosyyttejä, mikä lopulta tuottaa näkyviä pigmentoituneita vaurioita ihon pinnalle. Näin ollen tehokas interventio hyperpigmentaatioon ei voi keskittyä pelkästään tyrosinaasin estämiseen. Multimodaalisten terapeuttisten strategioiden tulisi kattaa samanaikaisesti melanogeneesin estäminen, anti-inflammatoriset toimenpiteet ja oksidatiivisen stressin neutralointi.

Perinteiset synteettiset ihoa vaalentavat aineet, kuten hydrokinoni, tehostavat pigmenttiä pääasiassa suoralla tyrosinaasin suppressiolla. Siitä huolimatta yhden kohteen mekanismit rajoittavat käytännön suorituskykyä, ja pitkäaikainen paikallinen hydrokinonin käyttö voi aiheuttaa ihoärsytystä, kosketusihottumaa ja mahdollisia turvallisuusriskejä, mikä rajoittaa kosmeettisen tason käyttöä. Luonnolliset kasviperäiset bioainesosat herättävät kasvavaa kiinnostusta kosmeettisten formuloijien ja kuluttajien keskuudessa lievän profiilinsa ja monireittisten farmakologisten vaikutustensa vuoksi. Eri kasviuutteiden sekoitukset pystyvät tuottamaan synergistisiä biologisia vaikutuksia, parantaen yleistä tehokkuutta ja alentaen samalla tehokkaita annostusvaatimuksia, mikä avaa uusia teknisiä suuntauksia pigmenttiä estävälle kosmetiikka-raaka-ainetutkimukselleGoogle

Cistanche deserticola, yleisesti nimeltään "aavikon ginseng", on klassinen tonic yrtti perinteisessä kiinalaisessa lääketieteessä. Nykyaikaiset fytokemialliset tutkimukset osoittavat, että fenyylietanoidiglykosidit (PhG:t) muodostavat sen pääasiallisen farmakologisesti aktiivisen fraktion, jonka edustavina yhdisteinä on ekinakosidi ja akteosidi. Julkaistut farmakologiset tutkimukset osoittavat, että PhG:illä on vahva antioksidanttikapasiteetti, anti-inflammatorinen bioaktiivisuus ja kohtalainen tyrosinaasia estävä potentiaali, mikä viittaa tuleviin käyttömahdollisuuksiin dermatologisissa ihonhoitomateriaaleissa. Glabridiini on tyypillinen isoflavonoidiyhdiste, joka on eristettyGlycyrrhiza glabrajuur, joka tunnetaan kosmetiikkateollisuudessa "valkaisevana kultana". Se tukahduttaa tehokkaasti melanogeneesiä ja samalla moduloi ihon tulehduksellisia kaskadeja. Perinteisen lääketieteen teoreettisesta näkökulmastaCistancheravitsee munuaisesanssia ja tonisoi yangia, kun taas lakritsijuuret tonisoivat pernaa ja puhdistavat lämpömyrkkyä. Yhdistetty käyttö on yrttidermatologisten hoitojen yhdisteiden yhteensopivuuden periaatteiden mukainen.

Mekanistisen hypoteesin mukaan PhGs-glabridiiniyhdistelmä voi säädellä ihon pigmentaatiota monikohde- ja monitietilojen kautta: yhdessä estämällä tyrosinaasin katalyyttisen toiminnan melaniinin synnyn katkaisemiseksi; reaktiivisten happilajien kertymisen sammuttaminen; estää proinflammatorisen tekijän liiallista vapautumista keskeyttääkseen ROS- ja sytokiinivälitteisen signaalin vahvistuksen melanosyyttien aktivoimiseksi. Tähän mennessä harvat tutkimuspaperit ovat systemaattisesti raportoineet synergististä anti-hyperpigmentaatioarviointia tälle binääriseokselle.

Tässä artikkelissa pyritään tutkimaan yhdistelmäbiologisia vaikutuksiaCistanchefenyylietanoidiglykosidit ja glabridiini. Ensin suoritettiin biokemialliset in vitro entsyymien esto- ja radikaaleja poistavat seulontakokeet. Kolme edustavaa solumallia, jotka jäljittelevät pigmentin kertymistä, ihotulehdusta ja oksidatiivisia vaurioita, rakennettiin moniulotteisen tehokkuuden arviointia varten. Yhdistelmäindeksimetodologiaa sovellettiin synergian tai antagonismin vuorovaikutusten kvantifiointiin. Pyrimme määrittämään optimaalisen yhdisteen massasuhteen, selvittämään kolmoistilan toiminnallisia mekanismeja ja tarjoamaan kokeellista datatukea luonnollisten synergististen ihoa kirkastavien kosmeettisten raaka-aineiden kehittämiseen.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1 Reagenssit, solukannat ja laboratoriolaitteet

B16F10 hiiren melanoomasolulinja (STCC20013G-1) ostettiin Saierbio Co., Ltd:ltä. Immortalisoitu ihmisen epidermaalinen keratinosyytti HaCaT (iCell-h066) hankittiin yhtiöltä iCell Bioscience Inc.Cistanchefenyylietanoidiglykosideja (PhG) ja glabridiinia (Gla) toimitti kaupallisesti Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. Sienityrosinaasi, arbutiini, L-tyrosiini, L-DOPA, DPPH, ABTS-diammoniumsuola, L-askorbiinihappo, AAPH-vitamiini, L-SO1- ja muut AAPH-vitamiinit, analyyttiset kemialliset reagenssit hankittiin valtavirran biokemiallisten reagenssien toimittajilta. Soluviljelyn kulutustarvikkeita olivat korkeaglukoosipitoinen DMEM-elatusaine, sikiön naudan seerumi, penisilliini-streptomysiini-seosliuos. Ihmisen IL-6-, TNF--, CAT- ja total-SOD-tunnistussarjat hankittiin ELISA-määrityssarjat vastaavilta biotekniikan valmistajilta.

Tärkeimmät laboratoriolaitteet sisälsivät Multiskan FC:n täyden aallonpituuden mikrolevylukijan, Heracell 371 CO₂ -inkubaattorin (Thermo Fisher); KQ-200VDB ultraäänipuhdistin; vakiolämpötilainen vesihaude; DHG-9246A suihkukuivausuuni; KN4006B UVB-ultraviolettisäteilylaite, jonka säteilyteho on 8 mW/cm².

2.2 Näyteliuoksen valmistus

PhG:n ja glabridiinin kantaliuokset valmistettiin PBS-puskuriin, pH 6,8 tai 50 % (v/v) etanoli-vesi-liuottimeen, sarjalaimennettuna käyttökonsentraatioihin: 0,001 g/l, 0,005 g/l, 0,025 g/l, 0,1 g/l, 0,0,1 g/l, 0,04 g/l, 2,1 g/l. 1,6 g/l, 2,0 g/l. Yhdeksän yhdistelmäryhmää konfiguroitiin kiinteään kokonaismassapitoisuuteen 0,4 g/l vaihtelevilla massasuhteilla m(PhGs):m(Gla)=40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, Ph4Gs/Gla:ksi Ph4/Gsla:1Gla. (1:40).

Solukokeiden määrityksiä varten jauhenäytteet liuotettiin seerumittomaan DMEM-elatusaineeseen sarjan työskentelykonsentraatioliuosten valmistamiseksi.

2.3 Biokemialliset in vitro -määritykset

2.3.1 Tyrosinaasin estomääritys

50 µl näyteliuosta, 50 µl pH 6,8 PBS ja 50 µl 1 g/LL-tyrosiini-substraattiliuosta lisättiin peräkkäin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella mikrolevyllä. Esi-inkubointi eteni 37-asteisessa vesihauteessa 10 minuuttia. Sen jälkeen lisättiin 50 µl 0,4 g/l sienityrosinaasiliuosta (200 U/ml) ja inkubaatiota jatkettiin 37 asteessa 10 minuuttia. Arbutiini toimi positiivisena kontrolliaineena, nollakontrolli käytti pH 6,8 PBS-puskuria. Absorbanssiarvo mitattiin 490 nm:n aallonpituudella mikrolevylukijalla. Tyrosinaasin eston nopeuden laskentakaava:

Tyrosinaasin estoaste (%)={1 − [(A_reaktio − A_reaktio-kontrolli) / (A_blank - A_blank-control)]} × 100 %

Missä: A_reaktio: absorbanssia sisältävä näyte, substraatti, PBS ja tyrosinaasia; A_reaktiokontrolli: näytteen, substraatin ja PBS:n absorbanssi ilman entsyymiä; A_blank: substraatin, PBS:n ja tyrosinaasin absorbanssi; A_blank-control: absorbanssi vain substraatille ja PBS-puskurille.

2.3.2 DPPH:n vapaiden radikaalien poistamisen määritys

DPPH-jauhe liuotettiin vedettömään etanoliin 0,2 mmol/l DPPH-työnesteen valmistamiseksi. PhG:t, glabridiini ja C-vitamiinin vertailuaine liuotettiin 50-prosenttiseen etanoli-vesi-liuottimeen konsentraatiogradientin kantaliuoksien muodostamiseksi. Binääriseosnäytteet, joissa oli yhdeksän massasuhdetta, sekoitettiin tasaisesti. Jokainen kuoppa sai 100 µl näytenestettä plus 100 µl DPPH-työliuosta. Perusteellisen sekoittamisen jälkeen mikrolevyä pidettiin poissa valolta ympäristön lämpötilassa 30 minuutin ajan. Absorbanssilukema tallennettiin aallonpituudella λ = 517 nm. C-vitamiini toimi positiivisena kontrollina, jokainen koeryhmä toistettiin 3 biologista toistoa. DPPH-puhdistusnopeuden kaava:

DPPH-poistonopeus (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: näytteen absorbanssi + DPPH-työneste; A2: absorbanssi 50 % etanolia + DPPH-työnestettä; A3: 50 % etanoliliuottimeen sekoitettu näyteliuoksen absorbanssi.

2.3.3 ABTS⁺-kationiradikaalinpoistomääritys

7,4 mmol/l ABTS-varastoliuosta ja 2,6 mmol/l kaliumpersulfaattiliuosta sekoitettiin tasaisesti, inkuboitiin pimeässä ympäristössä 12 tuntia stabiilin ABTS+-työreagenssin tuottamiseksi. Näyteliuokset konfiguroitiin kohdassa 2.3.2. 40 kuvattujen protokollien mukaisesti. Mikrolevyn kuoppiin pipetoitiin µL näyteliuosta ja 160 µl ABTS⁺-työnestettä. 6 minuutin huoneenlämpötilassa valosuojatun inkuboinnin jälkeen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 734 nm. ABTS⁺ radikaalinpoistonopeuden kaava:

ABTS⁺-poistonopeus (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A1: näyteliuoksen ja ABTS+-työliuoksen absorbanssi; A2: ABTS+-työreagenssin kanssa sekoitettu deionisoidun veden absorbanssi; A₃: absorbanssiarvo näyteliuokselle, joka on sekoitettu puhtaan deionisoidun veden liuottimeen.

2.4 Soluviljelymenetelmät

B16F10-melanoomasoluja ja HaCaT-keratinosyyttejä viljeltiin korkeaglukoosisessa DMEM-elatusaineessa, jota oli täydennetty 10 %:lla naudansikiön seerumia ja 1 %:lla penisilliini-streptomysiiniä. Inkubaattorin parametrit: 37 astetta, 5 % tilavuusosa CO₂, suhteellinen kosteus 70 %. Solujen kulku ja väliaineen virkistys suoritettiin käänteisellä optisella mikroskoopilla havaitun solujen kasvutiheyden mukaan. Logaritmisessa kasvuvaiheessa olevat solut kerättiin myöhempää kylvöä varten 96-kuoppaisille viljelylevyille.

2.5 Kolmen solun toiminnallisen mallin luominen

2.5.1 UVB-indusoitu B16F10-pigmentaatiomalli

1 tunnin esikäsittelyn jälkeen vastaavalla näyteväliaineella solukerroksen pinta peitettiin PBS-puskurilla. UVB-säteilyn intensiteetiksi asetettiin 8 mW/cm², säteilytysetäisyys 3 cm, säteilytyksen kesto 110 s. Normaali ryhmä sai identtistä väliainetta ilman UVB-säteilyä. Mallikontrolliryhmä sai PBS-esikäsittelyn, jota seurasi yhtä suuri UVB-altistus ilman näytteen lisäystä.

2.5.2 LPS-välitteinen HaCaT-tulehdus-aktivointimalli

HaCaT-soluja esi-inkuboitiin testausnäytteen DMEM-alustan kanssa 24 tuntia. Myöhemmin lipopolysakkaridi-LPS-liuosta lisättiin, jotta saavutettiin lopullinen pitoisuus 20 ug/ml, ja yhteisviljely kesti vielä 24 tuntia. Malliryhmän solut altistettiin LPS:llä ilman näytteen esikäsittelyä. Normaali ryhmä säilytti tavanomaisen täysviljelyalustan viljelyn.

2.5.3 AAPH:n laukaisema HaCaT oksidatiivisen stressin malli

Soluja esi-inkuboitiin 24 tunnin ajan. AAPH-reagenssi lisättiin viljelyalustaan, lopullinen pitoisuus 25 mmol/L, jatkettiin 24 tunnin inkubointia. Mallikontrolliryhmää stimuloi AAPH ilman näytteen interventiota. Normaali kontrolliryhmä kasvoi normaalissa keskikunnossa.

Kaikki solumalliryhmät sisälsivät kolme teknistä rinnakkaiskuoppaa.

2.6 Sytotoksisuustesti (CCK-8-menetelmä)

Solususpensio säädettiin tiheyteen 1 x 104 solua/ml ja siirrostettiin 96-kuoppaisille mikrolevyille. Solujen kiinnittymisen jälkeen annettiin gradienttikonsentraationäyteväliainetta ja inkubaatiota jatkettiin 24 h, 48 h, 72 h. CCK-8-detektioreagenssi sekoitettuna tuoreeseen DMEM-elatusaineeseen (tilavuusosuus 10 %) korvasi vanhan alustan, inkubointia jatkettiin 60 minuuttia. Mikrolevylukija mittasi absorbanssin 450 nm aallonpituudella. Suhteellisen solujen elinkelpoisuuden prosenttiosuuden laskentakaava:

Solujen elinkelpoisuus (%)=[(A_näyte − A_tyhjä) / (A_0 − A_tyhjä)] × 100 %

A_sample: kuoppaa sisältävien solujen, CCK-8-reagenssin ja näytealustan absorbanssi; A_blank: absorbanssi viljelyalustalle plus CCK-8 ilman kylvettyjä soluja; A_0: solujen ja CCK-8-reagenssin absorbanssi, jota viljellään nollaelatusaineella (ei testinäytteitä).

2.7 Solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden kvantifiointi

48 tunnin mallin perustamiskäsittelyn jälkeen solusupernatantti heitettiin pois. Solujen yksikerros pestiin kahdesti pH:lla 7,4 PBS. 50 µl 1 % Triton X-100 lyysiliuosta lisättiin per kuoppa. Mikrolevy jäädytettiin -80 asteen jääkaapissa 30 minuuttia, sitten sulatettiin huoneenlämpötilassa solukalvon täydellisen repeämisen varmistamiseksi. Esilämmityshoito 37 asteessa kesti 5 min. L-DOPA-substraattia (10 mmol/L, 10 μL) lisättiin. Mikrolevyä inkuboitiin 1 tunti CO2-inkubaattorissa. Absorbanssi havaittiin 475 nm:ssä suhteellisen solunsisäisen tyrosinaasiaktiivisuuden laskemiseksi.

2.8 Solunsisäisen melaniinipitoisuuden mittaus

NaOH-pilkkomismenetelmä otettiin käyttöön melaniinipitoisuuden havaitsemiseen. 72 tunnin malliintervention jälkeen viljelmän supernatantti poistettiin, solut huuhdeltiin kahdesti PBS-puskurilla . 100 μL 1 mol/L NaOH vesiliuosta, joka sisälsi 10 % DMSO:ta. Mikrolevyä inkuboitiin 90-asteisessa uunissa 60 minuuttia melaniinin täydelliseksi liukenemiseksi. Absorbanssi luettiin aallonpituudella 490 nm suhteellisen melaniinipitoisuuden prosenttiosuuden laskemiseksi.

2.9 Tulehdustekijä- ja antioksidantti-entsyymi-indikaattorien havaitseminen

48 tunnin mallinkäsittelyn jälkeen HaCaT-solut kaavittiin ja kerättiin, sentrifugoitiin solusupernatantin keräämiseksi. Kaupallisia ELISA-pakkauksia käytettiin IL-6- ja TNF-proinflammatoristen sytokiinipitoisuuksien kvantitatiiviseen määritykseen. Antioksidantti-entsyymitestausta varten solupelleteille tehtiin toistuvia jäädytys-sulatussyklejä solujen fragmentoitumisen saavuttamiseksi. Sentrifugointiolosuhteet: 12 000 r/min, 4 astetta, 10 min. Supernatanttifraktio kerättiin SOD:n elinvoimaisuuden ja CAT-entsyymipitoisuuden määrittämiseksi pakkauksen toimintaohjeiden mukaisesti.

2.10 Yhdistelmäindeksi (CI) analyysi

Chou-Talalay-yhdistelmäindeksi (CI) -algoritmi toteutettiin arvioimaan PhG:iden ja glabridiinin synergististä/additiivista/antagonistista vuorovaikutusta tyrosinaasin esto- ja antioksidanttimäärityksissä:

CI=D₁/DX₁ + D2/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 edustaa antagonistista vuorovaikutusta; CI ≈ 1 tarkoittaa additiivista vaikutusta; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Tilastollinen analyysi

Kokeelliset mittaustulokset ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (keskiarvo ± SD). GraphPad Prism 9.5.0 -ohjelmisto suoritti tilastollisen laskennan. Monen ryhmän vertailussa käytettiin yksisuuntaista varianssianalyysiä (ANOVA). P-arvo< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Tulokset ja keskustelu

3.1 PhG-, glabridiini- ja binääriseosnäytteiden in vitro -tyrosinaasia estävä suorituskyky

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhGs.

PBS-yhdisteliuoksen kokonaispitoisuudella 0,4 g/l, PhGs/Gla (10:1), PhGs/Gla (5:1), PhGs/Gla (1:1) antoi tyrosinaasin estoasteen 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Sekä 5:1 että 1:1 suhteet ylittivät yksikomponenttisten PhG:iden (36,92 %) ja yksikomponenttisen glabridiinin (92,71 %) estotehokkuuden vastaavalla kokonaismassapitoisuudella. 1:1-ryhmä saavutti eston suuruuden, joka oli verrattavissa positiivisen kontrollin arbutiiniin. CI-arvon laskentatulosten mukaan: m(PhGs):m(Gla) välillä 40:1 - 1:1 generoitu CI< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, joka ilmentää antagonistista vuorovaikutusta.

Fenoliset hydroksyyliryhmät muodostavat tyrosinaasia estävän kapasiteetin toiminnallisen ydinosan. PhG:t sisältävät orto-dihydroksifenyylin rakennefragmentteja, jotka pystyvät kelatoimaan kupari-ioneja tyrosinaasin katalyyttisesti aktiivisessa taskussa, mikä estää kilpailevasti substraatti-entsyymien sitoutumista. Glabridiinin isoflavaanirunko sisältää B-renkaassa 2-OH- ja 4-OH-ryhmiä, jotka ovat rakenteellisesti analogisia L-tyrosiini-/L-DOPA-aromaattisen hydroksyylisubstituoidun renkaan kanssa, mikä mahdollistaa entsyymiaktiivisen kohdan domeenin kilpailevan miehityksen. Yhdisteen sekoittamisen jälkeen kumulatiivinen fenolihydroksyylimäärä nousee; sillä välin kaksi molekyyliä voi kiinnittyä tyrosinaasiproteiinin erillisiin sitoutumiskohtiin, mikä yhdessä vahvistaa estotehokkuutta.

3.2 Testinäytteiden radikaaleja poistava antioksidanttiaktiivisuus

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridiini. PhG-yhdisteitä on runsaasti kofeoyyliryhmän ja 3,4-dihydroksifenyylietanolin osissa, ja konjugoidut kaksoissidosjärjestelmät vahvistavat vapaita radikaaleja neutraloivaa suorituskykyä. Glabridiinin flavonoidikehys tarjoaa myös hydroksyyliryhmiä ja laajennettua konjugoitua rengasarkkitehtuuria reaktiivisten happilajien parittomia elektroneja stabiloimaan.

Kolme lupaavaa yhdisteryhmää PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) esitti erinomaiset DPPH- ja ABTS⁺-puhdistusominaisuudet. ABTS⁺-puhdistusaste saavutti lähes 100 %, mikä osoittaa kationien vapaat radikaalit lähes täydellisen eliminoitumisen. Erilaiset massasuhteet tuottavat erilaisia ​​molekyylien vuorovaikutustiloja kahden molekyylin välillä, mikä johtaa eroihin hydroksyyliryhmän altistumistilassa ja johtaa antioksidanttien synergistisen suuruuden eroihin.

3.3 PhG:iden, glabridiinin ja sekoitettujen valmisteiden sytotoksisuuden arviointi

CCK-8:n sytotoksisuustesti osoitti, että PhG:t pitoisuuksien alueella 62,5–500 ug/ml ja glabridiini 6,25–25 ug/ml eivät laukaisi selvää elinkelpoisuuden vähenemistä B16F10- ja HaCaT-solulinjoille. Alle 25 ug/ml kokonaismassapitoisuuden olosuhteissa kolme yhdiste-suhderyhmää PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) säilytti korkean solujen elinkelpoisuuden, eivätkä ne osoittaneet havaittavaa sytotoksista vaikutusta kumpaakaan solukantaa vastaan. Näin ollen 25 ug/ml valittiin turvalliseksi käyttöpitoisuudeksi myöhempää solutoiminnan arviointia varten. Yhden aineen ryhmille PhG:n pieni/keskimääräinen/korkea annos määriteltiin 125 ug/ml, 250 ug/ml, 500 ug/ml; glabridiini pieni/keskikokoinen/suuri annos: 6,25 ug/ml, 12,5 ug/ml, 25 ug/ml.

3.4 Vaikutus solunsisäiseen tyrosinaasiaktiivisuuteen ja melaniinipitoisuuteen UVB-stimuloiduissa B16F10-soluissa

UVB-säteilytyskäsittelyn jälkeen B16F10-malliryhmä osoitti tilastollisesti merkitsevää kasvua solunsisäisessä tyrosinaasiaktiivisuudessa ja melaniinin kertymisessä (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

Yhdistetyillä kokonaispitoisuuksilla 25 ug/ml yhdisteryhmät osoittivat parempia biologisia tuloksia kuin yksikomponenttiset vastineet. Kolmesta suhteesta PhGs/Gla (1:1) tuotti optimaalisen vaikutuksen: jäljellä oleva intrasellulaarinen tyrosinaasiaktiivisuus oli vain 23,80 %, suhteellinen melaniinipitoisuus laski 30,90 prosenttiin. Tilastollinen vertailu paljasti merkittävän eron verrattuna 5:1 ja 10:1 yhdisteryhmiin. 1:1-suhde osoitti huomattavaa synergististä monistumista melaniinin biosynteesin hillitsemiseksi melanosyyttisoluissa.

UVB-säteily saa aikaan melanosyyttien sisäisen melanogeenisen signalointikaskadin, säätelee MITF-transkriptiotekijän ilmentymistä ja indusoi edelleen tyrosinaasiproteiinin yli-ilmentymistä. Solututkimuksemme tulokset vahvistivat, että PhG:t yhdistettynä glabridiiniin voivat tehokkaasti kumota UVB-indusoidun tyrosinaasin aktivoitumisen ja vähentää melaniinin tuotantoa.

3.5 Anti-inflammatorinen vaikutus LPS-altistettuihin HaCaT-keratinosyytteihin

LPS-stimulaatio lisäsi voimakkaasti IL-6:n ja TNF-proinflammatorisen sytokiinin eritystä HaCaT-malliryhmässä (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhGs/Gla (10:1). 1:1-formulaatio vähensi maksimaalisesti IL-6:n ja TNF:n vapautumista, ylittäen PhG:n tai glabridiinin erillisellä levityksellä saavutetun estävän vaikutuksen.

Molekyylimekanismin selitys: PhG:n fenolihydroksyyliosa sieppaa tulehdusta laukaisevia vapaita radikaaleja; Lisäksi PhG:t voivat häiritä solunsisäisiä NF-KB- ja MAPK-signalointikaskadeja hillitäkseen tulehdusta edistävien geenien transkriptiota. Glabridiini estää stressiaktivoidun kinaasin JNK:n ja p38:n fosforylaatiota ja estää tulehdussignaalien transduktion. Yksittäinen aine voi vain osittain tukahduttaa tulehduksellisen signaalireitin aktivoitumisen. Binääriyhdistelmä vaikuttaa samanaikaisesti useisiin solmuihin tulehdussignaaliverkossa, jolloin saavutetaan synergistinen anti-inflammatorinen suorituskyky.

Ihotulehdus toimii kriittisenä alkuvirran aiheuttajana PIH:n esiintymiselle. Keratinosyyttien erittämät tulehdukselliset sytokiinit toimivat parakriinisina signaalin välittäjinä stimuloiden viereisiä melanosyyttejä kiihdyttäen melaniinin tuotantoa ja melanosomin siirtoa. Tehokas epidermaalisen tulehduksen lieventäminen on välttämätöntä hyperpigmentaatioleesioiden ehkäisemiseksi ja parantamiseksi. Siksi PhGs-glabridiiniyhdisteen anti-inflammatorinen etu antaa lisäarvoa pigmenttiä estävälle kosmeettiselle materiaalille.

3.6 Antioksidantti-entsyymejä säätelevä kyky AAPH:n aiheuttamassa oksidatiivisessa stressitilassa

AAPH:n oksidatiivisen stressin malliryhmä osoitti selvän solunsisäisen SOD:n ja CAT-antioksidantti-entsyymin elinvoimaisuuden laskun (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

Ultraviolettisäteilylle altistunut iho tuottaa suuria määriä reaktiivisia happilajeja. Ylimääräinen ROS ei ainoastaan ​​hapeta suoraan melaniinin synteesiin liittyviä biomolekyylejä, vaan myös aktivoi useita melanogeenisiä signalointireittejä. Endogeeninen antioksidantti-entsyymijärjestelmä (SOD, CAT) muodostaa tärkeän puolustusesteen solunsisäisen ROS:n eliminoimiseksi. Kun oksidatiivinen stressi ylittää luontaisen antioksidanttikapasiteetin, ROS-kertymä nopeuttaa pigmentaation etenemistä. PhGs-glabridiiniyhdiste ei ainoastaan ​​poista vapaita radikaaleja suoraan fenoli-hydroksyylikemiallisen reaktion kautta, vaan myös korjaa solujen antioksidantti-entsyymijärjestelmän toimintaa ja lievittää oksidatiivisen stressin aiheuttamia vaurioita kahdesta ulottuvuudesta. Erilaiset massasuhteet muuttavat molekyylien vuorovaikutuskuvioita kahden luonnollisen molekyylin välillä, mikä johtaa eroon lopullisessa antioksidantteja säätelevässä tehossa.

3.7 Kattava keskustelu synergistisen antihyperpigmentaation mekanismista

Ihon hyperpigmentaation patologinen prosessi muodostaa monimutkaisen signaaliverkoston: UVB-säteily vaikuttaa sekä melanosyytteihin että ympäröiviin keratinosyytteihin. Keratinosyytit vapauttavat ROS:ää ja tulehdusta edistäviä sytokiineja. Nämä biosignaalit aktivoivat edelleen melanosyyttejä, säätelevät tyrosinaasin aktiivisuutta, tehostavat melaniinin biosynteesiä ja helpottavat melanosomien kuljetusta kohti epidermaalisia keratinosyyttejä, mikä lopulta johtaa näkyvään pigmentin kertymiseen ihon pinnalle. Näin ollen yhden kohteen tyrosinaasin esto ei voi täysin kääntää patologista pigmentaatiota. Monireittiseen interventiostrategiaan tulisi integroida melanogeneesin esto, tulehduskipu ja antioksidanttisuoja.

Kokeet osoittivat, että PhG:t yhdistettynä glabridiiniin toteuttavat multimodaalista interventiota hyperpigmentaatiota vastaan:

Tukahduttaa suoraan tyrosinaasin katalyyttistä aktiivisuutta melanosyyttien sisällä melaniinin biosynteesin lähteen estämiseksi;

Estää tulehdusta edistävien sytokiinien liikaeritystä keratinosyyteistä ja katkaisee parakriinisen tulehdusstimulaatiosignaalin melanosyyttejä kohti;

Eliminoi ylimääräiset reaktiiviset happilajit ja palauta endogeeninen SOD/CAT-antioksidantti-entsyymiaktiivisuus, mikä vähentää oksidatiivisen stressin välittämää pigmentin monistumista.

Suhde m(PhGs):m(Gla) = 1:1 osoitti optimaalisen kokonaisvaltaisen synergistisen suorituskyvyn biokemiallisen entsyymien eston, radikaalien poistamisen, melanosyyttipigmenttimallin, keratinosyyttitulehdusmallin ja oksidatiivisen stressin mallin välillä. Tämä suhde ylitti ryhmiä 5:1 ja 10:1 lähes kaikissa testausindikaattoreissa. Synergia voi johtua toisiaan täydentävistä molekyylirakenteellisista ominaisuuksista: PhG:illä ja glabridiinilla on erilliset fenoli-luurankorungot, jotka ovat vuorovaikutuksessa eri kohdeproteiinien kanssa (tyrosinaasi, tulehdusta signaloivat kinaasit, antioksidantteihin ja entsyymeihin liittyvät reitit). Yhdisteiden sekoittamisen jälkeen fenoli-hydroksyylialtistuksen tila optimoidaan molekyylien välisen vuorovaikutuksen avulla, mikä parantaa yleistä biologista aktiivisuutta.

Kosmetiikkateollisuuden käytännön näkökulmasta synergistiset kasvitieteelliset yhdistelmäraaka-aineet tuovat kaksi suurta etua. Ensinnäkin synergistinen vaikutus mahdollistaa tarvittavan annoksen pienentämisen kullekin yksittäiselle aktiiviselle ainesosalle, mikä alentaa formulaatiokustannuksia; Toiseksi, monireittinen toiminnallinen profiili vastaa kliinisesti havaitun ihon hyperpigmentaation, kuten PIH:n ja melasman, monimutkaisia ​​patologisia mekanismeja, mikä tarjoaa teoreettisen perustan tehokkaiden luonnollisten ihoa kirkastavien kosmeettisten koostumusten kehittämiselle.

4. Johtopäätös

Tässä tutkimuksessa arvioitiin systemaattisesti ihon synergististä anti-hyperpigmentaatiota bioaktiivisuuttaCistanche deserticola -peräinenfenyylietanoidiglykosidit (PhG) yhdistettynä glabridiiniin (Gla). Biokemiallista in vitro -seulontaa ja kolmea edustavaa solumallia käytettiin moniulotteiseen tehokkuuden karakterisointiin. Tärkeimmät kokeelliset johtopäätökset on tiivistetty seuraavasti:

Tyrosinaasin estämisen ja vapaiden radikaalien poistamisen in vitro biokemiallisissa määrityksissä yhdisteformulaatioilla m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 oli suotuisa estokyky ja synergistinen vuorovaikutus. Kokonaispitoisuudessa 0,4 g/l pH 6,8 PBS:ssä tyrosinaasin estoaste saavutti 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). DPPH-radikaalinpoistonopeudet: 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺-radikaalinpoistonopeudet: 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

Turvallisella käyttöpitoisuudella 25 ug/ml PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM-liuokset eivät osoittaneet sytotoksisuutta B16F10-melanoomasoluja ja ihmisen HaCaT-keratinosyyttejä vastaan. Näistä ryhmistä PhGs/Gla (1:1) saavutti parhaan integroidun tehokkuuden: solunsisäinen tyrosinaasiaktiivisuus laski 23,80 prosenttiin ja melaniinipitoisuus 30,90 prosenttiin. Se aiheutti voimakkaimman IL-6:n, TNF-tulehduksellisten sytokiinien vapautumisen eston ja maksimaalisen palautumisen SOD:n ja CAT:n antioksidantti-entsyymien elinvoimalle. 1:1-massasuhderyhmällä oli ilmeinen synergistinen tehostusvaikutus, joka oli parempi kuin yhden aineen ryhmät ja muut yhdiste-suhderyhmät.

PhG:iden ja glabridiinin binääriseos vaikuttaa ihon hyperpigmentaatioon kolminkertaisesti: tukahduttaa melaniinin biosynteesiä, lievittää epidermaalista tulehdusta ja ehkäisee oksidatiivisen stressin aiheuttamia vaurioita. Optimaalinen synergistinen massasuhde m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Tämä tutkimus tarjoaa kokeellista näyttöä ja teknistä tukea luonnollisten kasviperäisten monikäyttöisten kosmeettisten raaka-aineiden kehittämiseen ihon kirkastamiseen ja pigmentin muodostumista ehkäiseviin sovelluksiin.

Kiitokset

Tätä työtä tuki taloudellisesti Kiinan kansallinen luonnontieteellinen säätiö (apuraha nro. 82160772). Kiitämme Xinjiang Key Laboratory of Clinical Drug Researchia kokeellisen alustan tuesta.

Viitteet

[1] Nautiyal A, Wairkar S. Hyperpigmentaation hallinta: Nykyiset hoidot ja kehitteillä olevat hoidot [J]. Pigment Cell & Melanoma Research, 2021, 34(6):1000-1014.

[2] Yardman-Frank J M, Fisher D E. Ihon pigmentaatio ja sen hallinta: ultraviolettisäteilystä kantasoluihin[J]. Experimental Dermatology, 2021, 30(4):560-571.

[3] Neagu N, Conforti C, Agozzino M, et ai. Melasman hoito: Systemaattinen katsaus[J]. Journal of Dermatological Treatment, 2022, 33(4):1816-1837.

[4] Hossain M R, Ansary T M, Komine M, et ai. Monipuoliset ärsykkeiden aiheuttamat tulehdusreitit aiheuttavat ihon pigmentaatiota [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(8):3970.

[5] Song X, Ni M T, Zhang Y, et ai. Epigallokatekiini-3-gallaatin ja gallokatekiinigallaatin tyrosinaasia estäviä kykyjä ja niiden yhteisvaikutuksia kojiinihapon kanssa vertaamalla [J]. Food Chemistry, 2021, 349(1):129172.

[6] Zolghadri S, Beygi M, Mohammad T F, et ai. Tyrosinaasin kohdistaminen hyperpigmentaatioon: nykytila, rajoitukset ja tulevaisuuden lupaukset [J]. Biochemical Pharmacology, 2023, 212:115574.

[7] Cicero A L, Delevoe C, Gilles-Marsens F, et al. Keratinosyyttien vapauttamat eksosomit moduloivat melanosyyttien pigmentaatiota [J]. Nature Communications, 2015, 6:7506.

[8] Serre C, Busuttil V, Botto J M. Ihmisen ihon melanogeneesin ja pigmentaation sisäinen ja ulkoinen säätely[J]. International Journal of Cosmetic Science, 2018, 40(4):328-347.

[9] Irfan M, Shafeeq A, Siddiqui U, et ai. Mekaaninen lähestymistapa raskasmetallien, hydrokinonin ja mikro-organismien toksisuuden ja riskin arvioimiseen kosmeettisissa voiteessa[J]. Journal of Hazardous Materials, 2022, 433:128806.

[10] Zheng Y, Du X S, Zhang L, et ai. Hydrokinonin aiheuttama ihoa ärsyttävä reaktio voidaan saavuttaa aktivoimalla syöttösoluja mas-sukuisen G-proteiiniin kytketyn reseptorin X2[J] kautta. Experimental Dermatology, 2023, 32(4):436-446.

[11] Meng H, Liu X K, Li J R, et ai. Bibliometrinen analyysi ginsengin vaikutuksista ihoon[J]. Journal of Cosmetic Dermatology, 2022, 21(1):99–107.

[12] Liu F, Qu L K, Li H, et ai. Luonnollisten valkaisuaineiden biolääketieteellisten toimintojen edistyminen ihon pigmenttisairauksien hoidossa[J]. Pharmaceutics, 2022, 14(11):2308.

[13] Wang T T, Zhang D, Wang Y J et ai. Synergistinen ihonhoito Lonicera japonica -polyfenoleilla ja Vaccinium vitis-idaea L:n etanoliuutteella.[J]. Fine Chemicals, 2023, 40(3):627-637.

[14] Wu Y, Liu Q, Tang W, et ai. Salvia miltiorrhiza -haihtuvan öljyn ja voikukkauutteen kompleksien käyttö kosmetiikassa[J]. Fine Chemicals, 2022, 39(3):562-568.

[15] Chen J R, Zhu X Y, Cui H Y, et ai. Cistanche deserticolan aktiivisten ainesosien ja antioksidanttiaktiivisuuden analyysi eri roduista ja osista Xinjiangin maakunnassa[J]. Elintarviketeollisuuden tiede ja teknologia, 2024, 45(21):227-233.

[16] Xiao L Y, Yao J, Miao Y Y, et ai. Cistanche tubulosasta eristetty tubulosidi B, lupaava aine M1-makrofagien aktivaatiota vastaan ​​kohdistettaessa synergistisesti Mob1:tä ja ERK1/2:ta [J]. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2022, 153:113414.

[17] Xu H H. Tutkimus Herba cistanchesin fenyylietanoidiglykosideista transdermaalisesti ja melaniinin synteesiä inhiboivista vaikutuksista ruskeassa marsussa B-indusoidussa pigmentaatiossa[D]. Urumqi: Xinjiang Medical University, 2020.

[18] Huang J, Xie C, Pan Z. Glabridiinin, resveratrolin ja poldatiinikompleksin synergistinen valkaisu, antioksidantti ja anti-inflammatorinen vaikutus [J]. Flavor Fragrance Cosmetics, 2024(3):99–107 233.

[19] Wang S Q, Zhu Y Z, Zheng X B. Chou-Talalay-menetelmän tutkimus ja soveltaminen kasvainlääkkeiden yhdistelmään [J]. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy, 2013, 30(4):449-453.

[20] Pillaiyar T, Manickam M, Namasivayam V. Ihon valkaisuaineet: tyrosinaasin estäjien lääkekemian näkökulma [J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry, 2017, 32(1):403-425